مقالة منهجية

اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس ليسا من الأنسجة الثابتة الفورمالين

DOI:

10.3791/60138

⸱

أكتوبر 26, 2021

 , 
1Poxvirus and Rabies Branch, Division of High-Consequence Pathogens and Pathology, National Center for Emerging and Zoonotic Infectious Diseases, Centers for Disease Control and Prevention

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول اختبار الكيمياء المناعية للكشف عن مستضد فيروس داء الكلب كاختبار تشخيصي بديل للأنسجة الثابتة بالفورمالين.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحدة من الطرائق التشخيصية الأولية لداء الكلب هو الكشف عن الريبونوكليوبروتين الفيروسي (RNP) مجمع (مستضد) في عينات الأنسجة المصابة. في حين أن اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) أو الاختبار المناعي السريع المباشر (DRIT) يستخدمان بشكل شائع للكشف عن المستضد ، فإن كلا الاختبارين يتطلبان أنسجة طازجة و / أو مجمدة للانطباعات على الشرائح قبل الكشف عن المستضد باستخدام الأجسام المضادة. إذا تم جمع العينات وإصلاحها في الفورمالين، لا يكون أي من الاختبارين الأمثل للكشف عن المستضد، ومع ذلك، يمكن إجراء الاختبار عن طريق الكيمياء المناعية التقليدية (IHC) بعد تضمينها في كتل البارافين والقسم. مع هذه الطريقة IHC ، تلطخ الأنسجة بالأجسام المضادة لداء الكلب ، ويتم إزالة الأقسام ، واسترجاع المستضد عن طريق انحلال جزئي أو طرق أخرى ، واحتضانها بأجسام مضادة أولية وثانوية. وتلطخ المستضدات باستخدام الفجل peroxidase / الأمينية إيثيل كاربازول ومضادة ملطخة hematoxylin للتصور باستخدام المجهر الخفيف. بالإضافة إلى الكشف عن مستضد محددة، تثبيت الفورمالين يقدم مزايا أخرى مثل تحديد التغيرات النسيجية، وظروف استرخاء لتخزين العينات والنقل (تحت درجات الحرارة المحيطة)، والقدرة على اختبار الحالات بأثر رجعي وتحسين السلامة البيولوجية من خلال تعطيل العوامل المعدية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

داء الكلب هو التهاب الدماغ التدريجي الحاد الناجم عن الشعور السلبي فيروسات الحمض النووي الريبي التي تنتمي إلى جنس lyssavirus1. ما يقرب من 99٪ من جميع الوفيات البشرية الناجمة عن العدوى بفيروس داء الكلب (RABV)، وهو نوع عضو من جنس، وينتقل عن طريق ال2. داء الكلب تشخيص الحيوانات المشتبه به يعتمد على الكشف عن مستضد (في المقام الأول الفيروسية المشفرة نيوكليوبروتين, N البروتين) في مجمع مع الحمض النووي الريبي الجينومي (ريبونوكليوبروتين المعقدة, RNP) في أنسجة الدماغ3. يعتبر الكشف عن المستضد من خلال اختبار الأجسام المضادة الفلورية المباشرة (DFA) المعيار الذهبي لتشخيص داء الكلب4. تستخدم الطريقة مواد الدماغ المجمدة الطازجة أو الطازجة ، وانطباع اللمس على الشريحة ، والتثبيت في الأسيتون ، والتلطيخ باستخدام الأيزوثيوسيانات الفلورية المتاحة تجاريا (FITC) المسماة الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو متعددة النسيلة (mAbs / pAbs) وقراءتها من قبل المجهر الفلوري5. اختبار DFA سريع وحساس ومحدد للكشف عن مستضد داء الكلب في أنسجة الدماغ الطازجة. في الآونة الأخيرة ، تم إثبات اختبار كيميائي مناعي سريع مباشر (DRIT) ، تقنية الكيمياء المناعية المعدلة (IHC) ، لإظهارحساسيةمماثلة ل DFA ولكنه يوفر ميزة المجهر الخفيف للتصور 6 . في حين أن طريقة الكشف المستخدمة في DRIT ، تشبه IHC ، فإن الخطوة الأولية تستخدم الأنسجة الطازجة أو المجمدة لتوليد انطباعات لمسة عن العينة تليها التثبيت في الفورملين.

