يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد التدرجات المخدرات غير متجانسة عبر السكان السرطان على مسرّع تطور Microfluidic للمراقبة في الوقت الحقيقي

5.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60185

⸱

سبتمبر 19, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Princeton University, 2Johns Hopkins Medical Institute

في هذه المقالة

ملخص

نقدم نموذج السرطان على رقاقة microfluidic، تكنولوجيا "مسرّع التطور"، والتي توفر منصة يمكن التحكم فيها للدراسات الكمية في الوقت الحقيقي على المدى الطويل لديناميات السرطان ضمن ظروف بيئية محددة جيدا في الخلية الواحدة مستوي. ومن المتوقع أن تعمل هذه التكنولوجيا كنموذج في المختبر للبحوث الأساسية أو تطوير الأدوية قبل السريرية.

الملخص

لا تزال ثقافة الخلايا التقليدية النموذج ما قبل السريري الأكثر استخداما، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ بالنتائج السريرية في السرطان. وقد اقترحت نماذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة لسد الفجوة بين الثقافات التقليدية المفرطة في الأبعاد التقليدية ونماذج الحيوانات أكثر تعقيدا، والتي لديها قدرة محدودة على تحقيق نتائج كمية موثوقة وقابلة للاستنساخ. هنا، نقدم نموذج سرطان ميكروفلويديك على رقاقة التي تستنسخ المكونات الرئيسية للبيئة الدقيقة الورم معقدة بطريقة شاملة، ولكن بسيطة بما فيه الكفاية لتوفير أوصاف كمية قوية لديناميات السرطان. هذا النموذج microfluidic السرطان على رقاقة، "مسرع التطور"، ينهار مجموعة كبيرة من الخلايا السرطانية في مجموعة مترابطة من البيئات الدقيقة الورم في حين توليد المناظر الطبيعية الإجهاد العلاج الكيميائي غير متجانسة. ويمكن رصد تطور السرطان ودينامياته التطورية استجابة لتدرج المخدرات لأسابيع في الوقت الحقيقي، ويمكن إجراء العديد من التجارب النهائية المكملة للصور الفاصلة زمنيا التي التقطت خلال التجارب.

المقدمة

وقد أصبح من المسلم به على نحو متزايد أن السرطان نظام إيكولوجي معقد لا يعتمد فقط على استمرار خلل تنظيم مجموعات الخلايا المتحولة، بل أيضا على التفاعلات الحيوية بين الخلايا السرطانية والبيئة الصغرى المضيفة. وبهذا المعنى، يتطور السرطان على مشهد متكيف يتجلى في مجموعة من العوامل، بما في ذلك البيئة الدقيقة للورم غير المتجانس والتقاطع مع مجموعة متنوعة من الخلايا المضيفة، وكلها تساهم في ضغوط انتقائية لمزيد من الجينات أو التغيرات الجينيّة1،2،3. في سياق الأورام الصلبة، والتوزيع غير المتكافئ للعلاج الكيميائي وغيرها من التدرجات الموارد يساهم في عدم تجانسها الجزيئي، ويمكن أن تلعب دورا في تطوير مقاومة المخدرات، وزيادة تكوين الأوعية الدموية إلى ورم معين التجمعات السكانية الفرعية، وحتى الانبثاث4،5،6. التقليدية في المختبر 2D دراسات زراعة الخلايا، في حين تمتلك واسعة النطاق، والقدرة التجريبية مريحة، ويوفر متوسط الميدان، موحدة، وظروف ثابتة، وغالبا ما تفتقر إلى الرقابة البيئية المكانية والزمنية الدقيقة اللازمة حقا محاكاة في ديناميات الورم في الجسم الحي. وبالتالي، هناك حاجة إلى نماذج أكثر تمثيلا من الجسم الحي من أجل إعادة إنتاج البيئة الدقيقة الورم قبل النماذج الحيوانية في خط أنابيب تطوير المخدرات من أجل التنبؤ بشكل أفضل من تطور السرطان، فضلا عن الاستجابات للأدوية ضمن الإجهاد الديناميكي المناظر الطبيعيه. وقد تم اقتراح Microfluidics لسد الفجوة بين دراسات زراعة الخلايا 2D وأكثر تعقيدا في الدراسات الحيوانية الحية التي قد لا تكون قادرة على دعم الدراسات الكمية التي يمكن السيطرة عليها7،8،9.

