مقالة منهجية

بروتوكول إزالة الميكروسيرس من الليزر الذي ينتج RNA عالي الجودة من عظام الماوس الطازجة المجمدة

DOI:

10.3791/60197

⸱

سبتمبر 16, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Research, University of Veterinary Medicine Vienna

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير بروتوكول احتجاز الليزر microdissection (LCM) للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الخلايا من أي أنسجة صلبة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[رنا] عائد ة ونزاهة حاسمة ل [رنا] تحليل. ومع ذلك، غالباً ما يكون من الصعب من الناحية الفنية للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي في جميع أنحاء كامل ليزر التقاط microdissection (LCM) الإجراء. بما أنّ [لكم] دراسات يعمل مع [لوو كمّوتس] المادة, اهتمامات حول محدودة [رنا] غلة أيضا مهمّة. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام. تم تقييم تأثير بروتوكول تلطيخ، وسمك التبريد، وكمية الأنسجة المجهرية، ومجموعة استخراج الحمض النووي الريبي، ونظام LCM المستخدمة في العائد RNA والسلامة التي تم الحصول عليها من خلايا العظام microdissected. تم إجراء ثمانية ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة باستخدام فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار LCM التجارية. كانت العينة تقع بين غشاء تيريفثالات البولي إثيلين (PET) والفيلم اللاصق. وقد استخدم نظام LCM يستخدم الجاذبية لجمع العينات وطريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود للحصول على RNAs عالية الجودة ذات العائد الكافي. وتركز الدراسة الحالية على أقسام عظم الفخذ الماوس. ومع ذلك، يمكن استخدام بروتوكول LCM المبلغ عنه هنا لدراسة التعبير الجيني في الموقع في الخلايا من أي أنسجة صلبة في كل من الظروف الفسيولوجية وعمليات المرض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون الأنسجة من أنواع الخلايا غير المتجانسة والموزعة مكانياً. قد تستجيب أنواع الخلايا المختلفة في نسيج معين بشكل مختلف لنفس الإشارة. ولذلك، فمن الضروري أن تكون قادرة على عزل مجموعات محددة من الخلايا لتقييم دور أنواع الخلايا المختلفة في كل من الظروف الفسيولوجية والمرضية. يوفر استئصال الليزر الجزئي (LCM) طريقة سريعة ودقيقة نسبيًا لعزل وإزالة خلايا محددة من الأنسجة المعقدة1. تستخدم أنظمة LCM قوة شعاع الليزر لفصل الخلايا ذات الأهمية عن أقسام الأنسجة النسيجية دون الحاجة إلى المعالجة الأنزيمية أو النمو في الثقافة. وهذا يعني أن الخلايا في موطن الأنسجة الطبيعية، وأنه يتم الاحتفاظ بنية الأنسجة بما في ذلك العلاقة المكانية بين الخلايا المختلفة. يتم الحفاظ على مورفولوجيا كل من الخلايا التي تم التقاطها والأنسجة المتبقية بشكل جيد، ويمكن أخذ عينات من العديد من مكونات الأنسجة بالتتابع من نفس الشريحة. ويمكن بعد ذلك استخدام الخلايا المعزولة للتحليل اللاحق لمحتوى الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي أو البروتين أو المستقلب2و3.

من أجل تحليل التعبير الجيني في مختلف مجموعات الخلايا، أو بعد علاجات مختلفة، فمن الضروري الحصول على mRNAs من نوعية وكمية كافية للتحليل اللاحق4،5. على النقيض من الحمض النووي، RNAs هي أكثر حساسية للتثبيت ويوصى باستخدام الأنسجة المجمدة عندما يكون الهدف هو دراسة الحمض النووي الريبي. وبما أن هذه الحالات تتدهور بسرعة بسبب الريبونوكليس (RNase) في كل مكان، فإن هناك حاجة إلى شروط صارمة خالية من RNase أثناء مناولة العينات وإعدادها وتجنب تخزين العينات في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التقنيات السريعة دون أي خطوات مرحلة مائية طويلة هي حاسمة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي6. ويمكن أيضا أن تتأثر العائد RNA والنزاهة من قبل عملية LCM ونظام LCM المستخدمة7،8. حاليا، أربعة أنظمة LCM مع مبادئ التشغيل المختلفة متاحة2. طريقة استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أيضا أن تكون مهمة، منذ تم اختبار مجموعات العزل RNA مختلفة مع اختلافات كبيرة في كمية الحمض النووي الريبي ونوعية7،8.

