يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

8.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60122

⸱

أغسطس 8, 2019

 , 
1Institute of Physiological Chemistry and Pathobiochemistry, University of Münster, 2Instituto de Medicina Molecular, Lisbon

في هذه المقالة

ملخص

الهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج 3D في المختبر لدراسة التمايز بين الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) في بيئة تشبه الورم السائبة، والتي يمكن معالجتها في أنظمة التحليل المختلفة، مثل الفلورة المناعية، النسخ التحليل وتصوير خلايا الحياة.

الملخص

تحديد النموذج المثالي لدراسة في المختبر أمر ضروري، أساسا إذا دراسة العمليات الفسيولوجية مثل تمايز الخلايا. في ستروما الورم ، يتم تحفيز الخلايا الليفية المضيفة بواسطة الخلايا السرطانية للتمييز. وهكذا، فإنها تكتسب النمط الظاهري الذي يساهم في البيئة الدقيقة الورم ويدعم تطور الورم. باستخدام نموذج spheroid، قمنا بإعداد مثل هذا النظام نموذج 3D في المختبر، الذي قمنا بتحليل دور لامينين-332 ومستقبلات integrin α3β1 في هذه العملية التمايز. هذا النظام نموذج spheroid ليس فقط يستنسخ ظروف البيئة الدقيقة الورم بطريقة أكثر دقة، ولكن أيضا هو نموذج تنوعا جدا لأنه يسمح دراسات المصب مختلفة، مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي من داخل وخارج الخلية على حد سواء علامات، فضلا عن البروتينات مصفوفة خارج الخلية المودعة. وعلاوة على ذلك، يمكن دراسة التحليلات النسخية التي أجراها qPCR، وقياس التدفق الخلوي والغزو الخلوي مع هذا النموذج. هنا، ونحن نصف بروتوكول من نموذج spheroid لتقييم دور integrin CAFs 'α3β1 والرباط المودعة بشكل ectopically، لامينين-332، في التمايز وفي دعم غزو خلايا سرطان البنكرياس.

المقدمة

البيئة الدقيقة الورم هو محراب معقدة جدا ومهمة للغاية للحفاظ على وتطور الخلايا السرطانية1. يتم تشكيلها ليس فقط من الخلايا السرطانية ولكن أيضا من قبل الخلايا الليفية سترومال. وتحيط الخلايا السرطانية من قبل ستروما التي هي محددة ومختلفة عن ستروما من الأنسجة العادية2. Laminin-332 هو بروتين مصفوفة خارج الخلية أعرب عنها في ستروما من الأورام المختلفة، مثل سرطان الغدة الدرقية البنكرياس3. وعلاوة على ذلك، فإن التركيب البيوكيميائي لـ ECM وخصائصه البيوفيزيائية، مثل التصلب والتوتر، تتغير داخل الجزء الأكبر من الورم4. هذا الورم ستروما، أو "ستروما رد الفعل"، هو سبب التكيف من الخلايا الليفية إلى الخلايا السرطانية المجاورة وعن طريق تجنيد لاعبين آخرين مهمين جدا أن تطوير بيئة مواتية وداعمة لتقدم الورم. يؤدي تمايز الخلايا الليفية السترومالية إلى الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAF). ويمكن تحديد هذه الخلايا باستخدام علامات مختلفة مثل α-الأكتين العضلات الملساء (αSMA)5 أو مستضد العصبية / glial 2 (NG2)6.