يجب أن يمتلك النظام المثالي في المختبر لتوصيف ديناميات الخلايا السرطانية القدرة على توليد بيئة دقيقة غير متجانسة لمحاكاة الاستجابات الخلوية التكيفية التي قد تحدث في الورم، وكذلك السماح بمراقبة هذه الديناميات في دقة خلية واحدة. في هذه المقالة، ونحن نصف منصة ثقافة الخلية microfluidic، جهاز يستند إلى PDMS يسمى "مسرع التطور" (EA)، الذي يسمح للدراسات الموازية في المختبر من ديناميات الخلايا السرطانية في القرار الخلوي مع الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي على مدى على مدى أسابيع، مع الحفاظ على التدرجات من الإجهاد في جميع أنحاء المشهد الثقافي. ويستند تصميم هذه المنصة على عملنا السابق، الذي يمكن تسريع الديناميات التطورية للكائنات الحية في ميتاالسكان10،11. وعلى وجه التحديد، في مجموعة من المجموعات السكانية المنفصلة مكانيا التي تتفاعل على مستوى ما، عندما تتعرض لمشهد إجهاد غير متجانس، يمكن للأنواع الأكثر ملاءمة أن تهيمن على السكان المحليين بشكل أسرع مقارنة بسكان موحدين. ثم تهاجر الأنواع المفيدة إلى الموائل الصغرى المجاورة بحثاً عن الموارد والفضاء، وتهيمن في نهاية المطاف على جميع السكان. كما هو مبين في الشكل 1،يتكون نمط رقاقة EA microfluidic من (1) زوج من القنوات السربنتين التي توفر تداول وسائل الإعلام الجديدة وبناء ظروف حدود ثابتة لنشر المواد الكيميائية، و '2' منطقة زراعة الخلايا سداسية الذي يتكون من 109 غرف سداسية مترابطة و 24 غرف نصف سداسية في المركز، تشبه بنية قرص العسل. الرقاقة هي 100 ميكرومتر في العمق. ترتبط القنوات الإعلامية ومنطقة زراعة الخلايا بالشقوق الصغيرة (حوالي 15 ميكرومتر)، والتي تمنع التدفق المباشر لوسائل الإعلام وما ينتج عنذلك من إجهاد القص عبر منطقة زراعة الخلايا، ومع ذلك لا تزال تسمح للمواد الكيميائية بالانتشار من خلال الشقوق الصغيرة وتبادل المواد الغذائية، النفايات الأيضية، الخ. ويبين الشكل 1باءتوليد التدرجات الكيميائية، حيث تحتوي إحدى القنوات الإعلامية على 0.1 مليون متر من الفلورسين بينما تكون القناة الأخرى خالية من الفلورسين. يتم زراعة الخلايا على غشاء نفاذية الغاز، مغلفة من قبل الهياكل الدقيقة من خلال الضغط الخلفي الإيجابي على الغشاء ضد رقاقة. يتم توضيح مكونات حامل الجهاز في الشكل 2،ويتم توضيح الإعداد التجريبي في الشكل 3،حيث يتم الحفاظ على الثقافة على المجهر المقلوب عند 37 درجة مئوية، مع الرطوبة النسبية فوق 85٪، ومكيفة تحت تكوين غاز نورموكسيا.

يوفر هذا النظام مراقبة تفصيلية للتفاعلات الخلوية المترجمة عبر قنوات برايتفيلد والفلورسنت ويسمح باختبارات المصب التي تم حلها مكانياً مثل الفلورة المناعية أو البقعة الغربية أو قياس الطيف الكتلي. لقد أثبتنا سابقا كدليل على المبدأ من هذا النموذج سرطان microfluidic على رقاقة على الثقافة المشتركة على المدى الطويل من الظهارية وmesenchymal PC3 خلايا سرطان البروستاتا12، فضلا عن ظهور المخدرات المقاومة للعملاق متعدد البلويد الخلايا السرطانية باستخدام خط الخلية PC3 الظهارية13. في حين أننا نقدم تطبيق هذه المنصة لفهم ديناميات spatiotime من PC3 الظهارية وخلايا سرطان البروستاتا mesenchymal تحت تدرج الإجهاد من docetaxel، يمكن تطبيق نظام microfluidic بسهولة على أي مزيج من خطوط الخلايا والموارد (أي المخدرات والمغذيات والأكسجين) التدرجات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصنيع جهاز ميكروفلويديك