أي طريقة لإعداد الأنسجة تتطلب إيجاد توازن بين الحصول على تباين مورفولوجي جيد والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي لمزيد من التحليلات. لإعداد أقسام المجمدة من العظام، تم تطوير فيلم لاصق وتحسينها باستمرار9. يتم قطع أقسام العظام وملطخة مباشرة على فيلم لاصق. هذا الفيلم لاصق ينطبق على العديد من أنواع تلطيخ، ويمكن استخدامها لعزل الخلايا ذات الفائدة من استئصال التبريد العظام باستخدام LCM9،10،11،12،13، 14. جميع الخطوات بما في ذلك الإزالة الجراحية، والتضمين، وتجميد، وقطع وتلطيخ يمكن أن تكتمل في أقل من ساعة واحدة. الأهم من ذلك، يمكن تحديد الخلايا مثل osteoblasts، خلايا بطانة العظام، وosteoclasts بوضوح9،10،11، 12،13،14. هذه الطريقة لديها ميزة كونها سريعة وبسيطة. وهناك طريقة بديلة لتوليد العظام التبريد هو استخدام نظام نقل الشريط15. ومع ذلك، فإن هذه التقنية الأخيرة هي أكثر استهلاكا للوقت وتتطلب أجهزة إضافية، حيث أن الأقسام يجب أن تنقل من شريط لاصق على الشرائح غشاء المغلفة مسبقا عن طريق الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) عبر الربط. على الرغم من أن نظام نقل الشريط قد اقترن بنجاح مع LCM16،17،18،19،تجدر الإشارة إلى أن طلاء عبر مرتبطة يمكن أن تخلق نمط الخلفية التي يمكن أن تتداخل مع خلية من نوع تعريف20.

عادة، يتم استخراج كميات صغيرة فقط من الحمض النووي الريبي من الخلايا المجهرية، وغالبا ما يتم تقييم نوعية وكمية الحمض النووي الريبي بواسطة الكهربائي الشعيرات الدقيقة21. يتم استخدام برنامج كمبيوتر لتعيين فهرس الجودة لمقتطفات RNA يسمى رقم تكامل RNA (RIN). تشير قيمة RIN البالغة 1.0 إلى الحمض النووي الريبي المتدهور تمامًا، بينما تشير قيمة 10.0 إلى أن الحمض النووي الريبي سليم تمامًا22. عادة, اعتبرت فهرسات على 5 كاف ل [رنا] دراسات. وقد تم الإبلاغ عن أنماط التعبير الجيني في عينات تبلغ قيمتها RIN 5.0-10.0 لترتبط بشكل جيد مع بعضها البعض23. على الرغم من أن حساسية هذه الطريقة عالية، حيث يمكن الكشف عن أقل من 50 pg/μL من إجمالي الحمض النووي الريبي، فإنه يمكن أن يكون من الصعب جدا الحصول على تقييم الجودة إذا كان تركيز الحمض النووي الريبي في العينة منخفض جدا. لذلك، من أجل تقييم جودة الحمض النووي الريبي، وغالبا ما يستخدم قسم الأنسجة المتبقية بعد LCM لاستخراج RNA، عن طريق أنبوب العازلة على الشريحة24.

على الرغم من أن LCM قد استخدمت على نطاق واسع على أنسجة مجمدة مختلفة، نادرا ما يتم الإبلاغ عن قيم RIN من RNAs المستخرجة. وعلاوة على ذلك، لا توجد دراسات مقارنة لتوضيح الطريقة الأنسب لدراسة الحمض النووي الريبي في عظام الماوس. في هذه الدراسة، تم استخدام أقسام مجمدة من عظم الفخذ الماوس الكبار لتحسين إعداد العينة، بروتوكول LCM واستخراج الحمض النووي الريبي من أجل الحصول على جودة عالية RNAs. وقد تم تحسين هذا البروتوكول بشكل خاص بالنسبة لنظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت أنسجة العظام من الفئران في التقيد الصارم مع المبادئ التوجيهية السائدة لرعاية الحيوانات، وبذلت جميع الجهود للحد من معاناة الحيوانات.