من الصعب تحديد النموذج الأكثر ملاءمة في المختبر لتلخيص البيئة الدقيقة للورم (TME) مع CAFs. ويجب النظر في طريقة محاكاة البارامترات الفسيولوجية للآلية بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للاستنساخ من أجل نظام نموذجي من هذا القبيل. وفي إطار هذه القطاعات، تحدث عمليات مختلفة، مثل الانتشار والتمايز والهجرة وغزو أنواع الخلايا المختلفة. ويمكن تنفيذ هذه العمليات الخلوية بشكل فردي بطرق مختلفة. ومع ذلك، يجب أن تنظر الظروف التجريبية في التفاعلات الخلوية مع الورم ستروما ECM، لأن صلابة الطبقة التحتية تؤثر على عملية التمايز CAF. R.G. ويلز علقت على تأثير تصلب المصفوفة على سلوك الخلية وأبرز أن التنظيم الخلوي الهيكلي وحالة التمايز لوحظ في الخلايا المستزرعة في المختبر قد تكون artefactual7. ويبدو أن المحفزات المختلفة تشارك في التمايز CAF، بما في ذلك التوتر الميكانيكي5،7. لتجنب هذا، يمكن أن تكون ركائز لينة 2D النهج الممكنة لدراسات التمايز، لأنها تتحايل على مشكلة البلاستيك طبق ثقافة قاسية. سطح 2D لينة، والتي يمكن أن تزرع الخلايا الليفية، يمكن أن يكون الكولاجين-I المغلفة هلام بولياكريلاميد، حيث يمكن التلاعب صلابة هلام من قبل تركيز polyacrylamide وهلام عبر linker. يتم تعزيز التصاق وتشكيل ألياف الإجهاد الغنية αSMA في الخلايا الليفية جنبا إلى جنب مع صلابة هلام8. وتؤكد هذه النتائج على أهمية السقالات الركيزة لينة لمزيد من النماذج الفسيولوجية في المختبر التمايز. ومع ذلك، في أيدينا كان استنساخ التجريبية والتصوير من هذه المواد الهلامية تحديا. للتغلب على أوجه القصور هذه، قمنا بتغيير نظام الركيزة الناعمة 2D لنموذج spheroid 3D لدراسات التمايز والغزو. هذا النموذج هو أكثر أهمية سريريا، وعلى غرار الجهازية في المختبر، يلخص في تفاعلات الخلايا الحية، إنتاج ECM والترسيب، فضلا عن سلوك الخلية9.

تتشكل النضدة عندما تفتقر الخلايا إلى الركيزة للتقيد بها. عندما تترك الخلايا دون سطح لاصق، فإنها تتجمع لتشكيل بنية كروية أكثر أو أقل. إذا كانت الـ spheroids تتكون من نوع واحد من الخلايا، فهي تسمى homospheroids. إذا كانت تتألف من نوعين أو أكثر من أنواع الخلايا المختلفة التي تشكل heterospheroids.

من بين الطرق المختلفة لإعداد spheroid، ونحن تنفيذ البروتوكول باستخدام غير الملتصقة جولة أسفل 96-جيدا لوحات. وهو فعال جدا فيما يتعلق بالتكاليف. هنا، ونحن ننتج كل من homospheroids من الخلايا الليفية، CAF أو CAFs تفتقر إلى integrin α3 الوحدة الفرعية لدراسة عملية التمايز وheterospheroids من CAFs أو integrin α3 KO CAFs وخلايا سرطان القناة البنكرياسية (AsPC-I وPANC-I) لدراسة الغزو في المصفوفة المحيطة.

وكان الهدف من هذه الدراسات هو استخدام الـ CAFs الأولية المعزولة عن الخزعات السرطانية البنكرياسية البشرية. ومع ذلك، فإن الخزعات للحصول على الخلايا نادرة ولهذا السبب، تم خلد CAFs المستخدمة في هذه الدراسات باستخدام فيروس العدس الذي يحتوي على HTERT. وتسمى iCAFs، ونظيراتها العادية، الخلايا الليفية البنكرياس البشرية الأولية، وتسمى iNFs. تتوفر الخلايا الليفية البنكرياسية البشرية وخلايا سرطان القناة البنكرياسية، AsPC-I وPANC-I، تجارياً.

تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة تأثير التفاعل اللامينين-332-integrin في عملية التمايز CAF. لإثبات خصوصية هذا التفاعل ووظيفته، تم استخدام مركبات مثبطة: BM2، وهو جسم مضاد أحادي النسيلة يمنع موقع الربط integrin سلسلة اللامينين-332 α310،أو lebein 1، وهو مركب مشتق من سم الأفعى الذي يمنع لامينين ملزمة integrins α3β1، α6β1 وα7β111،12.