  1. توليد نمط microfluidic المطلوب باستخدام برنامج تصميم تخطيط (انظر المواد التكميلية).
  2. تلفيق قناع الصور. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. باستخدام كاتب الليزر، وكتابة نمط على لوحة الزجاج الصودا الجير المغلفة مع 100 نانومتر من Cr و 500 نانومتر من مقاومة الضوء AZ1518.
    2. تطوير مقاومة الضوء مع المطور AZ300MIF لمدة 60 s.
    3. حفر بعيدا الكروم دون حماية من مقاومة للضوء باستخدام Cr-7 الكروم Etchant.
    4. خلع قبالة مقاومة للضوء المتبقية باستخدام متجرد مقاومة للضوء في 70 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  3. نمط مقاومة للضوء. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. تدور معطف HMDS على رقاقة السيليكون في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 40 ق.
    2. تدور معطف مقاومة للضوء AZ4330 على رقاقة السيليكون في 4000 دورة في الدقيقة لمدة 40 ق.
    3. خبز لينة رقاقة السيليكون في 95 درجة مئوية لمدة 60 ق.
    4. الاستفادة من المحاذاة قناع لفضح الأشعة فوق البنفسجية إلى رقاقة السيليكون.
    5. تطوير مقاومة الضوء مع المطور AZ300MIF لمدة 4 دقائق.
  4. أداء DRIE النقش. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. الجافة حفر رقاقة منقوشة مع مقاومة للضوء باستخدام السيليكون العميق رد الفعل أيون النقش (DRIE) نظام لعمق 100 درجة مئوية.
    2. خلع قبالة مقاومة للضوء مع الأسيتون والبلازما حفر مع البلازما الخ.
  5. أكسدة رقاقة وsilanization. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. إجراء الأكسدة الحرارية على رقاقة السيليكون محفورة في فرن في 1100 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. انتظر رقاقة السيليكون لتبرد، ثم ضع الرقاقة في المجفف مع بضع قطرات من ثلاثي كلورو-1H،1H، 2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) ممزق في حاوية صغيرة بالقرب من رقاقة.
    3. ضخ ضغط المجفف إلى 0.5 أجهزة الصراف الآلي في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة. يجب أن يصبح قالب رقاقة السيليكون كارهة للماء بعد silanization السليم، والتي يمكن اختبارها عن طريق إضافة عدة قطرات من الماء على رقاقة.
  6. الطباعة الحجرية الناعمة. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. مزيج ما قبل البوليمر وعبر linker (من مجموعة بوليميثيل سيلوكسان (PDMS) في نسبة 10:1 حسب الوزن.
    2. صب PDMS مختلطة لخلق فيلم 10 ملم في الارتفاع على قالب رقاقة السيليكون silanized.
    3. Degas الناتجة PDMS-السيليكون رقاقة النظام في المجفف لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
    4. احتضان رقاقة PDMS السيليكون في حاضنة 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها لعلاج PDMS.
    5. مرة واحدة يتم الشفاء من PDMS، قشر فيلم PDMS قبالة رقاقة السيليكون بعناية.
    6. باستخدام إبر خزعة، لكمة من خلال الثقوب في منافذ مدخل على أساس موقع النمط على PDMS واستخدام لكمة دائرية لقطع رقائق 27 ملم في القطر.
  7. ربط طبقة PDMS.
    1. علاج الحرارة اثنين من أكوام من اسطوانات PDMS 27 ملم (دون النقش)، والتي سوف تصبح طبقة الخزان وطبقة السد من الجهاز.
    2. قطع اثنين من الدوائر 7 ملم حول مداخل على طبقة الخزان، واستخدام إبرة خزعة لكمة من خلال الثقوب في منافذ مدخل على طبقة السد.
    3. السندات ثلاثة أكوام من PDMS (مكدس منقوشة، طبقة الخزان، طبقة السد) مع العلاج البلازما الأكسجين.
    4. مع إبرة خزعة، لكمة من خلال الثقوب في منافذ والميناء المركزي للجهاز.