1. الحيوانات وتجميد التضمين

  1. منزل الحيوانات في ظروف من درجة حرارة الغرفة ثابتة (RT؛ 24 درجة مئوية) ودورة مظلمة 12 ساعة/ 12 ساعة مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء.
    ملاحظة: تم الحصول على أنسجة العظام في هذه الدراسة من 3 أشهر من الذكور من النوع البري C57BL/6 الفئران.
  2. في النيوروبسوبيك، الفئران exsanguinate من الوريد في البطن كافا تحت التخدير العام (الكيتامين / xylazine، 100/6 ملغ / كغ داخل اقبية).
    ملاحظة: من أجل تجنب تدهور الحمض النووي الريبي، استخدم الأدوات والمواد الخالية من RNase، وارتداء القفازات والعمل بسرعة تجنب تخزين العينات في RT طوال التجربة بأكملها.
  3. إزالة عظم الفخذ كله بسرعة، وتنظيفها من الأنسجة الرخوة المحيطة باستخدام مشرط والمناشف الورقية. صب درجة الحرارة المثلى (OCT) مركب في القالب التضمين، ووضع عظم الفخذ في الجزء السفلي من العفن التضمين. التقط تجميد العينات في النيتروجين السائل. OCT شفافة في RT والأبيض عندما المجمدة.
  4. مرة واحدة المجمدة تماما، والتفاف العينات في احباط ونقلها على الجليد الجاف إلى -80 درجة مئوية. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

2- إعداد القسم

  1. تعيين درجة الحرارة في cryostat إلى -19 درجة مئوية وصاحب كتلة إلى -17 درجة مئوية. مسح الداخلية cryostat باستخدام الإيثانول 70٪. ضع النصل المتاح للأنسجة الصلبة، والشرائح الزجاجية وأداة تركيب في cryostat لتبرد. أبقهم داخل الـ(كريوستات) طوال فترة الاستئصال
  2. نقل كتلة الأنسجة المجمدة على الجليد الجاف إلى cryostat والسماح لها بالتوازن لمدة 10 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: تجنب الذوبان المتكرر وركوب الدراجات المتكررة من كتلة واحدة من -80 درجة مئوية إلى -19 درجة مئوية للتشريح بالتبريد.
  3. اضغط على الجزء السفلي من القالب تضمين لدفع كتلة OCT للخروج من القالب. تطبيق ما يكفي من OCT المتوسطة إلى صاحب كتلة التمسك كتلة لذلك. انتظر حتى يتم تجميد وسيطة OCT بالكامل.
  4. ضع حامل الكتلة في حامل الكائن وتشديده في مكانه. ضبط موقف شفرة وتقليم كتلة باستخدام 15 درجة مئوية قطع الزيادات لإزالة OCT تغطي العينة. إذا تم قطع العينة في وقت سابق وتعرض السطح للهواء، تخلص من أول مقاطع أنسجة 2-3 من الكتلة.
  5. ضبط الكريوستات لتوليد 8 أقسام ميكرومتر وقطع 2-3 المقاطع المبردة التي سيتم التخلص منها (القلة الأولى عادة ما تكون أكثر سمكا من 8 ميكرومتر). وضع الفيلم لاصقة على كتلة واستخدام أداة المناسب لالتمسك الفيلم إلى كتلة. جعل خفض ببطء وبسرعة ثابتة عقد القسم من قبل الفيلم.
  6. ضع الفيلم (العينة التي تواجه) على الفور على شريحة زجاجية مبردة مسبقا (على شريط التبريد داخل cryostat) لتجنب ذوبان العينة. استخدام الشريط لإصلاح الفيلم إلى الشريحة الزجاجية لتسهيل تلطيخ. المضي قدما على الفور مع بروتوكول تلطيخ.

3. بروتوكول تلطيخ سريع

  1. إعداد 40 مل من الحلول التالية في أنابيب 50 مل ووضعها على الجليد: 95٪ الإيثانول، RNase خالية من المياه، 100٪ الإيثانول، 100٪ الإيثانول و 100٪ إكسيلين. تنفيذ جميع الخطوات على الجليد (باستثناء تلطيخ). لكل يوم تجريبي، قم بإعداد جميع الكواشف المائية الطازجة مع المياه الخالية من RNase.
    تحذير: العمل في غطاء محرك السيارة لتجنب التسمم من قبل الزيلين.
  2. أقسام الحضانة لمدة 30 s في 95٪ الإيثانول، ثم تراجع أقسام 30 s في المياه الخالية من RNase لإزالة OCT بعناية وتماما والتي قد تتداخل مع LCM وتطبيقات المصب.
  3. الاستغناء عن 50 درجة مئوية من البقع التجارية LCM القسم المجمدة(جدول المواد)على القسم، وحضانة لمدة 10 ثانية في RT واستنزاف من خلال وضع حافة الشريحة على ورقة الأنسجة ماصة. إزالة وصمة عار الزائدة عن طريق الرينز 30 s في الإيثانول 100٪.
  4. تزج أقسام العظام في أنبوب الثاني مع الإيثانول 100٪ لمدة 30 ثانية ونقلها إلى 100٪ إكسيلين لمدة 30 ثانية.
  5. وضع فيلم لاصق (عينة تواجه ما يصل) على الشريحة الزجاجية الجافة كدعم. الحرص على أن الفيلم لا تتأثر ووضعها مسطحة قدر الإمكان. لا تسمح للعينة أن تجف تماما.
  6. وضع شريحة إطار غشاء PET على ذلك. قريبا اضغط على إصبع القفاز على الغشاء لإرفاقه إلى الفيلم. ثم تقع العينة بين الغشاء والفيلم لاصقة. لا ينبغي طي الفيلم لاصقأو التجاعيد، وينبغي أن يكون هناك أي فقاعات الهواء بين الفيلم والغشاء. المضي قدما على الفور مع LCM.

