مقالة منهجية

توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم الصفراوي وهندستها إلى مجموعات اصطناعية للعلاج الجيني

DOI:

10.3791/60215

⸱

أكتوبر 4, 2019

 , 
1Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital-Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصف هنا هو بروتوكول لتوصيف وحدات miRNAs التازر بيولوجيا وتجميعها في الجينات القصيرة ، والذي يسمح التعبير الفوقي في وقت واحد لتطبيقات العلاج الجيني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الاهميه البيولوجية ميكرورناس (miRNAs) في مجال الصحة والمرض تعتمد بشكل كبير علي مجموعات محدده من العديد من المحررين في وقت واحد miRNAs بدلا من عمل ميرنا واحده. وصف هذه الوحدات miRNAs محدده خطوه أساسيه في تعظيم استخدامها في العلاج. وهذا أمر مهم للغاية لأنه يمكن استغلال سماتهم التوافقية عمليا. وصفت هنا هو طريقه لتحديد توقيع ميرنا محدده ذات الصلة للسيطرة علي المتحكمين الكروماتين في الورم الارومي. يعرف النهج أولا مجموعه عامه من miRNAs التي يتم تحريرها في الأورام بالمقارنة مع الانسجه العادية. ويتم صقل التحليل بشكل أكبر من خلال الظروف الثقافية التفاضلية ، مما يؤكد وجود مجموعه فرعيه من miRNAs التي يتم التعبير عنها بشكل متزامن اثناء الولايات الخلوية المحددة. وأخيرا ، فان miRNAs التي ترضي هذه المرشحات يتم دمجها في الجينات الاصطناعية متعددة الخلايا ، والتي تقوم علي سقالة من الجينات الموجودة بشكل طبيعي المجموعات ميرنا ، ثم تستخدم للتعبير المفرط من هذه الوحدات ميرنا في الخلية المتلقية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mirnas توفر فرصه لا مثيل لها لتطوير نهج العلاج الجيني واسعه لكثير من الامراض1،2،3، بما في ذلك السرطان4،5. ويستند هذا علي العديد من السمات الفريدة لهذه الجزيئات البيولوجية ، بما في ذلك حجمها الصغير6، التكوين الحيوي البسيط7، والميل الطبيعي للعمل في الرابطة8. وتتميز العديد من الامراض بأنماط التعبير ميرنا محدده ، والتي غالبا ما تتلاقي علي تنظيم الوظائف البيولوجية المعقدة9. والغرض من هذا الأسلوب هو أولا لتحديد استراتيجية لتحديد مجموعات miRNAs التي هي بالتازر ذات الصلة لوظائف خلوية معينه. التالي ، فانه يوفر استراتيجية لأعاده إنشاء مثل هذه التركيبات في الدراسات والتطبيقات النهائية.

هذا الأسلوب يسمح للتحليل الوظيفي للعديد من miRNAs في وقت واحد ، والاستفادة من استهدافهم في وقت واحد من عدد كبير من mRNAs ، التالي تلخيص المناظر الطبيعية المعقدة من الامراض. وقد استخدم هذا النهج مؤخرا لتحديد مجموعه من ثلاثه mirnas ان 1) هي في وقت واحد دوونريجولاتيد في سرطان المخ و 2) تظهر نمط التعبير المشترك قويه خلال التمايز العصبي وكذلك ردا علي الإجهاد الجيني من قبل الإشعاع أو الحمض النووي عامل الالكل. التوافقية أعاده التعبير عن هذه الوحدة من ثلاثه miRNAs بواسطة طريقه التجميع الموصوفة أدناه النتائج في التدخل العميق مع بيولوجيا الخلايا السرطانية ويمكن استخدامها بسهوله كاستراتيجية العلاج الجيني للدراسات قبل السريرية10. وقد يكون هذا البروتوكول ذا اهميه خاصه بالنسبة لأولئك المشاركين في بحوث ميرنا وتطبيقاتها الانتقالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توصيف miRNAs المرتبطة وظيفيا في الورم المفلطح