2. إعداد وسائل الإعلام وخط الخلية

  1. إعداد وسائل الإعلام لزراعة خطوط الخلايا PC3، بما في ذلك PC3-EMT وPC3-EPI: مزيج RPMI 1640 المتوسطة مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1X مضاد للمضادات الحيوية المضادة للنمو. إنشاء خطوط الخلايا كما هو موضحمسبقًا 14.
    ملاحظة: يتم الحفاظ على خطوط الخلايا PC3 في وسائل الإعلام المذكورة أعلاه في حاضنات رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2. انقسام الخلايا والثقافة الفرعية كل 3 أيام، قبل أن تصل إلى 100٪ من الملاءمة.
  2. خطوط الخلايا عبر fect مع علامات الفلورسنت السيتوبلازمية المسمى لتحسين التصور، كما هو موضح سابقا12، مثل أن PC3-EMT يعبر عن GFP السيتوبلازمية وPC3-EPI يعبر عن mCherry السيتوبلازمية. لاحظ أن التكنولوجيا متوافقة أيضًا مع أي خلايا ذات علامة فلورية بالإضافة إلى تصوير الحقل الساطع للخلايا غير المسماة.

3. الإعداد التجريبي

  1. تصنيع حامل لوحة معدنية
    1. اصنع حامل لوحة يكفي لعقد أطباق ثقافية متزامنة قابلة للنفاذ بالغاز للتجارب الموازية عن طريق الآلات أو الطباعة ثلاثية الأبعاد. ملف CAD 3D ("لوحة 3-جيدا. FCStd") يمكن العثور على GitHub كمرجع (https://github.com/kechihl/3-well-plate).
    2. فك مكونات حامل(الشكل 2)مع مفك البراغي. تطهير المكونات عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك هافي بيئة معقمة.
      ملاحظة: تم تصميم حامل لتوفير ظروف كبيرة للتوازن الحراري وتركيبات الغاز المثالي، مع مداخل قناة الغاز التي تسمح لتدفق الهواء. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في عملنا السابق12.
    3. إعداد ما يصل إلى ثلاثة أطباق ثقافة الغاز نفاذية، والتي غشاء ثقافة الخلية مرنة نسبيا.
  2. خلية خط البذر
    1. قبل 24 ساعة من بدء التجربة، قم بحصاد خلايا PC3-EPI وPC3-EMT عن طريق التجريب لمدة 5 دقائق.
    2. عد الخلايا من كل PC3-EPI وPC3-EMT باستخدام مقياس الهيموزيتومتر وعزل ما مجموعه 2.5 × 104 من كل نوع الخلية لكل طبق ثقافة الغاز نفاذية.
    3. خلط وإعادة تعليق نوعين من الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام الثقافة والبذور الخلايا في كل من طبق الثقافة الغاز نفاذية.
    4. ترك حامل لوحة كاملة في الحاضنة بين عشية وضحاها للخلايا لإرفاق.
    5. تطهير أجهزة PDMS عن طريق التعرض للأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة على الأقل وترك في بيئة معقمة.
  3. إنشاء وحدة التحكم الحراري ونظام إمدادات الغاز
    1. كما هو مبين في الشكل 3،إنشاء نظام إمدادات الغاز الذي يتكون من كل منثاني أكسيد الكربون وO2 وحدات التحكم، ومضخة الغاز، وغرفة خلط الغاز، ومرطب أو فقاعة، وثلاث مجموعات منفصلة من صمامات الغاز ومقاييس الضغط. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل في عملنا السابق12.
    2. إعداد وحدات التحكم CO2 و O2 بحيث تقوم بتعديل معدل خلط الغاز من خزانات CO2 و N2 ومصدر O2. وبدلاً من ذلك، فإن أي نظام لتوريد الغاز يوفر الغاز في ظل حالة نورموكسيا سيعمل.
    3. تأكد من أن الغاز الذي يتم دمجه في غرفة الخلط وترطيبه بواسطة فقاعة بحيث يتم زيادة الرطوبة النسبية تصل إلى 85٪ (كما تقرأ من جهاز مراقبة الرطوبة النسبية) وأن الغاز يؤدي إلى ثلاثة صمامات الغاز المستقلة مع مقاييس الضغط من أجل مراقبة ومراقبة معدل تدفق الغاز في حامل لوحة.
    4. ضع حامل اللوحة بالكامل في وحدة التحكم الحراري في الحضانة على خشبة المسرح مع وحدات فرعية منفصلة للتدفئة للغطاء واللوحة السفلية، مع تعيين جميع الوحدات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
  4. تركيب جهاز ميكروفلويديك. انظر جدول المواد للحصول على مزيد من التفاصيل.
