يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تكنولوجيا الخلية المغلفة لتسليم البيولوجيا إلى العين الماوس

7.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60162

⸱

مارس 30, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of South Carolina, 2Department of Ophthalmology, Division of Research, Medical University of South Carolina, 3Department of Neuroscience, Division of Research, Medical University of South Carolina, 4Division of Research, Ralph H. Johnson VA Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

عرض هنا هو بروتوكول لاستخدام alginate كبوليمر في microencapsulation من الخلايا الخلد لتسليم على المدى الطويل من البيولوجية إلى عيون القوارض.

الملخص

العديد من العلاجات الحالية قيد التطوير لأمراض القطب الخلفي للعين هي البيولوجية. هذه الأدوية تحتاج إلى أن تدار في كثير من الأحيان، وعادة عن طريق الحقن داخل الفيتيريال. وأصبحت الخلايا المغلفة التي تعبر عن المنطق البيولوجي المفضل أداة لإنتاج البروتين المحلي وإطلاقه (على سبيل المثال، عن طريق تسليم الأدوية على المدى الطويل). بالإضافة إلى ذلك، تستخدم أنظمة التغليف مواد نفاذية تسمح بنشر المواد الغذائية والنفايات والعوامل العلاجية من وإلى الخلايا. يحدث هذا أثناء إخفاء الخلايا من الاستجابة المناعية المضيفة ، وتجنب الحاجة إلى قمع الجهاز المناعي المضيف. يصف هذا البروتوكول استخدام alginate كبوليمر في الميكروينكابسوليشن إلى جانب طريقة الرذاذ الكهربائي كتقنية microencapsulation. وقد استخدمت خلايا ARPE-19، وهو خط الخلية RPE الإنسان الناشئة تلقائيا، في تجارب العلاج بالخلايا على المدى الطويل بسبب وظائفها مدى الحياة، ويستخدم هنا لتغليف وتسليم الكبسولات إلى عيون الماوس. تلخص المخطوطة خطوات microencapsulation الخلية، ومراقبة الجودة، وتسليم العين.

المقدمة

تمثل العلاجات القائمة على الخلايا التقنيات البيولوجية الثورية التي تم تطبيقها على نطاق واسع في الطب. في الآونة الأخيرة، تم تطبيقها بنجاح في علاج الأمراض العصبية، وأمراض العيون، والسرطان. تغطي علاجات الخلايا مجموعة واسعة من الحقول من استبدال الخلايا إلى تسليم الدواء ، ويركز هذا البروتوكول على هذا الأخير. وقد أظهرت كبسولات الذبحة القابلة للتحلل (MC) فعالية كنظام تسليم، وأنها أصبحت تستخدم على نطاق واسع في مجال الطب الحيوي. وقد استخدمت Alginate في microencapsulation بسبب عملية هلام بسيطة، التحلل البيولوجي، والتوافق البيولوجي ممتازة، والاستقرار تحت في ظروف الجسم الحي1،,2،,3،,4.

وقد استخدمت طريقة البخاخة الكهربائية، كتقنية microencapsulation، بنجاح لتغليف الببتيدات والبروتينات باستخدام alginate (البوليمر الأساسي) وبولي ل-ornithine (البوليمر طلاء الثانوية). تم العثور على كل من البوليمرات بشكل طبيعي واستخدامها لتوافقها البيولوجي5،6،7. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي في العلاجات القائمة على الخلايا هو قمع الجهاز المناعي المضيف لتجنب الآثار الجانبية الناجمة عن الأدوية المثبطة للمناعة. تعتبر نفاذية كبسولات الجينات الدقيقة خاصية مناسبة لتغليف الخلايا ، مما يسمح بنشر المواد الغذائية والنفايات والعوامل العلاجية داخل الخلايا والخروج منها أثناء إخفاءها من الاستجابة المناعيةالمضيفة8،9،10.

في العين ، تم استخدام الخلايا المغلفة في التجارب السريرية للتسليم المستمر للبيولوجية (أي عوامل النمو11،12 وخصم عامل النمو13)لعلاج التهاب الشبكية الصباغي أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر. ويجري حاليا ً استكشاف أهداف أخرى مثل مثبطاتالمكملات 14 في البيئات قبل السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب وفقًا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الطبية لرعاية الحيوانات واستخدامها في ولاية كارولينا الجنوبية بموجب بروتوكول ID 00399.