وبالنسبة لـ "فحص الغزو"، تم نقل الخلايا باستخدام فيروس اللينالذي يحتوي على ترميز الحمض النووي (iCAFs) (iCAFs وintegrin α3 KO iCAFs) أو GFP (AsPC-I وPANC-I) للتمييز بين أنواع الخلايا المختلفة في الهيتروسفيرويدات. يتم وصف تحويل الخلايا لتخليدها و / أو لتسميتها ببروتين الفلورسنت (mCherry و GFP) التعبير في دراسة سابقة13، التي ينبغي استشارتها للحصول على مزيد من المعلومات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. 3D spheroids كنموذج في المختبر للورم الليفي / CAF التمايز باستخدام مختلف TGF-β1 مركبات تثبيط التفاعل مصفوفة الخلية

  1. مزيج 1 جزء من 6 ملغ / مل ميثيل سيلولوز الحل و 3 أجزاء من وسائل الإعلام ثقافة الخلية، MEM تستكمل مع 1٪ من المصل البقري الجنين المعطلة الحرارة (FBS) و 1٪ البنسلين / العقديات للحصول على حل تشكيل spheroid.
  2. إعادة تعليق الخلايا الليفية الطبيعية الخالدة المذوّبة حديثاً (iNFs)، أو CAF الخالدة (iCAFs) أو integrin α3β1 KO iCAF (مرور يصل إلى 25) في محلول تشكيل السفيرويد. إذا إعداد لوحة واحدة 96 جيدا، وإعداد فائض من حل تشكيل spheroid، 10 مل وإضافة 75،000 خلية، مع الأخذ في الاعتبار أن كل spheroid يتكون من 750 خلية، وأن يتم توزيع 100 ميكرولتر في كل بئر من لوحة.
  3. إذا تم تضمين السيتوكينات أو مثبطات integrin في الدراسة، إضافة هذه المركبات إلى تعليق الخلية، من أجل تضمينها في spheroids أثناء تشكيلها. لاحظ أن يتم تحفيز iNFs مع 10 نانوغرام/مل من TGF-β1 من أجل إثارة التمايز. عند الاقتضاء، إضافة مركبات مثبطة جنبا إلى جنب مع TGF-β1، مثل 20 ميكروغرام / مل BM2 أو 10 ميكروغرام / مل من lebein 1.
  4. إعداد homospheroids CAF بنفس الطريقة ولكن من دون التحفيز TGF-β1، لأنها تختلف بالفعل. إعداد integrin α3 KO CAF homospheroids دون إضافة أي مركب.
  5. توزيع حل تشكيل spheroid على أسفل جولة 96 لوحة متعددة جيدا عن طريق إضافة 100 درجة مئوية من الحل في كل بئر. في كل مرة يتم توزيع محلول spheroid في الآبار، ومزيج جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، عدة مرات.
  6. وضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة للسماح واحد spheroid أن تكون تشكلت في كل بئر.
  7. جمع spheroids بعد حوالي 24 ساعة واستخدامها لأغراض مختلفة المصب: تلطيخ الفلورسنت المناعي، في الوقت الحقيقي (RT) q-PCR والقياس الخلوي التدفق. للكشف عن التعبير عن المستضدات داخل وخارج الخلية، بما في ذلك ترسب بروتينات ECM داخل السفيرويد، استخدم تلطيخ الفلورسنت المناعي. بعد تفكك النفيرويدات في خلايا واحدة ، قم بكمية المستقبلات المثبتة على الغشاء عن طريق قياس التدفق. للكشف عن تنشيط الجينات والتغييرات النسخي، استخدم RT q-PCR من mRNA معزولة عن الخلايا النضوية.