4. الليزر التقاط قسم الميكروديس

  1. تنظيف المرحلة وحامل الغطاء من RNase باستخدام سطح decontaminant(جدول المواد). قم بتحميل الشريحة والقبعات في حامل الشريحة وحامل الغطاء، على التوالي.
  2. ضبط التركيز والحصول على نظرة عامة على الشريحة مع هدف 1.25x. تغيير إلى الهدف 40x وضبط التركيز. اختر منطقة الاهتمام باستخدام نظرة عامة على الشريحة. ضبط معلمات الليزر على النحو التالي: فتحة، 7؛ الليزر السلطة، 60؛ السرعة، 5؛ نبض التردد، 201؛ عينة ميزان, 20. تحسين هذه المعلمات لكل هدف.
  3. إذا فشل الليزر في قطع العينة، قم بزيادة طاقة الليزر. بدلا من ذلك، يمكن تطبيق الليزر أكثر من مرة. وبالإضافة إلى ذلك، فحص الهدف لبقع من تخفيضات غير مكتملة وإعادة رسم الخط في هذه البقع باستخدام الخيار نقل وقطع. حفظ إعدادات الليزر لتشريح الشرائح اللاحقة.
  4. حدد osteoblasts، osteocytes وخلايا بطانة العظام في العظام الفخذية البعيدة الملغاة أو القشرية على أساس معايير مورفولوجية. رسم خط لمسار الليزر بعيدا عن الخلايا المستهدفة لتقليل الضرر من أشعة الشمس فوق البنفسجية. قم بإجراء جميع عمليات الاستئصال الدقيقة في غضون أقل من ساعة واحدة بعد التلطيخ.
  5. جمع كل نوع الخلية في غطاء منفصل من أنبوب 0.5 مل.
    ملاحظة: قد يؤدي الالتقاط الجاف بدلاً من استعادة السوائل إلى تجنب تدهور الحمض النووي الريبي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتبخر كميات صغيرة جدا من العازلة الواردة في غطاء أنبوب الطرد المركزي الصغير أو تتبلور (اعتمادا على تكوينها) خلال LCM.
  6. تأكد من نجاح التقاط بواسطة مراقبة غطاء أنبوب التجميع بعد LCM حيثما ينطبق ذلك. المضي قدما على الفور مع استخراج الحمض النووي الريبي.

5. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. الاستغناء عن 50 ميكرولتر من العازلة lysis التي تحتوي على β-mercaptoethanol في غطاء أنبوب جمع وlyse العينة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا في الغطاء لمدة 1 دقيقة. إذا كانت عدة قبعات ستكون مجمعة، والحرص على أن الحجم الإجمالي للمخزن المؤقت هو كما هو موصى به لمجموعة استخراج RNA(جدول المواد).
    تحذير: يجب إضافة β-mercaptoethanol لحماية الحمض النووي الريبي من التدهور، ولكن يعتبر ساما. ارتداء الملابس الواقية والقفازات والعمل في غطاء محرك السيارة.
  2. وبالإضافة إلى ذلك، لكل شريحة إعداد واحد المسمى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الصغير مع 350 درجة مئوية من العازلة lysis التي تحتوي على β-mercaptoethanol. استخدم المقاطع المتبقية بعد LCM لاستخراج الحمض النووي الريبي. فصل بعناية الفيلم من الغشاء وlyse العينة عن طريق الأنابيب ببطء العازلة lysis على القسم عدة مرات.
    ملاحظة: يجب أن يكون المبلغ الإجمالي للمخزن الاحتياطي للمل 350 درجة مئوية. لا تستخدم كل ذلك في وقت واحد للهضم كما أنها سوف تتدفق من الشريحة.
  3. وضع عينات lysate على الجليد الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة:     يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
  4. إذابة الليسات في RT. نقل lysates من الخلايا التي يتم حصادها LCM من أنابيب جمع في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. إذا تم استخدام أكثر من غطاء واحد لحصاد العينة، تجمع العديد من lysates.
  5. استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. علاج الأعمدة مع DNase الأول لإزالة الحمض النووي الجيني. الحمض النووي الريبي Elute مع 14 ميكرولتر من المياه الخالية من RNase، مما أدى إلى 12 ميكرول eluate. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