1. ثقافة الخلية

  1. توليد خلايا الظهارية صبغية الشبكية البشرية (ARPE-19) خط الخلية تعبر بشكل ثابت عن الجين المفضل وفقا للبروتوكولات المنشورة14،15.
  2. الحفاظ على الخلايا في جلوبيكو تعديل متوسط النسر (DMEM) مع استكمالها مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS).
  3. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
  4. استبدال المتوسط كل 2-3 أيام.
  5. مرور الخلايا بعد الوصول إلى 70٪ -80٪ التقاء باستخدام إجراءات زراعة الأنسجة القياسية.

2- تغليف الخلايا

  1. اخلطي الجينات الصوديوم مع الماء المنزوع (DI) لتركيز نهائي قدره 2% ث/في وطهرعن طريق الترشيح مع فلتر حقنة معقمة بسعة 0.2 ميكرومتر.
  2. إعداد الخلايا لتكون مختلطة مع محلول alginate عن طريق trypsinizing، الطرد المركزي، وغسلها مع 10 mM HEPES محلول المالحة المخزنة مؤقتا (pH = 7.4). باستخدام مقياس الهيموكيتومتر، عد الخلايا وضبط تركيز الخلية النهائية إلى 1 × 106 في محلول الذبحة الصدرية.
    ملاحظة: يجب تشغيل عملية التغليف داخل غطاء محرك السيارة المعقم.
  3. تحميل ~ 300 μL aliquots من alginate وخليط الخلايا في حقنة 3 مل ونعلق على مضخة حقنة. سيتم ضخ الحل من خلال إبرة طرف حادة 30 G إلى حمام هلام معقم يوضع في كوب 50 مل معقم تحت طرف الحقنة في 7 ملم لإبرة لحمام مسافة الرش.
  4. يحتوي حمام الهلام على حجم 40 مل من 10 mM HEPES المالحة المخزنة مؤقتا التي تحتوي على 100 mM كلوريد الكالسيوم (CaCl2)و 0.5٪ ث / ضد بولي L-ornithine (منظمة التحرير الفلسطينية). منظمة التحرير الفلسطينية هي طبقة بوليمر ثانوية يمكن حذفها أو تغييرها وفقا لاحتياجات المحقق.
  5. ضبط الجهد ومعدل التدفق والحفاظ على حد سواء ثابتة خلال عملية التغليف بمعدل تدفق 60 ملم / ساعة والجهد الأولي 6.0 كيلوفولت لإنتاج حجم microcapsules ~ 150 ميكرومتر.
  6. توصيل مقطع من سلك أنود (أحمر) من طرف إبرة مولد الجهد العالي إلى إبرة وربط مقطع الأرض (أسود) إلى الأسلاك النحاسية التي هي في منتصف الطريق مغمورة في حمام هلام. دفعة واحدة من خليط alginate + الخلية (1 مل) يستغرق حوالي 30 دقيقة لإعداد الخلايا المغلفة (حوالي 25،000 كبسولة صغيرة).
  7. اغسل الكبسولات الدقيقة المشكّلة التي تحتوي على خلايا مع محلول الغسيل (10 مل HEPES المخزنة مؤقتاً مع محلول المحلول المالح الذي يحتوي على 1.5 مل CaCl2، درجة الحموضة = 7.4) مرتين. لا تستخدم برنامج تلفزيوني للغسيل.
  8. احتضان الخلايا المغلفة مع 10٪ FBS تكمل وسائل الإعلام DMEM في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    ملاحظة: وترد أدوات عملية التغليف في الشكل 1.

3. تأكيد أن التغليف لا يؤثر على صلاحية الخلية

  1. بعد احتضان الخلايا المغلفة لمدة 24 ساعة في وسائل الإعلام ، قم بإعداد عينة صغيرة من 500 ميكرولتر (~ 30 كبسولة دقيقة) للتلطيخ.
  2. غسل microcapsules 2x باستخدام محلول الغسيل (10 mM HEPES المالحة العازلة التي تحتوي على 1.5 mM CaCl2)ووصمة عار لهم لقابلة البقاء حية ميتة باستخدام مجموعة القتلى الحية / القتلى.
  3. إعداد خليط تلطيخ من calcein AM (acetoxymethyl) والإيثيدييوم homodimer-1 بتركيزات نهائية من 2 ميكرومتر و 4 ميكرومتر، على التوالي.
  4. أضف 2 مل من خليط تلطيخ إلى الخلايا المغلفة واحتضان لمدة 30-45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة (RT).
  5. مع الطموح الدقيق، ونسخل محلول تلطيخ وغسل microcapsules 2x مع محلول الغسيل. استخدام نظام المجهر الفلورسنت لمراقبة وصورة الخلايا مغلفة.
    ملاحظة: ويصور توثيق التغليف في الشكل 2.