  1. تحليل التعبير ميرنا التفاضلي الواسع في الورم الدمى مقابل المخ
    1. أولا ، تحديد الأكثر بشكل ملحوظ التي حررت miRNAs في الورم. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام ثلاث طرق مختلفه علي الأقل:
      1. منجم السرطان الجينوم الأطلس ، وجدت في https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga ، لتسلسل البيانات11.
      2. اجراء تحليل ميكروصفيف من عينه المنطوق جديده12.
      3. استخدام مجموعات البيانات المنشورة سابقا13.
        ملاحظه: أيا كان الأسلوب الذي يتم اختياره ، يوفر الإخراج مجموعه كبيره من miRNAs التي يرتبط التعبير إحصائيا (اما مباشره أو عكسيا) مع علم الاحياء الورم. هذه المجموعة الاوليه تشكل تجمع miRNAs التي يتم تحليلها بشكل أكبر لتحديد مجموعه فرعيه من miRNAs عرض الرابطة الوظيفية الأكثر صرامة من خلال اجراء تحليل أكثر ديناميكية من التغييرات التعبير ، كما هو موضح أدناه.
  2. تحليل تعبير ميرنا الخاص بالحالة
    1. استقراء من خليه تمييز:
      1. استخدام الاطباق البلاستيكية المغلفة مسبقا بولي دي يسين (PDL) لصالح تشكيل ثقافة أحاديه الطبقة. لطلاء الطبق ، ذوب PDL في الماء بتركيز 100 ميكروغرام/مل. استخدام 1 مل من الحل لكل 25 سم2 السطح. شطف 2x مع برنامج تلفزيوني 6 ح بعد تطبيق الحل PDL.
      2. لوحه الخلايا الجذعية العصبية البشرية في كميات متساوية (100,000 خلايا/5 مل) اما في الخلايا الجذعية المتوسطة (المتوسطة العصبية + B27 الملحق + 20 نانوغرام/مل EGF/FGF) ، التمايز الفلكي المتوسط (DMEM + 10 ٪) ، أو التمايز العصبية المتوسطة الملحق ، + 2 μM حمض الريتينويك)14. البروتوكول ل اوليجوديندروسيتي التمايز يتطلب أضافه igf-1-1 (200 ng/mL) بعد egf/fgf أزاله14،15.
      3. بعد الطلاء الخلية ، ومكان في حاضنه لمده 1 أسبوع في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
    2. استخراج RNA:
      1. بعد 7 أيام ، وأزاله الخلايا من الحاضنة وأزاله المتوسطة.
      2. غسل الخلايا مع تلفزيوني (5 مل). ثم ، أضافه 1 مل من كاشف تحلل (انظر جدول المواد) لlyse الخلايا وكشط الخلايا إلى 1.5 mL أنبوب microfuge باستخدام مكشطه الخلية. الحفاظ علي الأنابيب التي تحتوي علي خلايا تفكيك في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 5 دقائق.
      3. المضي قدما إلى عزل الحمض الريبي النيبالي الإجمالي بعد تعليمات الشركة المصنعة.
    3. تحليل التعبير ميرنا:
      1. قياس التعبير التفاضلي من miRNAs محدده المحددة في الخطوة 1.1 بين أنماط التمايز الثلاثة من قبل PCR في الوقت الحقيقي ، وذلك باستخدام مجسات تقي واتباع بروتوكولات الشركة المصنعة للنسخ العكسي وتضخيم PCR ( الشكل 1).
  3. التحقق من صحة مجموعات ميرنا حسب التحديات الخاصة بالإجهاد
    1. الثقافة G34 الخلايا الجذعية مثل الجذع في المتوسطة العصبية + B27 الملحق + 20 ng/mL EGF/FGF. تبدا مع 1 × 106 خلايا في 5 مل في 25 سم2 قارورة منخفضه المرفقات.
    2. بدءا من 48 ساعة بعد الطلاء ، أضافه تركيزات مضاعفه من الحمض النووي temozolomide عامل (TMZ) كل 5 أيام ، علي النحو التالي:
      1. تبدا مع 5 μM لمده 5 أيام. بعد 5 أيام ، وأزاله المتوسطة واستبدال مع المتوسطة الطازجة دون temozolomide ، للسماح للخلايا علي قيد البقاء للتعافي. بعد 48 h ، أضافه 10 μM TMZ واحتضان لمده 5 أيام أخرى.
      2. كرر الخطوة 1.3.2.1 ، مضاعفه تركيز TMZ في كل مره ، حتى يتم الوصول إلى تركيز ما لا يقل عن 100 μM وتصبح الخلايا مقاومه للدواء10.