IHC هو تقنية تستخدم على نطاق واسع لتحديد التغيرات النسيجية والكشف عن البروتينات باستخدام أجسام مضادة محددة في الأنسجة الثابتة الفورماتين جزءا لا يتجزأ من كتل البارافين. IHC هو اختبار بديل راسخ للكشف عن مستضد داء الكلب في أقسام الأنسجة7. وقد استخدمت بشكل خاص IHC لتشخيص الحالات بأثر رجعي التي أظهرت الأمراض العصبية لتحديد عبء داء الكلب8. البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة الفورملين الثابتة الحفاظ على البروتينات للكشف حتى بعد عدة سنوات عند تخزينها في درجة الحرارة المحيطة9. علاج الفورمالين يعدل البروتينات عن طريق ربط وتغيير سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية، والتي قد تجعل epitopes لم يعد رد الفعل ضد الأجسام المضادة10. في حين أن اختبار IHC للكشف عن مستضد داء الكلب ينطوي إما على mAbs أو pAbs ، فإن هذا الأخير مفيد حيث يمكن اكتشاف العديد من الأسطح وفيروسات أليسا المتباينة11.

الخطوات القياسية التي ينطوي عليها IHC هي تثبيت الأنسجة ، وتضمينها في كتل البارافين ، وتقسيم الأنسجة ، وإزالة البارافينين والترطيب ، واستعادة الظهارة ، والتفاعل ضد الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، والتطوير باستخدام الركائز الكروموجينية. تصف هذه المخطوطة وصفا مفصلا لبروتوكول تشخيص داء الكلب. للكشف عن مستضد داء الكلب، يتم استخدام مصل الفأر المحصن ب RABV (pAbs) المتولد في المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها (CDC) أتلانتا، جورجيا، بالاشتراك مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأرة ذات المستويات الحيوية. يتم الكشف عن القيمة المطلقة البيوتينية بإضافة مركب البيروكسيديز (HRP) من البكتيريا العقدية الفجلية (HRP) تليها تطور اللون مع ركيزة أمينية إيثيلكاربازول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفي حين أن بروتوكول IHC قد تم تنفيذه على الأنسجة الثابتة بالفورملين، والتي تبطل RABV إذا كانت موجودة، ينبغي اتباع بروتوكولات السلامة البيولوجية المناسبة بشكل صحيح. جميع إجراءات السلامة البيولوجية موصوفة في السلامة الحيوية في المختبرات الميكروبيولوجية والطب الحيوي (BMBL) الطبعة الخامسة (https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm) ، بما في ذلك ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) ، ومتطلبات التطعيم كما هو موضح12. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي اتباع الاحتواء السليم للمواد الكيميائية الخطرة والتعامل معها (مثل الفورمالين، وال AEC، والزيلين) (مثل أغطية الدخان).

1. تثبيت الفورماليين من الأنسجة

  1. مكان 3-5 مم أنسجة الدماغ التي تم جمعها بعد necropsy13 إلى 10٪ الفوسفات العازلة حل الفورماتين (1:20 إلى 1:50 نسبة الأنسجة / الفورماتين) لمدة 24-72 ح.
    تنبيه: الفورماتين هو مثبت سام.
  2. سجل وزن الأنسجة التقريبي (الحجم) ونوع الأنسجة (مناطق الدماغ) وحجم الفورمالين. من المهم للمختبرات توثيق وحفظ السجلات الخاصة بأوقات التثبيت.
  3. لتخزين الأنسجة لفترة أطول بعد تثبيت الفورماتين وقبل المعالجة، ضع الأنسجة في الإيثانول بنسبة 70٪.

2. معالجة الأنسجة

  1. بعد تثبيت العينة، تشريح الأنسجة لتشمل مناطق الدماغ الهامة على سبيل المثال، المقاطع العرضية من جذع الدماغ، المخيخ (3 فصوص)، أو قرن آمون (كل من فرس النهر) كل قطع 3 إلى 5 مم سميكة ووضعها في أشرطة المعالجة.
  2. معالجة أشرطة الأنسجة لتسلل شمع البارافين، جزءا لا يتجزأ من كتل البارافين ومقسمة (3 إلى 6 ميكرومتر) على microtome.