2. تلطيخ الفلورسنت المناعي من spheroids

  1. جمع spheroids بعد حوالي 24 ساعة في أنبوب واحد 1.5 مل رد فعل لكل حالة تجريبية أو لكل بروتين لتحليلها. على سبيل المثال، ضع spheroids من iNFs حفز مع TGF-β1 في أنبوب مختلف عن iNFs التحكم، والتي لم يتم علاجها. لتجنب تمزق الـ spheroids بسبب قوى القص القوية جداً، اقطع نهاية طرف الماصة لتكبير فتحة الكوة. وتشمل ما لا يقل عن 5-10 spheroids في أنبوب رد فعل واحد، للسماح تكرار وتأخذ في الاعتبار الخسائر المحتملة أثناء خطوات الغسيل.
  2. الطرد المركزي spheroids مع جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء لحوالي 30-60 s في 1000 × ز. قم بإزالة الـ supernatant الذي يحتوي على ميثيل سيلولوز بعناية عن طريق الأنابيب، دون إزعاج الـ spheroids الكريات.
  3. غسل مع 50 درجة مئوية من 1X PBS. كرر خطوة الطرد المركزي وإزالة بعناية PBS عن طريق الأنابيب، كما هو موضح في 2.2.
  4. اعتمادا على البروتين أن تكون ملطخة، وإصلاح مع 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (لαSMA، NG2 وintegrin α3β1) أو مع 50 ميكرولتر من الميثانول لمدة 10 دقيقة في -20 درجة مئوية (للوحدات الفرعية لامينين-332).
  5. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3.
  6. Permeabilize الخلايا مع 0.1٪ تريتون-X في PBS لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3 ثلاث مرات.
  8. احتضان spheroids في PBS تحتوي على 5٪ FBS و 2٪ BSA، لمدة 1 ساعة في RT لمنع مواقع التفاعل البروتين غير محددة.
  9. حضانة spheroids مع 30 درجة مئوية من الأجسام المضادة الأولية في PBS، 2.5٪ FBS و 1٪ BSA في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. واستُخدمت الأجسام المضادة الأولية التالية: المضادة للαSMA Cy-3 المترافقة والمضادة للنانو جي إن 2 عند 5 ميكروغرام/مل؛ BM2 المضادة لللامينين α3، 6F12 المضادة لللامينين β3 ومكافحة لامينين γ 22 ميكروغرام / مل.
  10. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3 ثلاث مرات.
  11. حضانة spheroids مع 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في PBS، 2.5٪ FBS و 1٪ BSA في RT لمدة 90 دقيقة. وكانت الأجسام المضادة الثانوية التالية المستخدمة: اليكسا 488 المضادة للأرنب والمضادة للماوس (5 ميكروغرام / مل).
  12. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3 ثلاث مرات.
  13. احتضان الخلايا مع 30 درجة مئوية من DAPI تلطيخ الحل لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  14. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 2.2-2.3.
  15. وضع spheroids على شريحة زجاجية، في قطرة من PBS، وذلك باستخدام أنبوب باستور الزجاج.
  16. صورة spheroids عن طريق المجهر الفلوري في مجهر المسح الضوئي بالليزر باستخدام التكبير من 10X. تأخذ مختلف المقطع العرضي البصري من spheroid في طائرات بصرية مختلفة من كومة z (15-20 طائرات المكدس). لإنشاء إعدادات الليزر في المجهر، استخدم spheroid تتكون من خلايا سلبية لمستضد الفائدة أو spheroid ملطخة فقط مع الأجسام المضادة الثانوية. إعادة استخدام نفس الإعدادات لكافة العينات التي سيتم مقارنتها.
  17. تحليل الصور المجهرية مع برنامج ImageJ كما نشرت سابقا14. ويرد موجز للخطوات في الشكل التكميلي1. كخلفية، حدد كثافة الإشارة المتكاملة لمنطقة الاهتمام الخالية من الخلايا (ROI). حساب إجمالي الفلورة الخلية المصوبة (TCCF) على النحو:
    figure-protocol-1
  18. تحديد الفلورة المصححة الإجمالية (TCF) من spheroids كما TCCF تطبيع إلى منطقة spheroid وعدد المداخن.
    figure-protocol-2

3. RT q-PCR من homospheroids

  1. لإجراء RT-qPCR، جمع ما لا يقل عن 288 spheroids (المقابلة لثلاث لوحات 96 جيدا) في أنبوب رد فعل 50 مل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 × ز وإزالة بعناية supernatant التي تحتوي على ميثيل سيلولوز عن طريق الأنابيب دون إزعاج spheroids بيليت.
  2. غسل مع 1 مل من 1X PBS ونقل spheroids إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. الطرد المركزي spheroids مع جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء لحوالي 30-60 s في 1000 × ز. إزالة بعناية PBS عن طريق الأنابيب، دون إزعاج spheroids بيليت.
  3. فصل الspheroids مع 250 ميكرولتر من 4 ملغ / مل كولاجيناز B، 50 ميكروغرام / مل DNase الأول، 2٪ BSA، 1 M CaCl2 في PBS في 37 درجة مئوية لحوالي 30-45 دقيقة عن طريق الدوامة بلطف والنابض بشكل متقطع لبضع ثوان كل 5 دقائق.
  4. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 3.2.
  5. عزل الجيش الملكي النيبالي الكلي من خلايا spheroids المفككة باستخدام مجموعة عزل RNA التجارية، وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
  6. عكس نسخ mRNA معزولة في cDNA مع مجموعة تجارية، وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
  7. قياس مستويات النسخ في تكرار من قبل PCR في الوقت الحقيقي. وكانت التمهيديات المستخدمة: α-SMA: مهاجم 5′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3′, Rev 5′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-15; لامين ين α3 سلسلة: مهاجم 5′-GCTCAGCTGTGTGTGTGTGA-3′, Rev 5′-TGTCTGCATGCCAATAGC-3′16; لامينين β3 سلسلة: مهاجم 5′-GGCAGATGATTGCAGCCGAGGAA-3′ Rev 5′-CGGACCTGCTGGATTAGCCGT-3′17; لامينين γ2 سلسلة: مهاجم 5′-غاتغكاتكاتكجاكجاجاغ-3′ ريف 5′-تكغاجاكتاكاغاغااجاكتج-3′ 16; NG2: مهاجم 5′-CTGCAGGTGTGTGTGTGT-3′ ريف 5′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3′18; integrin α3 subunit: Fw 5'-AGGGGACCTTGTGTA-3' Rev 5'-TGTAGCCGGTGTTACCATCAT-3'19; TOP-1: مهاجم 5′-CCAGACGAAGCTCGGAAC-3′ Rev 5′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3′20.
  8. تصحيح قيم Ct للقيمة Ct لجين مرجعي داخلي مثل TOP-1 باستخدام المعادلة: 2- ΔΔCt. ΔΔCt = ΔCt (العينة المستهدفة) - ΔCt (العينة المرجعية) و ΔCt = Ct من الجينات المستهدفة أو الجينات المرجعية - TOP-I.