    3. في تجربه موازيه ، تشع خلايا G34 علي النحو التالي:
      1. بدءا 48 ساعة بعد الطلاء 1 × 106 خلايا في 5 مل في 25 سم2 قارورة منخفضه المرفقات ، تشع الخلايا مع 2 غراي من الطاقة (اي أشرق توفير انبعاث الفوتون غير مقبول). أعاده الخلايا إلى الحاضنة وعدم الإزعاج. بعد 48 h ، تشع الخلايا مره أخرى مع 2 غراي اضافيه من الطاقة.
      2. كرر الخطوة 1.3.3.1 4x حتى يتم أداره ما مجموعه 10 غراي من الطاقة.
      3. أعاده الخلايا إلى الحاضنة والسماح لهم بالتعافي في وسط جديد لمده لا تقل عن 5 أيام قبل التحليل المصب.
    4. بعد تحريض المقاومة ، الخلايا lyse باستخدام كاشف تحلل واستخراج الحمض الريبي النيبالي الإجمالي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    5. تحليل التعبير عن miRNAs محدده المحددة في الأقسام 1.1-1.2 كما هو موضح في الخطوة 1.2.1 (الشكل 2).
  4. توصيف التقارب الوظيفي ل miRNAs متفاوت البعد
    1. الحصول علي الهدف المتوقع من كل miRNAs المعرفة في الأقسام 1.2-1.3 التي تم الحصول عليها باستخدام ميرنا استهداف أدوات التنبؤ.
      ملاحظه: نحن عموما اللجوء إلى TargetScan ، كما يتم تحديث خوارزميه لها بشكل دوري16. أدوات التنبؤ الاضافيه هي ميراندا17، mirdb18، وديانا-mirdb19. كل هذه البرامج هي مجانية ، والتطبيقات القائمة علي شبكه الإنترنت.
      1. من الصفحة الاولي من Targetscan ، حدد ميرنا الفائدة من القائمة المنسدلة التي تم ملؤها مسبقا. انقر فوق الزر إرسال .
      2. قم بتنزيل قائمه الأهداف الناتجة كجدول بيانات باستخدام ارتباط جدول التنزيل (الشكل الإضافي 1).
      3. لتقليل فرص التنبؤات الايجابيه الزائفة ، لا تشمل سوي الأهداف داخل عمود المواقع المحفوظة في التحليلات النهائية. أيضا ، يمكن الحصول علي مزيد من التقشف باستخدام برامج التنبؤ ميرنا اضافيه (انظر أعلاه) وفقط بما في ذلك الأهداف التي هي مشتركه لجميع الخوارزميات.
    2. تصنيف المستهدفة الناتجة وفقا لفئات علم الجينات باستخدام ToppGene جناح20 لتقييم لإثراء المسارات التي هي مشتركه لكل ميرنا.
      1. لصق قائمه الأهداف التي تم الحصول عليها من الخطوة 1-4-1 في اطار "مجموعه الجينات التدريب" باستخدام رمز HGNC كنوع إدخال. انقر فوق إرسال > أبدا. سيوفر البرنامج جدول مخرجات يظهر أهم فئات "Go" للقائمة التي تم إدخالها من الجينات (الشكل التكميلي 2).
    3. لتاسيس أخيرا مساهمه كل ميرنا لتنظيم مسار مشترك أو عمليه الخلوية (في هذه الحالة ، التنظيم الكروماتين) ، تحقق من كل targetome الحصول عليها في الخطوة 1-4-1 ضد قائمه كامله من الجينات المشاركة في عمليه خلوية محدده ( اي ، التنظيم الكروماتين) ، وذلك باستخدام وظيفة الرسم البياني Venn المقدمة في المعلوماتية الحيوية والتطور الجينوم الموقع http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
      ملاحظه: يسمح هذا البرنامج بالتقاطع بين مجموعات متعددة في نفس الوقت (الشكل 3). ويتم بعد ذلك شرح الأهداف الفريدة المحددة التي تقدمها كل ميرنا واختيارها للتجارب الوظيفية النهائية.
      1. في الصفحة الاولي من البرنامج ، قم بتحميل أو نسخ/لصق القائمة إذا كان الهدف mRNAs لكل ميرنا أو الفائدة في النوافذ المعنية. اسم كل قائمه مع معرف فريد.
      2. انقر فوق إرسال. سيوفر البرنامج إخراجا مرئيا للرسم التخطيطي Venn مع عدد من الجينات في كل قطاع ، فضلا عن قائمه كامله من mRNAs لكل مجموعه فرعيه وتقاطع التركيبات.