    1. تحديد أن المكونات التفصيلية لحامل لوحة 3-جيدا هي في النظام، كما هو الحال في الشكل 2. كل من الآبار الثلاثة متطابقة ومستقلة، مع زوج من قنوات الغاز لكل بئر. كل بئر تمتلك حامل طبق ثقافة نفاذية الغاز، حامل رقاقة PDMS، حامل نافذة زجاجية، وزوج من النوافذ الزجاجية 35 ملم. ويمكن تجميع هذه المكونات باستخدام مسامير تركيبها.
      ملاحظة: تضمن النوافذ الزجاجية وجود مساحة معزولة حراريًا بين غشاء الثقافة القابل ة للنفاذ بالغاز والبئر بحيث لا يحدث تكثيف للمياه بسبب الاختلافات في درجة الحرارة في الواجهة. لاحظ أن الآبار الثلاثة مستقلة، ويمكن إجراء 3 تجارب بشكل منفصل.
    2. ما قبل الحارة وسط الثقافة في 37 درجة مئوية وdegas في غرفة فراغ لمدة 20 دقيقة.
    3. علاج رقائق PDMS باستخدام نظام البلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية من أجل الحفاظ على hydrophilicity.
    4. إعداد نظام الحقنة. تحميل اثنين من المحاقن ببطء مع وسائل الإعلام النمو وغيرها من المحاقن مع كاشف المطلوب من الاهتمام (وسائل الإعلام، وسائل الإعلام مع المخدرات، وما إلى ذلك). قم بتوصيل كل حقنة فردية بأنابيب مقاس 50 سم (0.020 بوصة × 0.060 بوصة OD) بواسطة إبرة صرف 23 G في دبوس واحد من الفولاذ المجوف. إدراج دبوس الصلب جوفاء في الطرف الآخر من الأنابيب.
    5. رئيس الأنابيب وإدراج دبوس الصلب في كل رقاقة PDMS من خلال طبقة السد. املأ طبقة الخزان وأبلى نمط طبقة نمط PDMS بالوسائط. تعمل طبقة الخزان كفخ فقاعة على رقاقة لمنع فقاعات الهواء من الدخول في نمط microfluidic.
    6. تحميل حقنة 1 مل مع وسائل الإعلام الثقافة. قم بتوصيل الحقنة بأنابيب مقاس 5 سم (0.020 بوصة × 0.060 بوصة OD) بواسطة إبرة صرف 23 G في دبوس واحد من الصلب المجوف. إدراج دبوس الصلب جوفاء في الطرف الآخر من الأنابيب ورئيس الأنابيب.
    7. إدراج دبوس الصلب جوفاء في ثقب مركز من رقاقة، حيث يمكن استخراج وسائل الإعلام المفرطة من رقاقة في وقت لاحق خلال عملية ختم رقاقة.
    8. كما يتطلب كل جهاز PDMS أربع محاقن 10 مل محملة على مضخة حقنة، تحميل اثنين من المحاقن 10 مل لكل رقاقة في سطح السفينة إلى الأمام. ضع المحاقن الأخرى في سطح السفينة سحب من نظام الحقنة.
    9. وضع رقاقة مباشرة على رأس الأغشية ثقافة الغاز نفاذية (مع الخلايا انضمت بالفعل إلى الأغشية). من أجل تجنب ربط الفقاعات الدقيقة في نمط microfluidic، الاستغناء عن 1 مل من وسائل الإعلام prewarmed وdegassed في طبق ثقافة الغاز 35 ملم نفاذية قبل التجمع، ومن ثم تأكد من أن رقاقة تقترب من السطح السائل مع زاوية الميل 15 درجة.
    10. قم بلصق طبق الثقافة القابل للنفاذ بالغاز والبئر في حامل طبق الثقافة القابل للنفاذ بالغاز لكل شريحة، مع دفع حامل رقاقة PDMS جهاز PDMS لأسفل.
    11. الشريط ورقة من السدادة على رأس جهاز PDMS والمشبك مع حامل رقاقة PDMS من أجل منع رقاقة من التجفيف.
    12. تعيين معدل تدفق الوسائط حول الصفيف ليكون 20 درجة مئوية/ ساعة.
    13. تعيين لوحة كاملة في حاضنة على خشبة المسرح على مرحلة آلية من المجهر المقلوب. ربط نظام إمدادات الغاز إلى قنوات الغاز والضغط على غشاء الثقافة نفاذية الغاز ضد رقاقة PDMS المثبتة لضمان ختم الجهاز. الحفاظ على ضغط المقياس عند 0.2 رطل لكل بوصة مربعة (1.4 × 104 باسكال).
    14. استخراج ببطء وسائل الإعلام المفرطة في رقاقة باستخدام حقنة 1 مل من ثقب المركز. مراقبة رقاقة تحت المجهر أثناء استخراج وسائل الإعلام ومن ثم التوقف عن استخراج عندما يتم ختم رقاقة. يجب أن يكون ختم رقاقة واضحة لأن جزءا من الخلايا سوف تسحق من قبل الهياكل الصغيرة.
    15. قم بتوصيل وحدة استشعار درجة الحرارة في الحاضنة على خشبة المسرح بلوحة 3 آبار ومجموعة إلى 37 درجة مئوية.