4. تحليل قياس التدفق للعبارة integrin

  1. لتحليل مقياس التدفق، جمع ما لا يقل عن 288 spheroids (المقابلة لثلاث لوحات 96 جيدا) في أنبوب رد فعل 50 مل. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 × ز وإزالة بعناية supernatant التي تحتوي على ميثيل سيلولوز عن طريق الأنابيب.
  2. غسل مع 1 مل من 1X PBS ونقل spheroids إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. كرر خطوة الطرد المركزي وإزالة بعناية PBS عن طريق الأنابيب.
  3. فصل spheroids كما هو موضح في الخطوة 3.3.
  4. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 4.2.
  5. لمنع مواقع الربط غير المحددة ومنع ربط الأجسام المضادة ذات الصلة بالكشف بمستقبلات Fcγ (CD16 وCD32 وCD64)، تحضن الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على مصل حصان بنسبة 2% (أو مصل من نوع حيواني آخر، لن تكون الأجسام المضادة له المستخدمة في التجربة) و 0.1٪ BSA لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية مع دوران.
  6. في حالة تلطيخ العلامات داخل الخلايا، قم بإصلاح/نفاذية الخلايا كما هو موضح تحت الخطوة 2.2-2.5.
  7. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية في 100 درجة مئوية من PBS تحتوي على 2٪ مصل الحصان و 0.1٪ BSA لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية مع دوران. تمييع الأجسام المضادة الأولية إلى 10 ميكروغرام/مل.
  8. اغسل مع 100 ميكرولتر من PBS + 0.1٪ BSA ثلاث مرات، مع خطوات الطرد المركزي في الطرد المركزي مقاعد البدلاء العلوي في 1000 × ز في ما بين.
  9. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية في 100 درجة مئوية من PBS تحتوي على 2٪ مصل الحصان و 0.1٪ BSA لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية مع دوران. تمييع الأجسام المضادة الثانوية إلى 10 ميكروغرام / مل.
  10. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوة 4.7.
  11. تحليل 2.0 × 104 الخلايا الملونة في مقياس التدفق. بوابة للخلايا الحية واحدة عن طريق مؤامرة نقطة FSC-SSC وتحليل الفلورة من الخلايا المسورة على القناة المناسبة للفلوروفور المحدد.