4. تأكيد أن كبسولات هي الحجم المناسب للتسليم والتسليم من البيولوجية

  1. عادة ما يتم تنفيذ الحقن داخل الفيريتريال في عين الماوس مع إبرة 27 G حادة الطرف (القطر الداخلي من 210 ميكرون) تعلق على حقنة هاملتون 2.5 ميكرولتر.
  2. توليد كبسولات تتراوح بين 100 إلى 200 ميكرون، تمييعها في وسائل الإعلام الخالية من المصل، وسحبها بعناية حتى في حقنة هاملتون. PBS ليست وسيلة مناسبة، كما كبسولات الذبحة سوف تذوب في برنامج تلفزيوني.
  3. إخراج ببطء 1 μL قطرات تحتوي على كبسولات على شريحة المجهر وتحديد سلامتها باستخدام المجهر مشرق الميدان تستقيم.
  4. ضبط حجم كبسولة (انظر الخطوة 2.3) عن طريق ضبط الجهد ومعدل التدفق وفقا لذلك. يتم إنتاج كبسولات صغيرة بطريقة غير خطية عن طريق زيادة الجهد وانخفاض معدل التدفق قليلا8. في أيدينا، ثبت كبسولات من 150 ميكرومتر في القطر لتكون الأكثر ملاءمة. تعديل حجم كبسولة يعتمد أيضا على الحفاظ على تركيز alginate ثابت في حين تغيير المعلمات الأخرى.
  5. الحفاظ على مجموعة منفصلة من الخلايا في كبسولات من الحجم المناسب في وسط خالية من المصل لتحديد كمية إفراز البيولوجية المطلوبة. استخدام ELISAs الحساسة أو النشاف الغربي لتحديد تركيز البيولوجية في supernatant.
  6. تحديد الكمية المطلوبة من الكبسولات التي تحتاج إلى حقن على أساس PK / PD المعروف (الدوائية / الديناميكا الدوائية) العلاجية. في أيدينا، 10 كبسولات لكل عين الماوس ثبت أن تكون الأكثر فعالية.

5. تسليم كبسولة في الزجاجي الماوس

  1. إجراء الحقن داخل الفيتريال باستخدام المجهر تشريح. انظر الشكل 3 للإعداد الجراحي والمواد المستخدمة أثناء العملية. ويمكن الاطلاع على بروتوكول مفصل للحقن intravitreous في مكان آخر16.
  2. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل perperitoneal من xylazine والكيتامين (20 ملغ / كجم و 80 ملغ / كجم) أو غيرها من التخدير المفضل المعتمد من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في المؤسسة المحددة. ضمان العمق المناسب للتخدير باستخدام قرصة إصبع القدم17.
  3. يُزلّط التلاميذ الماوس مع فينيلفرين HCL (2.5%) وكبريتات الأتروبين (1%) للسماح لرؤية جيدة من الغرفة الزجاجي وتطبيق هلام العين التشحيم على العينين للحفاظ على رطوبة لهم أثناء الإجراء.
  4. ثقب السكليرا في أطرافه مع إبرة 26 G كثقب دليل، والتأكد من أن 1) الإبرة في زاوية 45 درجة مع العين والجدول و 2) يتم توجيه تلميح مشقوق صعودا لتجنب ثقب العدسة.
  5. حقن بعناية كبسولات باستخدام إبرة 27 G حادة تلميح تعلق على حقنة هاملتون في زاوية 45 درجة تحت الفحص البصري، مع التأكد من تجنب لمس العدسة مع الإبرة. إصابة العدسة سوف تؤدي إلى تشكيل إعتام عدسة العين. يجب أن تكون الكبسولات مرئية في الجسم الزجاجي باستخدام المجهر تشريح(الشكل 4A).
  6. بعد التراجع عن الإبرة ، عالج موقع الحقن بمراهم المضادات الحيوية neomycin وكبريتات البولي ميكسين B بالإضافة إلى مرهم المضادات الحيوية لطب العيون ديكساميثازون.
  7. تطبيق goniotaire hypromellose المُحلب ة محلول العيون (2.5%) إلى كلتا العينين لمنع القرنيات من الجفاف خلال فترة الانتعاش.
  8. ضع الماوس على وسادة تدفئة في 37 درجة مئوية وراقب حتى مستيقظة تمامًا.
  9. وينبغي حقن ناجحة من الخلايا ARPE-19 مغلفة تكشف عن وجود كبسولات سليمة في الغرفة الزجاجي للفأرة مع كميات طفيفة فقط من الحطام عند تصوير العين عن طريق التصوير المقطعي التماسك البصري أو أساليب أخرى(الشكل 4B).
  10. العين الفأرة حقن، بعد بضعة أيام من الانتعاش بسبب الجراحة، هو الآن على استعداد لنموذج التجريبية في متناول اليد.
    ملاحظة: يتم تصوير الإعداد الجراحي وتوثيق الكبسولات في العين في الشكل 3 والشكل 4، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

