الضامة ، وخاصه الضامة الاوليه ، هي تحديا لtransfect لأنها تتخصص في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ونحن نقدم وصفا للبروتوكول الذي يسمح بالنقل عاليه الكفاءة من الضامة الاوليه مع mRNA المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
النقل عاليه الكفاءة من الضامة الابتدائية مع في المختبر كتب mRNA
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الضامة هي خلايا الخلية المتخصصة في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ولهذه الغاية ، فهي مجهزه بمجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs). لسوء الحظ ، وهذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا لtransfect كما الكاشف ترانسفيكشن والأحماض النووية المحولة غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل PRRs كما غير الذاتي. ولذلك ، غالبا ما يؤدي التحويل في الضامة التنشيط وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار من الضامة. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح النقل عاليه الكفاءة من الضامة murine الابتدائية مثل الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (BMDM) مع mRNA في المختبر المنقولة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. مع هذا البروتوكول البسيط ، يتم تحقيق معدلات التحويل من حوالي 50-65 ٪ لل PM وحوالي 85 ٪ لشركه BMDM دون السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل جيل mRNA للتحويل من ثوابت الحمض النووي مثل البلازميدات واجراء التحويل.
المقدمة
الضامة هي الخلايا البالعة التي تتخصص في الكشف ، وتناول والميكروبات المهينة ، والخلايا ابوتوتيك والحطام الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فانها تساعد علي تنسق الاستجابات المناعية عن طريق إفراز السايتوكينات والكيميائية وعن طريق تقديم المستضدات إلى خلايا T و B الخلايا. الضامة تلعب أيضا أدوارا هامه في العديد من العمليات الأخرى, مثل التئام الجروح, تصلب الشرايين, التورم والسمنة.
لتكون قادره علي الكشف عن جزيئات غير الذاتي مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) والجزيئات خارج المكان مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة الضرر (DAMPs) ، وقد تم تجهيز الضامة مع مجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRR)1. لسوء الحظ, هذا أيضا يجعل ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ عزل الضامة من الفئران وفقا لقانون حماية الماشية في ألمانيا وفقا للجنة الأخلاق في جامعه كولونيا.
ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات ارتداء القفازات. تنفيذ جميع الخطوات ترانسكشن تحت غطاء للتدفق الرقائقي لمنع تلوث الخلايا. قبل العمل مع mRNA ، تنظيف جميع الصكوك مثل الماصات وكل سطح مع 70 ٪ الايثانول و/أو السطحي RNAse المهينة (جدول المواد). تاكد من ان جميع أنابيب رد الفعل هي RNAse خاليه ومعقمه. استخدام المياه المعقمة فقط ، RNAase خاليه من أجل المخففات. استخدم بشكل حصري نصائح الماصة مع الفلاتر. تغيير نصائح الماصة بعد كل خطوه لضبط الماصات.
1. جيل من قالب الحمض النووي
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد mRNA الترميز للعلم الموسومة نيمو والمتغيرات IKKβ لتحويل الضامة الاساسيه16. الترميز البلازميدات للعلم--الموسومة من نوع البرية (نيموWT) و C54/347a متحولة نيمو (نيموC54/374a) (انظر جدول المواد) تحتوي بالفعل علي T7 بروموتور في الاتجاه الصحيح (الشكل 1ا). التالي ، كان علينا فقط ان جعل البلازميدات لتوليد قوالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. لهذه ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا نقدم بروتوكول لنقل كفاءه عاليه من الضامة الاساسيه عاده من الصعب إلى ترنسفكايشن مع في المختبر كتبت mrna. والاهم من ذلك ، فان انتقال الضامة باستخدام هذا البروتوكول لا يحفز موت الخلايا أو ينشط الإشارات التهابيه التي تشير إلى انه لا يتم التعرف علي الكاشف العابر ولا علي مركبات mRNA غير الذاتية.