5. غزو ة يَسَمَيَكُونُ مِنَقَة

  1. إعداد حل تشكيل spheroid للheterospheroids، التي تحتوي على أنواع الخلايا المختلفة والوسائط المقابلة، على النحو الموجز في الجدول1. وكانت الخلايا قد تم نقلها سابقا مع فيروس لينتي التي تحتوي على ناقلات للتعبير إما mCherry أو GFP.
  2. ملء 100 درجة مئوية من حل تشكيل spheroid في كل بئر من لوحة واحتضان لوحة في حاضنة ثقافة الخلية لمدة 24 ساعة للسماح واحد spheroid أن تكون تشكلت في كل بئر.
  3. إعداد 60 ميكرولتر من خليط مصفوفة الجيلاتين التي تحتوي على 2 ملغ / مل من الكولاجين الذيل الفئران الأول، 30٪ من مصفوفة هلام التجارية و 2.5 ميكروغرام / مل من اللامينين-332 في أنبوب رد فعل 1.5 مل. توزيع بسرعة 15 درجة مئوية في 3 آبار من غرفة تكوين الأوعية الدموية . تضمين spheroid واحد في كل بئر بالفعل تحتوي على هلام.
  4. إذا لزم الأمر، ضبط بسرعة موقع spheroid إلى وسط البئر مع ماصة تحت المجهر.
  5. كرر الخطوات 5.2-5.3 للهيتيروسفيرويدات التالية وكرر مرة أخرى للهوموسفيرويدات.
  6. احتضان المواد الهلامية في الحاضنة لمدة 1 ساعة لتقوية، وبعد ذلك، تراكب بلطف المواد الهلامية مع خلية الثقافة المتوسطة.
  7. صورة spheroids عن طريق المجهر الفلوري في مجهر المسح الضوئي بالليزر. تأخذ مختلف المقطع العرضي البصري من spheroid في طائرات بصرية مختلفة من كومة z وفي نقاط زمنية مختلفة من الغزو (على سبيل المثال، 0 ساعة، 24 ساعة، 48 ح و 72 ساعة).
  8. تحليل الصور عن طريق حساب عدد الخلايا السرطانية الغازية. الخلايا الغازية هي تلك التي تركت السفيرويد ودخلت المنطقة الغازية. تُعرَّف المنطقة الغازية بأنها منطقة الحلقة بين المحيطين الخارجي والداخلي التي تعطيها الخلية الأبعد التي تم غزوها والحدود الأبعد للسبريويد في بداية تجارب الغزو، على التوالي، على النحو المبين في الشكل التكميلي 2 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وتنشر نتائج هذا التصميم التجريبي في مارتينز كافاكو وآخرون13، وهو أمر يوصى بمزيد من القراءة للاستنتاجات التي تم استخلاصها من هذه التجارب.

الشكل 1، صورة تمثيلية لspheroid الفلورسنت المناعي ، ويبين التلطيخ المناعي للوحدة الفرعية α3 integrin لكل من الخلايا الليفية الطبيعية الخالدة وCAFs الخالدة (الشكل1A)،فضلا عن الفلورة المناعية القياس الكمي (الشكل

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تطوير نموذج مناسب في المختبر لدراسة التمايز CAF مهمة صعبة. بعد استخدام نهج مختلفة، خلصنا إلى أن نموذج spheroid 3D هو النموذج الأكثر عملية، الفسيولوجية والسريرية ذات الصلة، والتي يمكن دراسة التفاعل بين خلايا سرطان البنكرياس مع CAFs خالدة. منع هذا النموذج التمايز التلقائي للخلايا الليفية، وذلك بسبب الضغوط الواقعية مثل صلابة البلاستيك ثقافة الخلية، على الأقل في ظروف الثقافة على المدى القصير (تصل إلى 48 ساعة). على الرغم من أن صلابة الدقيق من spheroid المستخدمة في هذه الدراسات لم يتم قياسها، Ito وآخرون تقييم صلابة الخلايا الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح. ولا تعكس هذه المادة سوى آراء صاحب البلاغ، والاتحاد الأوروبي غير مسؤول عن أي استخدام قد يستخدم المعلومات الواردة فيه.

شكر وتقدير

نحن نعترف بمساعدة باربرا شيدينج في إعداد BM2 وlebein-1. نحن نعترف بـ (أجينس نويل) لتقاسم خبرتها في التجارب نشكر سونيا شيلهاس ومايكل شيفرز على مساعدتهما في التعامل مع التغوط في المعمرة في ظل ظروف S2. نحن نعترف بإصرار سابين فون ردين في إعداد الـ CAFs من أنسجة سرطان البنكرياس.