خلايا ARPE-19 هي خط خلية RPE بشرية خالدة تلقائيًا ثبت أنها قابلة للتغليف والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل عند زرع كبسولات في العين. وترد أدوات تغليف الذبحة الصدرية في الشكل 1. في هذه الدراسة ، ثبت أنه عند التغليف في الذبحة الصدرية ، تم تأكيد الخلايا الموجودة في كبسولات الذبحة الزاهية عن طريق التصوير في المجال الساطع(الشكل 2A). تم تنفيذ المقالات الحية الميتة على الخلايا داخل الكبسولات ، مما يدل على بقاء 90٪ بعد التغليف(الشكل 2B).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذه تقنية تغليف الخلية سريعة نسبيا وسهلة الأداء. ومع ذلك، يجب أن يوضع في الاعتبار بعض النقاط للحصول على نتائج دقيقة في المصب. وينبغي الحفاظ على الخلايا في الثقافة في طبق بيتري قبل التغليف وعقد في التقاء السليم. يجب إجراء التغليف في غطاء التهوية المناسب مع تدفق الهواء المنظم ، إذا كان ذلك ممكنًا. قوية جدا من التيار الجوي يمكن أن تؤثر على تشكيل كبسولة، وخاصة في التجارب على المدى الطويل. الأواني المعقمة والحلول ضرورية للحفاظ على المدى الطويل للخلايا داخل الكبسولة.

في الوقت الحاضر ، يستخدم تلطيخ ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم الدراسة جزئيًا من خلال المنح المقدمة إلى B. R. من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01EY019320) ووزارة شؤون المحاربين القدامى (RX000444 و BX003050) ومؤسسة ولاية كارولينا الجنوبية الذكية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3 مل حقنةBD309656
30 جم 1 "إبرة حادةتقنية التسريب SAIB30-100
ملح الصوديوم بحمض الألجنيك ، من الطحالب البنيةSigmaA0682
العين كبريتات الأتروبين (1٪)AkornNDC 17478-215-15لتوسيع حدقة
العين BD 1 مل حقنة 26 جم × 3/8 (0.45 مم × 10 مم)بيكتون ، ديكنسون و 309625 الشركةDG518105 500029609 REFلتوليد ثقب التوجيه
كلوريد الكالسيوم ، اللامائي ، الحبيبيSigmaC1016
GenTeal TearsAlconNDC 0078-0429-47لتليين العينين أثناء التخدير
Goniotaire: Hypromellose (2.5٪) محلول Demulcent العيون (معقم) AltairePharmaceuticals Inc.NDC 59390-182-13لتليين العينين أثناء التخدير
هاميلتون إبرة / حقنة نصيحة: 27 جم ، محور صغير RN NDL ، طول custum (12 مم) ، نمط النقطة 3 ، 6 / PKهاميلتون7803-01لتوصيل كبسولات داخل الجسم الزجاجي
حقنة هاميلتون: 2.5 وميكرو ؛ L ، موديل 62 RN SYR ، NDL يباع بشكل منفصلهاميلتون7632-01لتوصيل كبسولات HEPES المؤقت داخل الجسم الزجاجي
، 1 MFisher BiorecodesBP299100
مولد الجهد العاليESD EMC TechnologyES813-D20
LIVE / DEAD للبقاء / السمية الخلويةThermofisher ScientificL3224
L-Ornithine hydrochloride ، 99٪Alfa AesarA12111
كبريتات نيومايسين وبوليميكسين ب وديكساميثازون مرهم العينSANDOZNDC 61314-631-36مضاد حيوي لمنع العدوى بعد الحقن داخل الجسم الزجاجي
محلول العين الفينوليفرين هيدروكلوريد (2.5٪)AkornNDC 17478-201-15لتوسيع حدقة العين
كلوريد الصوديومSigmaS-5886
حقنة معقمة المرشحات ، 0.2 & mVWR28143-312
مضخة حقنةGRASEBYMS16A
محلول

المراجع

  1. Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
  2. Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
  3. Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
  4. Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817(2014).
  5. Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. , (2012).
  6. Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).
  7. Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).
  8. Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).
  9. Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).
  10. Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
  11. Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
  12. Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
  13. Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455(2012).
  14. Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3(2018).
  15. Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).
  16. Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313(2007).
  17. Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  18. Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).
  19. Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).
  20. Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6 (4), e19078(2011).
  21. Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290(2013).
  22. Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).
  23. Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).
  24. Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ARPE 19
تكنولوجيا الخلية المغلفة لتسليم البيولوجيا إلى العين الماوس
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.