3. إعداد المواد / أطباق تلطيخ

  1. إعداد طبقتلطيخ 14 (جدول المواد) كما هو موضح في الشكل 1. ملء كل طبق مع 250 مل من الحل.
  2. إعداد 3-أمينو-9-إيثيلكاربيزول (AEC) الركيزة الأسهم الحل
    1. حل قرص واحد 20 ملغ من 3 الأمينية 9-إيثيلكاربازول (AEC) في 5 مل من N, N, ثنائي ميثيلفورماميد باستخدام ماصة زجاجية.
      تنبيه: AEC مادة مسرطنة.
  3. إعداد البروتياز (مثل البروناز) حل المخزون لاسترجاع المستضد
    1. حل 7 ملغ من بروتياز في 200 مل من برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد العازلة شطف PBS-T
    1. إضافة 10 مل من توين 80 إلى 990 مل من برنامج تلفزيوني. مزجها جيدا لتشكيل حل متجانس.

4. إزالة الترطيب والإماهة النسيجية

  1. جعل 5 ميكرومتر قسم البارافين باستخدام microtome، تطفو على حمام مائي في 38 درجة مئوية وجمع على الشرائح الزجاجية. تسمية الشرائح باستخدام قلم/علامة مقاومة للكواشف.
  2. ضع الشرائح على صينية وتذوب في فرن 55-60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. لا ترفع درجة الحرارة فوق 60 درجة مئوية لأنها يمكن أن تدمر المستضد الفيروسي.
  3. إزالة الشرائح من الفرن وعلى الفور deparaffinize في 3 شطف xylene متتالية من 5 دقائق لكل منهما في الأطباق 1 و 2 و 3.
  4. إعادة ترطيب المقاطع على الشريحة عن طريق الغمر المتتابع في تقليل تخفيف الإيثانول إلى الماء المؤين: (4 إلى 11 هو شطف تراجع) طبق 4: xylene/100٪ الإيثانول (1:1)؛ طبق 5: الإيثانول 100٪؛ طبق 6: الإيثانول 100٪؛ طبق 7: 95٪ الإيثانول; طبق 8: 95٪ الإيثانول; طبق 9: 80٪ الإيثانول. طبق 10: 70٪ الإيثانول. طبق 11: المياه deionized (الشكل 1. إعداد الطبق).
    تنبيه: Xylene مادة كيميائية خطرة وينبغي إجراء العمل في غطاء الدخان.

5. استرجاع مستضد بروتيوليك

  1. علاج الشرائح مع بروتياز (2.5 ميكروغرام / مل من برنامج تلفزيوني) لمدة 30 دقيقة لاسترجاع مستضد بروتيوليك في الطبق 12.
  2. ثم شطف في PBS-T لمدة 10 دقيقة (طبق 13).
  3. علاج مع بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقيقة (طبق 14).
  4. مرة أخرى، يغسل مع PBS-T لمدة 10 دقيقة (طبق 15).