وقد تلقى البحث الذي أدى إلى هذه النتائج تمويلا من برنامج الشعب (إجراءات ماري كوري) من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي FP7/2007-2013/ بموجب اتفاق منحة REA n... (316610) إلى J.A.E. وعلاوة على ذلك، تلقى كل من شركة J.A.E. وA.C.M.C. دعماً مالياً من قبل وزارة المالية الألمانية في إطار مجموعة الامتياز للخلايا المتحركة (EXC 1003-CiM). كما تم دعم هذا المشروع من قبل فيلهلم ساندر ستيفتونغ (منحة: 2016.113.1 إلى J.A.E.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, ثنائي هيدروكلوريد (DAPI)SIGMA-ALDRICHD9542-10
6F12 مضاد لللامينين & بيتا; 3 وحدات فرعية ماوس (أحادي النسيلة)محلية الصنع
A3IIF5 مضاد لألفا ؛ 3 وحدة فرعية من الإنتجرين (أحادي النسيلة)يرجى تقديم البروفيسور إم هيملر ، معهد دانا فابر للسرطان ، بوسطن
أسيتونSIGMA-ALDRICH32201
جزء الألبومين الخامس - BSAAppliChemA1391
Alexa fluor 488 الماعز (متعدد النسيلة) المضاد للفأرInvitrogenA11029
Alexa fluor 488 Goat (متعدد النسيلة) RabbitInvitrogenA11034
المضادة لللامينين غاما. 2 وحدة فرعية ماوس (أحادي النسيلة)سانتا كروزsc-28330
أنتاب مضادة ل NG2 (متعدد النسيلة) ميليبور ، AB5320MilliporeAB5320
ماوس مضاد لألفا SMA-Cy3 (أحادي النسيلة)SIGMA-ALDRICHC6198
AsPC-1 خط خليةATCCتفضل بتقديمه من قبل البروفيسور جورج هاير
مقعد الطرد المركزيفيشر العلمي50-589-620Sprout
BM2 مضاد لللامينين & ألفا ؛ 3 وحدات فرعية ماوس (أحادي النسيلة)يرجى تقديم البروفيسور باتريشيا روسيل ، CNRS ، كلوريد الكالسيوم ليون
(CaCl 2< / sub>) Fluka21074
أجهزة الطرد المركزيالحرارية العلميةمتعددة الطرد 1S-R
أنابيب الطرد المركزي 50 ملCorning430290
Collagenase BRoche11088831001
الكولاجين الأول ، ذيل الفئرانGibcoA10483-01
مجهر متحد البؤرZeissLSM 700 و 800
DMEM (ارتفاع الجلوكوز 4.5 جم / لتر)LonzaBE12-604F
Dnase IRoche10104159001
مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesFACSCaliburTM
مصفوفة التبلورThermoFisher ScientificA1413202Matrigel ، Geltrex
Goat IgG ، النمط المتماثلDAKOX 0907
مصل الحصانSIGMA-ALDRICH12449-C
الليفية البنكرياسية الأوليةالبشرية PELOBiotechPB-H-6201
حاضنةHeraeusB6060
Laminin-332BiolaminaLN332
MEMSIGMA-ALDRICHM4655
Microplate ، 96 بئرا ، U-bottomGreiner Bio-One650101
Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Mouse IgG ، النمط المتماثلSIGMA-ALDRICHI8765
خلاط دوار متعدد المحاورCATRM5 80V
PANC-IATCCتفضل بتقديمه من قبل البروفيسور جورج مختبر هاير
ParaformaldehydeRiedel-de Haë n16005
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140-122
طقم النسخ العكسي QuantiTectQiagen205310
Rat IgG ، أنبوب تفاعل النمط المتماثلInvitrogen10700
، 1.5 ملGreiner Bio-One616201
Real-time PCR cyclerQiagenRotor-Gene Q
RNeasy Mini KitQiagen74104
Rotor Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074
RPMILonzaBE12-702Fأضف الجلوكوز إلى 4.5 جم (مرشح 0.2 ميكرومتر) و 1٪ بيروفات الصوديوم
TritonX-100SIGMA-ALDRICHX100RS
V & oacute ؛ rtexScientific IndustriesVortex-Genie 2
& -Slide Angiogenesis ، غير مطليIbidi81501
الخلايا