6. قياس العائد RNA والنزاهة

  1. ذوبان الحمض النووي الريبي على الجليد الرطب. قياس العائد وسلامة RNA معزولة باستخدام الكهربائي الشعيرات الشعرية الدقيقة. تحميل إجمالي RNA (1 ميكرولتر لكل عينة) في رقاقة(جدول المواد)وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالي الجودة لتحليل التعبير الجيني في خلايا العظام من عظم الفخذ الماوس. في البروتوكول الأمثل، تم قطع 8 ميكرومتر سميكة أقسام العظام المجمدة على فيلم لاصق وملطخة باستخدام بروتوكول سريع لوصمة عار القسم المجمدة LCM التجارية. وكانت العينة تقع بين غشاء PET والفيلم لاصقة. تم تشريح خلايا عظم الماوس باستخدام نظام LCM الذي يستخدم الجاذبية لجمع العينات. تم استخدام طريقة استخراج الحمض النووي الريبي المستندة إلى العمود للحصول على RNA عالية الجودة من العائد الكافي. تم ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تتأثر كل من نوعية وكمية الحمض النووي الريبي سلبا في جميع مراحل إعداد العينة مثل التلاعب في الأنسجة، عملية LCM، واستخراج الحمض النووي الريبي. ولذلك، تم تطوير بروتوكول LCM للحصول على كمية كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل التعبير الجيني اللاحقة.