6. إجراء تلطيخ

  1. مقبض الشرائح واحدة في وقت واحد الحفاظ على الشرائح المتبقية غارقة في المخزن المؤقت (لا إزالة حامل الشريحة كله - إبقاء الشرائح الرطب). إزالة شريحة واحدة ولطخة قبالة العازلة الزائدة (باستخدام منشفة ورقية) من جميع أنحاء قسم الأنسجة مع الحرص على عدم تعكير صفو قسم الأنسجة. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة، التي أدلى بها وضع المناشف الورقية رطبة، على مقاعد البدلاء المختبر أعلى14 في درجة حرارة الغرفة مع مصل الماعز العادي (حجب) لمدة 15 دقيقة.
  2. احتضان مع المثلى المحددة مسبقا تخفيف الأولية المضادة لداء الكلب الأجسام المضادة (1:250 تخفيف مصل الماوس المضادة لداء الكلب، غير منشورة) (السيطرة الإيجابية) والأجسام المضادة للسيطرة السلبية في درجة حرارة الغرفة نفس أعلاه (الخطوة 6.1.) لمدة 60 دقيقة مع عدم وجود يغسل في ما بين.
  3. بعد 60 دقيقة، اغسل مع PBS-T لمدة 10 دقائق (طبق 16).
  4. احتضان مع الأجسام المضادة البيوتينية (الأنواع محددة) في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (التعامل مع نفس الخطوة 6.1.).
  5. يغسل مع PBS-T لمدة 10 دقائق (طبق 16).
  6. احتضان مع مجمع ستريبتافيدين-HRP في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة (التعامل مع نفس 6.1.).
  7. يغسل مع PBS-T لمدة 10 دقائق (طبق 16).
  8. احتضان مع الركيزة البيروكسيديز، الأمينية إيثيلكاربازول (AEC)، في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. جعل AEC فقط قبل الاستخدام. للقيام بذلك، إضافة 1 مل من AEC الأسهم الحل إلى 14 مل من 0.1M خلات المخزن المؤقت، pH 5.2. إضافة 0.15 مل من 3٪ H2O2. تصفية الخليط قبل الاستخدام مباشرة (0.45 ميكرومتر مرشح).
    ملاحظة: حل العمل من AEC مستقرة فقط لمدة 2-3 ساعة. يمكن تخزين محلول مخزون AEC في الثلاجة لفترات أطول.
  9. غسل في الماء deionized 10 دقيقة (طبق 17)
  10. مضادة ملطخة Hematoxylin جيل المخفف 1:2 مع الماء deionized لمدة 2 دقيقة (طبق 18).
  11. شطف الهيماتوكسيلين الزائد مع شطف تراجع الماء deionized (طبق 19 و 20).
  12. شطف في المياه الحنفية سكوت 30 ق (حل الزرق) طبق 21.
  13. غسل في الماء deionized 10 دقيقة (طبق 22)
  14. إزالة الشرائح واحد في وقت واحد - جبل مع الماء للذوبان في تركيب المتوسطة.
  15. قراءة الشرائح على المجهر الخفيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح الشكل 2 نتائج تلطيخ IHC التمثيلية لعينات التحكم الإيجابية والسلبية في أنسجة الدماغ المختلفة التي تم اختبارها. ويمثل الشكل 2A,D,G عينات موجبة عند 200x، بينما يتوافق الشكل 2B,E,H مع التكبير 400x على التوالي. الشكل 2A-C تتوافق مع جذع الدماغ; الشكل 2D-F تتوافق مع المخيخ وخل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظرا لارتفاع معدل الوفيات الناجمة عن داء الكلب بعد ظهور الأعراض ، فإن تشخيص الحيوانات المشتبه بها لعدوى RABV أمر بالغ الأهمية لعلاج وقائي مناسب بعد التعرض. يعتمد تشخيص داء الكلب في المقام الأول على تقنيات DFA و DRIT و PCR باستخدام الأنسجة الطازجة أو المجمدة. لاختبار الأنسجة المثبتة بالفورمولين، يوفر اختبار IHC طريقة بديلة للكشف الحساس والمحدد عن مستضد RABV. في حين أن الأنسجة الثابتة في الفورمالين لديها بروتينات استقرت بسبب تعديل السلاسل الجانبية مثل الربط المتبادل ، تحتاج العينات إلى معالجتها قبل الكشف عن المستضد. في هذا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أخصائيي المختبرات وأخصائيي الأوبئة والشركات التابعة لإدارات الصحة العامة على تقديم عينات إلى مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي النتائج والاستنتاجات التي توصل إليها المؤلفون ولا تمثل بالضرورة الموقف الرسمي لمراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها. استخدام الأسماء التجارية والمصادر التجارية هي لتحديد الهوية فقط ولا يعني موافقة من قبل مراكز مكافحة الأمراض والوقاية منها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3٪ بيروكسيد الهيدروجينماركاتجاهزة على الرف 3٪ H2O2
3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)Millipore SigmaA6926
Acetate Buffer pH 5.2Poly Scientific R & دي كورب.s140
فورمالين مخزن مخزن 10٪ فوسفاتفيشر ScientificSF100-4
زلات غطاء معتمدة كورنينجفيشر Scientific12-553-47124 × 50 مم
إيثانول 190 دليلعلى Pharmco-AAPER111000190
الإيثانول 200 دليلعلى Pharmco-AAPER111000200
تركيبة هيماتوكسيلين جيل # 2فيشر ScientificCS401-1D
HistoMark Biotin-Streptavidin Peroxidase Kitseracare71-00-18الجسم المضاد الأساسي للفأر  
ImmunoHistoMountMillipore Sigmai1161تصاعد الوسائط
N ، N ، ثنائي ميثيل فورماميد GRفيشر ScientificD119
فوسفات مخزن محلول ملحي   ؛HyCloneRR14440.0101M ، درجة الحموضة 7.2 (درجة الحموضة 7.2-7.6)
Plan-APOCHROMAT 40X / 0.95 الهدفمتعدد البائعين
Plan-APOCHROMATIC 20X / 0.75 الهدف بائعينمتعددين Pronase
Millipore Sigma53702Protease, Streptomyces griseus< / em>
Scott's Tap Water  بولي ساینتيفيك آر اند دي كورب.s1887
Tissue-Tek مجموعة بقع الشريحةفيشر Scientific50-294-72
TWEEN-80 & nbsp;Millipore SigmaP1754
XyleneFisher ScientificX3S-4الدرجة النسيجية
- مجهربائعين
فرعية مخزن تصوير Zeiss Axioplan 2 من متعددين