المراجع

  1. Pietilä, M., Ivaska, J., Mani, S. A. Whom to blame for metastasis, the epithelial-mesenchymal transition or the tumor microenvironment? Cancer Letters. 380 (1), 359-368 (2016).
  2. Heldin, C. -H., Rubin, K., Pietras, K., Ostman, A. High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy. Nature Reviews. Cancer. 4 (10), 806-813 (2004).
  3. Tani, T., et al. Pancreatic carcinomas deposit laminin-5, preferably adhere to laminin-5, and migrate on the newly deposited basement membrane. The American Journal of Pathology. 151 (5), 1289-1302 (1997).
  4. Eble, J. A., Niland, S. The extracellular matrix in tumor progression and metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. , (2019).
  5. Tomasek, J. J., Gabbiani, G., Hinz, B., Chaponnier, C., Brown, R. A. Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodelling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 3 (5), 349-363 (2002).
  6. Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment. Cancer Biology & Therapy. 5 (12), 1640-1646 (2006).
  7. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (4), 1394-1400 (2008).
  8. Cavaco, A., Rezaei, M., Niland, S., Eble, J. A. Collateral Damage Intended-Cancer-Associated Fibroblasts and Vasculature Are Potential Targets in Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2355(2017).
  9. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 164 (2), 192-204 (2012).
  10. Rousselle, P., Lunstrum, G. P., Keene, D. R., Burgeson, R. E. Kalinin: an epithelium-specific basement membrane adhesion molecule that is a component of anchoring filaments. The Journal of Cell Biology. 114 (3), 567-576 (1991).
  11. Eble, J. A., Bruckner, P., Mayer, U. Vipera lebetina venom contains two disintegrins inhibiting laminin-binding beta1 integrins. The Journal of Biological Chemistry. 278 (29), 26488-26496 (2003).
  12. Kusuma, N., et al. Integrin-dependent response to laminin-511 regulates breast tumor cell invasion and metastasis. International Journal of Cancer. 130 (3), 555-566 (2012).
  13. Martins Cavaco,, C, A., et al. The Interaction between Laminin-332 and α3β1 Integrin Determines Differentiation and Maintenance of CAFs, and Supports Invasion of Pancreatic Duct Adenocarcinoma Cells. Cancers. 11 (1), 14(2019).
  14. Ansari, N., Müller, S., Stelzer, E. H. K., Pampaloni, F. Quantitative 3D cell-based assay performed with cellular spheroids and fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 113, 295-309 (2013).
  15. Goldberg, M. T., Han, Y. -P., Yan, C., Shaw, M. C., Garner, W. L. TNF-alpha suppresses alpha-smooth muscle actin expression in human dermal fibroblasts: an implication for abnormal wound healing. The Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2645-2655 (2007).
  16. Kim, B. G., et al. Laminin-332-Rich Tumor Microenvironment for Tumor Invasion in the Interface Zone of Breast Cancer. The American Journal of Pathology. 178 (1), 373-381 (2011).
  17. Chen, J., et al. Overexpression of β3 Chains of Laminin-332 is Associated With Clinicopathologic Features and Decreased Survival in Patients With Pancreatic Adenocarcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 23 (7), 516-521 (2015).
  18. Huang, C. -C., et al. Hypoxia-induced therapeutic neovascularization in a mouse model of an ischemic limb using cell aggregates composed of HUVECs and cbMSCs. Biomaterials. 34 (37), 9441-9450 (2013).
  19. Wang, L., Wang, L., Gu, Y., Shu, Y., Shen, Y., Xu, Q. Integrin α6high Cell Population Functions as an Initiator in Tumorigenesis and Relapse of Human Liposarcoma. Molecular Cancer Therapeutics. 10 (12), 2276-2286 (2011).
  20. Makizumi, R., Yang, W. -L., Owen, R. P., Sharma, R. R., Ravikumar, T. S. Alteration of Drug Sensitivity in Human Colon Cancer Cells after Exposure to Heat: Implications for Liver Metastasis Therapy using RFA and Chemotherapy. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 1 (2), 117-129 (2008).
  21. Saleh, F. A., Whyte, M., Genever, P. G. Effects of endothelial cells on human mesenchymal stem cell activity in a three-dimensional in vitro model. European Cells & Materials. 22, 242-257 (2011).
  22. Ito, K., Sakuma, S., Kimura, M., Takebe, T., Kaneko, M., Arai, F. Mechanical characterization system using on-chip probe with wide range actuation. 2016 International Symposium on Micro-NanoMechatronics and Human Science (MHS). , 1-2 (2016).
  23. Curcio, E., Salerno, S., Barbieri, G., De Bartolo, L., Drioli, E., Bader, A. Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system. Biomaterials. 28 (36), 5487-5497 (2007).
  24. Lin, R. -Z., Lin, R. -Z., Chang, H. -Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Nowicki, M. O., et al. Lithium inhibits invasion of glioma cells; possible involvement of glycogen synthase kinase-3. Neuro-Oncology. 10 (5), 690-699 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

3 1 332 qPCR
نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.