4. خلية واحدة التصوير الفاصل الزمني

  1. إعداد برنامج التصوير باستخدام المجهر المقلوب للحصول على صورة الفاصل الزمني. لاحظ أن المجهر الفلورسنت المقلوب مع مرحلة x-y الآلية بالكامل، مقبض التركيز، مصراع، ومكعبات فلتر مطلوب لتجربة EA.
  2. تكوين البرامج للحصول على الصور عبر قناتين في التكبير 10X لكل رقاقة مع التلقائي صورة خياطة بعد جولة واحدة من التركيز التلقائي. كن على علم بأن أنظمة التصحيح التلقائي مثل Perfect Focus لا تضمن جودة صورة مرضية. من المستحسن أكثر لتوليد سطح تركيز مخصص للحصول على صورة على المدى الطويل على أساس التركيز التلقائي أو التركيز اليدوي عبر الشريحة.
  3. التقاط الصور كل ساعة وترك التجربة تعمل على مقياس الوقت من الأسابيع. مراقبة جودة الصورة على أساس يومي وتحديث سطح التركيز إذا لزم الأمر.
  4. إعداد رقاقة PDMS والغاز نفاذية طبق الثقافة لتحليل المناعية اللاحقة، كما هو موضح سابقا13.

5 - معالجة الصور وتحليلها

  1. التجهيز بعد التجريبية
    1. تحويل الصور إلى تنسيق TIFF لمعالجة الصور والقياسات باستخدام فيجي /ImageJ.
    2. ضغط ملفات TIFF لتسهيل المزيد من معالجة الصور.
  2. فيجي/تحليل ImageJ
    1. لتحديد الخلايا، قم بإجراء الطرح في الخلفية وتحليل الجسيمات لتحديد البقع الساطعة الفلورية للكشف عن موقع الخلية والفرز التلقائي للخلايا.
    2. الاستفادة من الإضافات (تتبع دليل، Chemotaxis، أداة الهجرة، Trackmate) لتحليل حركية الخلية والهجرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التحقق من نمو الخلايا الأمثل على رقاقة
يتمثل أحد الأهداف الرئيسية لمنصة التجربة في إعادة إنتاج المكونات والتفاعلات الرئيسية في بيئة جزئية معقدة للورم بطريقة شاملة، ولكنها بسيطة بما يكفي لتوفير بيانات كمية وموثوقة ويمكن استنساخها. ولا يمكن تحقيق هذا الهدف إلا إذا كانت لدينا السيطرة الكاملة على العوامل البيئية الفيزيائية والكيميائية الحيوية. يجب علينا إما استبعاد العوامل غير المرغوب فيها أو إيجاد طريقة لدمج العوامل التي لا يمكن السيطرة عليها في النموذج الكمي لتفسير السلو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد وضعت ثقافة الخلايا التقليدية منذ ما يقرب من قرن من الزمان، ولا تزال النموذج ما قبل السريرية الأكثر استخداما في البحوث الطبية الحيوية، على الرغم من قدرتها المحدودة ثبت للتنبؤ النتائج السريرية في السرطان17. النماذج الحيوانية توفر أعلى الأهمية الفسيولوجية والتشابه الوراثي المعقول للبشر، ولكن منذ فترة طويلة تم الاعتراف بأن لديها قيود كبيرة في التنبؤ بالنتائج البشرية18. من بين جميع النماذج الموجودة قبل السريرية، يبدو أن نماذج السرطان على رقاقة microfluidic هي المرشح الأكثر و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يعلن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل NSF PHY-1659940.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10 مل BD Luer-Lok محاقن طرفBD14-823-16E
مضاد حيوي مضاد للفطرياتسيجما-ألدريتشA59551x مضاد مضاد
ل AZ 300 MIFMerck KGaA18441123163مطور مقاوم للضوء
AZ1518Merck KGaAAZ1518مقاوم للضوء
AZ4330ميرك KGaAAZ4330مقاوم للضوء
Cr Chromium EtchantSigma-Aldrich651826
مصل الأبقار الجنيني (FBS)شركة Life TechnologiesCorporation 10437028
هايدلبرغ DWL 66+ كاتب الليزرهايدلبرغ إنسترومنتسDWL66 +قناع ضوئي
للكتابة Hexamethyldisilazane (HMDS)Sigma-Aldrich379212لتعزيز الالتصاق مقاوم للضوء