جوده mRNA هي ذات اهميه رئيسيه لنجاح عمليه التحويل من الضامة باستخدام هذا البروتوكول. التالي ، ينبغي توخي الحذر الشديد من ان mRNA لا تلامس مع RNAses (علي سبيل المثال ، من خلال المخازن المؤقتة الملوثة أو ق.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ساندت هذا عمل كان ب ال [دوتش] [فورسسكهنغجيميندسكهفت] ([سالفيس] 670).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 5-ميثيل CTP (100 مللي متر) | جينا بيوزينس | NU-1138S | المخزنة في -20 & درجة; C |
| فوسفاتيز أنتاركتيكا | نيو إنجلاند BioLabs | M0289 | مخزنة عند -20 درجة ؛ ج |
| عازلة تفاعل الفوسفاتيز في القطب الجنوبي (10x) | New England BioLabs | B0289 | مخزنة عند -20 درجة ؛ C |
| المضادة ل NEMO / IKK & جاما ؛ الجسم المضاد | Invitrogen | MA1-41046 | المخزن عند -20 درجة ؛ C |
| الأجسام المضادة المضادة للأكتين | سيجما-ألدريتش | A2228 | المخزنة عند -20 درجة ؛ أطباق C |
| Petri 92,16 مم مع كاميرات | Sarstedt | 821,473 | المخزنة في RT |
| CD11b Microbeads الماوس والإنسان | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | المخزنة في 4 & درجة; C |
| Cre recombinase + T7-Promotor التمهيدي الأمامي | Sigma-Aldrich | 5 & prime ؛ -GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3 & حاد ؛ C | |
| Cre recombinase + T7-Promotor التمهيدي العكسي | Sigma-Aldrich | 5 & prime ؛ -CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3 & prime ؛ | |
| طقم تنقية الحمض النووي C: طقم تنقية QIAquick PCR | Qiagen | 28104 | مخزن في RT |
| eGFP + T7-Promotor التمهيدي الأمامي | Sigma-Aldrich | 5 & حاد ؛ -GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3 & حاد ؛ C | |
| eGFP + T7-Promotor التمهيدي العكسي | Sigma-Aldrich | 5 & حاد ؛ -TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3 & حاد ؛ C | |
| عازلة سريعة الهضم (10x) | Thermo Scientific | B64 | مخزنة عند -20 درجة ؛ C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | مخزنة عند -20 درجة ؛ C |
| بوليميراز عالي الدقة مع التدقيق اللغوي: Q5 عالي الدقة DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | مخزنة عند -20 درجة ؛ C |
| IKK & beta ; + T7-Promotor التمهيدي الأمامي | Sigma-Aldrich | 5 & prime ;-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3 &prime ؛ C | |
| IKK & beta ; + T7-Promotor التمهيدي العكسي | Sigma-Aldrich | 5 & prime ؛ -GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3 & prime ؛ C | |
| في المختبر < / em> مجموعة نسخ mRNA: مجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA (مع مخلفات polyA) | New England BioLabs | E2060 | مخزنة عند -20 درجة ؛ أعمدة C |
| LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | مخزنة في RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | المخزنة في RT |
| المخزن المؤقت والكاشف: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | مخزنة في 4 درجات ؛ C |
| متحولة IKK & بيتا ؛ IKK-2S177 / 181E البلازميد | Addgene | 11105 | المخزنة في -20 درجة ؛ C |
| Mutant NEMOC54 / 347A البلازميد | Addgene | 27268 | المخزنة عند -20 درجة ؛ C |
| pEGFP-N3 البلازميد | Addgene | 62043 | المخزن في -20 & deg; |
| 528906 | C poly (I: C) | Calbiochem | عند -20 درجة ؛ C |
| pPGK-Cre البلازميد | F.T. Wunderlich ، H. Wildner ، K. Rajewsky ، F. Edenhofer ، متغيرات جديدة من Cre recombinase المحفز: يظهر طفرة جديدة لبروتين اندماج Cre-PR حساسية معززة ومجموعة موسعة من التحفيز. الأحماض النووية Res. 29 ، 47e (2001). مخزنة في -20 درجة ؛ C | ||
| زائف UTP (100 مل) | جينا Biosience | NU-1139S | المخزنة في -20 & درجة; فاصل C |
| QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | مخزن في |
| RT Rat-anti-mouse CD11b الأجسام المضادة ، | BioLegend | APC 101212 | تخزينه عند 4 درجات ؛ C |
| الجرذان المضادة للفأر F4 / 80 المضادة ، PE المترافق | eBioscience | 12-4801-82 | المخزنة في 4 درجات ؛ C |
| المؤتلف M-CSF | Peprotech | 315-02 | مخزنة عند -20 درجة ؛ |
| طقم تنقية الحمض النووي الريبي C: طقم تنظيف النسخ MEGAclear | ThermoFisher Scientific | AM1908 | مخزنة عند 4 درجات ؛ |
| C خافض للتوتر السطحي متحلل للRNAse: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | مخزن في RT |
| Ultrapure LPS من الإشريكية القولونية O111: B4 | Invivogen | المخزنة عند -20 درجة ؛ C | |
| Wild type IKK & beta بلازميد | Addgene | 11103 | مخزنة عند -20 درجة ؛ C |
| البرية نوع NEMO البلازميد | Addgene | 27268 | المخزنة في -20 درجة ؛ ج |
المراجع
- Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and oppo....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