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C., Kuzmin, I., Meslin, F. Lyssaviruses and rabies: current conundrums, concerns, contradictions and controversies. F1000Research. 6, 184(2017).
  2. Fooks, A. R., et al. Current status of rabies and prospects for elimination. Lancet. 384 (9951), 1389-1399 (2014).
  3. Finke, S., Brzozka, K., Conzelmann, K. K. Tracking fluorescence-labeled rabies virus: enhanced green fluorescent protein-tagged phosphoprotein P supports virus gene expression and formation of infectious particles. Journal of Virology. 78 (22), 12333-12343 (2004).
  4. WHO. WHO Expert Consulation on Rabies, Third Report. WHO Technical Report Series. 1012, 1(2018).
  5. Goldwasser, R. A., Kissling, R. E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 98 (2), 219-223 (1958).
  6. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  7. Fekadu, M., Greer, P. W., Chandler, F. W., Sanderlin, D. W. Use of the avidin-biotin peroxidase system to detect rabies antigen in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Journal of Virological Methods. 19 (2), 91-96 (1988).
  8. Hamir, A. N., Moser, G., Rupprecht, C. E. A five year (1985-1989) retrospective study of equine neurological diseases with special reference to rabies. Journal of Comparative Pathology. 106 (4), 411-421 (1992).
  9. Inoue, S., et al. Cross-reactive antigenicity of nucleoproteins of lyssaviruses recognized by a monospecific antirabies virus nucleoprotein antiserum on paraffin sections of formalin-fixed tissues. Pathology International. 53 (8), 525-533 (2003).
  10. Webster, J. D., Miller, M. A., Dusold, D., Ramos-Vara, J. Effects of prolonged formalin fixation on diagnostic immunohistochemistry in domestic animals. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (8), 753-761 (2009).
  11. Feiden, W., et al. Immunohistochemical staining of rabies virus antigen with monoclonal and polyclonal antibodies in paraffin tissue sections. Zentralblatt fur Veterinarmedizin Reihe B. 35 (4), 247-255 (1988).
  12. Manning, S. E., et al. Human rabies prevention--United States, 2008: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices. Morbidity and Mortality Weekly Reports Recommendations and Reports. 57, 1-28 (2008).
  13. WHO. Laboratory techniques in rabies. 1, 5th ed, 67-72 (2018).
  14. Patrick, E. M., et al. Enhanced Rabies Surveillance Using a Direct Rapid Immunohistochemical Test. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  15. Whitfield, S. G., et al. A comparative study of the fluorescent antibody test for rabies diagnosis in fresh and formalin-fixed brain tissue specimens. Journal of Virology Methods. 95 (1-2), 145-151 (2001).
  16. WHO. Diagnostic procedures for antigen detection. , https://www.who.int/rabies/about/antigendetection/en (2016).
  17. Jarvis, J. A., Franke, M. A., Davis, A. D. Rabies direct fluorescent antibody test does not inactivate rabies or eastern equine encephalitis viruses. Journal of Virology Methods. 234, 52-53 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AEC PBS T

مقالات ذات صلة