دبابيس فولاذية مجوفةجديد أنبوب إنجلترا صغيرNE-1300-01 . 025 OD .017 معرف × .500 طويل / نوع 304 WD
تسخين كامل الآبار ، لوحات متعددة الآبار ، K-Frameibidi10929حاضنة على خشبة المسرح   ؛
Luer-Lok 23 G إبرة الاستغناءMcMaster-Carr75165A684لتوصيل المحاقن والأنابيب
طبق Lumox 35Sarstedt94.6077.331طبق ثقافة الخلايا المنفذ للغاز
Microposit Remover 1165Dow Electronic MaterialsMicroposit Remover 1165متجرد مقاوم للضوء
Microseal B لاصق السدادةBio-Rad LaboratoriesMSB1001 السدادة
O-Ring (لختم لوحة Lumox)McMaster-Carr9452K114Dash No. 27 ؛ 1-5 / 16 "ID × 1-7 / 16" OD ؛ Duro 70
O-Ring (لإغلاق النوافذ الزجاجية السفلية)McMaster-Carr9452K74Dash No. 20 ؛ 7/8 "معرف × 1" OD ؛ Duro 70
نظام تنظيف / نقش البلازما البلازماأنظمة البلازمات، Incبلازما الأكسجينالبلازما
RPMI 1640شركة Life TechnologiesCorporation 11875-093
Samco RIE800iPB DRIESamcoRIE800iPBنظام النقش الأيوني التفاعلي العميق
Suss MA6 محاذاة قناعSUSS MicroTecMA6محاذاة قناع  
سيلجارد 184 سيليكون المطاطفيشر ScientificNC9285739PDMS المطاط الصناعي
TePla M4L البلازما الحفرPVA TePlaM4Lالبلازما الحفر
Trichloro-1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS)Sigma-Aldrich448931لسيلان رقاقة السيليكون
Tygon أنبوب التجويف الصغير (0.020 "× 0.060" OD) أنابيبCole-ParmerEW-06419-01 لتوصيل الوسائط
نظام لاصق نظام الصناعي

المراجع

  1. Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
  2. Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
  3. Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
  4. Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
  5. Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214(2012).
  6. Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142(2015).
  7. Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
  8. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  9. Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
  10. Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
  11. Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
  12. Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001(2017).
  13. Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
  14. Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773(2013).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  17. Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
  18. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  19. Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
  20. Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
  21. Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  22. Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

شريحة ميكروفلويديك لمحاكاة السرطانتوليد تدرج دوائيالتصوير في الوقت الحقيقيتحليل هجرة الخلاياتتبع ديناميكيات المجموعات الخلويةاستزراع نفاذ للغازاتختم شريحة PDMSطريقة الختم بالضغطتجربة طويلة الأمد
توليد التدرجات المخدرات غير متجانسة عبر السكان السرطان على مسرّع تطور Microfluidic للمراقبة في الوقت الحقيقي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.