بالنسبة لـ LCM، تستخدم معظم المختبرات الأقسام 7-8 ميكرومتر سميكة2. ومن شأن أقسام أكثر سمكا تسمح حصاد المزيد من المواد. ومع ذلك، إذا كانت سميكة جدا، وهذا يمكن أن يقلل من القرار المجهري والليزر قد لا تكون قادرة على قطع من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر المؤلفان أوتي زيتز ونيكول جينر على مساعدتهما التقنية الممتازة، فضلاً عن موظفي فيتكور ومراقبة الحيوانات على دعمهما.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-MercaptoethanolSigma63689-25ML-F
الإيثانول المطلق EMPLURAMerck Millipore8،18،76،01،000
فيلم لاصق (فيلم LMD)Section-LabC-FL001
Agilent 2100 نظام التحليل الحيويAgilent RNA
6000 Pico Chip KitAgilent Technologies5067-1513
Arcturus HistoGene Staining SolutionApplied Biosystems12241-05
أداة تركيب CryofilmSection-LabC-FT000
Cryostat Leica CM 1950Leica Biosystems
شرائح مجهر زجاجي ، مقطوع اللون برتقالي بلوريVWR علومالحياة 631-1559
أنسجة الأنسجة PVCMEDITE48-6302-00
LMD7  الليزر  Mikrodissektion  نظامLeica Microsystems
شفرات Microtome منخفضة المستوى Leica DB80 XLLeica Biosystems14035843496
مياه خالية من NucleaseVWR Life ScienceE476-500ML
شرائح غشاء PET 1.4 & mu ؛ مالآلات الجزيئية & Industries GmbH50102
RNase Away مزيل التلوث السطحيالمنتج الحيوي الجزيئي7002
RNeasy Micro KitQiagen74004
Tissue-Tek درجة حرارة القطع المثلى (OCT) مركبساكورا فينيتيك4583
زيلينVWR علوم الحياة2،89،73،363
قوالب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  2. Legres, L. G., Janin, A., Masselon, C., Bertheau, P. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research. American journal of Cancer Research. 4 (1), 1-28 (2014).
  3. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  4. Kerman, I. A., Buck, B. J., Evans, S. J., Akil, H., Watson, S. J. Combining laser capture microdissection with quantitative real-time PCR: effects of tissue manipulation on RNA quality and gene expression. Journal of Neuroscience Methods. 153 (1), 71-85 (2006).
  5. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).
  6. Golubeva, Y. G., Warner, A. C. Laser Microdissection Workflow for Isolating Nucleic Acids from Fixed and Frozen Tissue Samples. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 33-93 (2018).
  7. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized Method for Robust Transcriptome Profiling of Minute Tissues Using Laser Capture Microdissection and Low-Input RNA-Seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  8. Garrido-Gil, P., Fernandez-Rodríguez, P., Rodríguez-Pallares, J., Labandeira-Garcia, J. L. Laser capture microdissection protocol for gene expression analysis in the brain. Histochemistry and Cell Biology. 148 (3), 299-311 (2017).
  9. Kawamoto, T., Kawamoto, K. Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1130, 149-164 (2014).
  10. Streicher, C., et al. Estrogen Regulates Bone Turnover by Targeting RANKL Expression in Bone Lining Cells. Scientific Reports. 7 (1), 6460(2017).
  11. Vaidya, M., et al. Osteoblast-specific overexpression of amphiregulin leads to transient increase in femoral cancellous bone mass in mice. Bone. 81, 36-46 (2015).
  12. Jay, F. F., et al. Amphiregulin lacks an essential role for the bone anabolic action of parathyroid hormone. Molecular and Cellular Endocrinology. 417, 158-165 (2015).
  13. Murali, S. K., Andrukhova, O., Clinkenbeard, E. L., White, K. E., Erben, R. G. Excessive Osteocytic Fgf23 Secretion Contributes to Pyrophosphate Accumulation and Mineralization Defect in Hyp Mice. PLoS Biology. 14 (4), e1002427(2016).
  14. Andrukhova, O., Schüler, C., Bergow, C., Petric, A., Erben, R. G. Augmented Fibroblast Growth Factor-23 Secretion in Bone Locally Contributes to Impaired Bone Mineralization in Chronic Kidney Disease in Mice. Frontiers in Endocrinology. 9, 311(2018).
  15. Golubeva, Y. G., Smith, R. M., Sternberg, L. R. Optimizing Frozen Sample Preparation for Laser Microdissection: Assessment of CryoJane Tape-Transfer System®. PLoS ONE. 8 (6), e66854(2013).
  16. Pacheco, E., Hu, R., Taylor, S. Laser Capture Microdissection and Transcriptional Analysis of Sub-Populations of the Osteoblast Lineage from Undecalcified Bone. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1723, 191-202 (2018).
  17. Nioi, P., et al. Transcriptional Profiling of Laser Capture Microdissected Subpopulations of the Osteoblast Lineage Provides Insight Into the Early Response to Sclerostin Antibody in Rats. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (8), 1457-1467 (2015).
  18. Taylor, S., et al. Differential time-dependent transcriptional changes in the osteoblast lineage in cortical bone associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone Reports. 8, 95-103 (2018).
  19. Taylor, S., et al. Time-dependent cellular and transcriptional changes in the osteoblast lineage associated with sclerostin antibody treatment in ovariectomized rats. Bone. 84, 148-159 (2016).
  20. Martin, L. B. B., et al. Laser microdissection of tomato fruit cell and tissue types for transcriptome profiling. Nature Protocols. 11 (12), 2376-2388 (2016).
  21. Imbeaud, S., et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces. Nucleic Acids Research. 33 (6), e56(2005).
  22. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  23. Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42(2014).
  24. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11, 95(2010).
  25. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols. Murray, G. I. , Humana Press. New York, NY. 1-17 (2018).
  26. Burgemeister, R., Gangnus, R., Haar, B., Schütze, K., Sauer, U. High quality RNA retrieved from samples obtained by using LMPC (laser microdissection and pressure catapulting) technology. Pathology, Research and Practice. 199 (6), 431-436 (2003).
  27. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  28. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  29. Kölble, K. The LEICA microdissection system: design and applications. Journal of Molecular Medicine. 78 (7), B24-B25 (2000).
  30. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. The American Journal of Pathology. 151 (1), 63-67 (1997).
  31. Micke, P., et al. A fluid cover medium provides superior morphology and preserves RNA integrity in tissue sections for laser microdissection and pressure catapulting. The Journal of Pathology. 202 (1), 130-138 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Laser Capture MicrodissectionRNA ExtractionMouse Bone SectionsCryosection PreparationStaining ProtocolGravity based LCM SystemColumn based RNA ExtractionMicrocapillary ElectrophoresisRIN Value AnalysisBone Cell Isolation

مقالات ذات صلة