2. تجميع وحدات ميرنا في كتله المحورة وراثيا بوليسيستررونيك

  1. اعداد سقالة المحورة وراثيا استنادا إلى موضع الكتلة 17-92 مير
    1. الحصول علي تسلسل النيوكليوتيد للكتلة 17-92 من مستعرض الجينوم انسمبل21. حدد التسلسل الأساسي لزوج القاعدة ~ 800 "core" الذي يشمل جميع دبابيس الشعر الستة المشفرة من الموضع وعلي الأقل 200-النوكليوتيد التي تجمع بين المراحل التمهيدية (5 ') والمجري السفلي (3 ') من التسلسل الأساسي.
    2. لصق التسلسل أعلاه في اي برنامج تحرير الكلمة.
    3. حدد تسلسل كل واحد من دبابيس الشعر الستة الاصليه عن طريق استرجاعها في miRBase22. وضع علامة علي كل واحد من هذه التسلسلات ضمن نطاق تسلسل "الاساسيه" التي تم تحديدها مسبقا. اي تسلسل بين كل دبوس الشعر تمثل تسلسلات فاصل ، والتي هي مهمة للمعالجة الصحيحة للجينات.
    4. أزاله متواليات دبوس الشعر الأصلي من تسلسل "الاساسيه" ، باستثناء 3-5 النيوبوتيدس في كل من 5 ' و 3 ' نهايات كل دبوس ، والتي ستكون بمثابه متقبل لدبابيس الشعر الجديدة.
  2. بناء الجينات الجديدة الترميز متعددة miRNAs من الاختيار
    1. الحصول علي تسلسل دبوس من miRNAs المقصود ان تكون مفرطة في الجينات عبر من Mirnas. لاحظ بعناية النيوبوتيديس المحددة التي هي مواقع الانقسام المعالج الدقيق.
    2. استبدل دبابيس الشعر المزالة (الخطوة 2-1-4) بالسلاسل الشعرية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.2.1.
    3. أضافه تسلسل القيود المطلوبة في كل من المناطق الجانبية من الجينات لتسهيل الاستنساخ إلى ناقلات التسليم من الاختيار. تحقق من ان تسلسلات التقييد المختارة غير موجودة ضمن التسلسل نفسه.
    4. بالنسبة لعناصر التحكم السلبية ، استخدم التسلسلات المشفرة 20-النيوكليوتيد لاستبدال التسلسل الطبيعي لكل ميرنا الناضجة بعشرين نوكليوتيد. إنشاء هذه التسلسلات المشفرة باستخدام أداه علي الإنترنت مثل https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
  3. التحقق من البنية ثنائيه الابعاد للجينات
    1. نسخ تسلسل المحورة وراثيا الكامل في الحمض الريبي النيبالي التنبؤ بنيه برنامج RNAweb طيه23.
    2. باستخدام إعدادات البرنامج القياسية ، انقر فوق " متابعه".
    3. تحليل الإخراج الرسوميه ، وخاصه بالنسبة لوجود دبابيس الشعر المحددة جيدا ووجود هياكل الجذعية التي تقطعت بها السبل المزدوجة علي الأقل 11 النيوبوتيدس القريبة إلى موقع الانقسام المعالج الدقيق. أيضا ، ابحث عن عدم وجود نقاط المتفرعة داخل تسلسل دبوس (الشكل 4).

3. الحصول علي الجينات عبر الحمض النووي التوليف

  1. بعد التصميم والتحقق من صحة سيليكو من مجموعه ميرنا خيالي ، والحصول علي تسلسل العمل باستخدام توليف الحمض النووي من الباعة التجاريين24 والمضي قدما في استنساخ المصب إلى ناقلات والتسليم عبر الجينات. لقد استخدمنا ناقلات لينتيفيرال للتسليم في المختبر10 و adeno-الفيروسات المرتبطة (الطائرات بالطائرات) لفي الجسم المجري تسليم25.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سمحت هذه الطريقة توصيف وحده من ثلاثه miRNAs التي يتم تقليلها باستمرار في أورام المخ ، والتي يتم التعبير عنها بشكل خاص اثناء التمايز العصبية (الشكل 1) وتشارك في استجابه الورم البقاء علي قيد الحياة بعد العلاج (الشكل 2). ويتحقق ذلك من خلال تنظيم المسار القمعي كروماتين معقده. وقد اقترح هذا النمط من التعبير المشترك نشاطا متازرا قويا بين هذه الثلاثة miRNAs (الشكل 3). التالي ، مع الاستفادة من حجم صغير وتكوي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستند هذا البروتوكول علي فكره انه بدلا من العمل في عزله ، miRNAs هي ذات الصلة بيولوجيا من خلال العمل في مجموعات ، ويتم تحديد هذه المجموعات الهيستونات من قبل السياقات الخلوية المحددة26. ولتبرير هذا النهج من منظور انتقالي ، استحدث بروتوكول للمتابعة يسمح بالترويح عن هذا النمط المتعدد الميرنا في الخلايا/الانسجه. وهذا ممكن من خلال الاستفادة من النشاه الحيوية بسيطه نسبيا من miRNAs ، حيث الاعتراف من السمة ميرنا المميزة من قبل المعالج الدقيق ضروري وكافيه لمعالجه ميرنا الصحيح27. وف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا أعضاء مختبر هارفي كوشينج للأورام العصبية علي الدعم والنقد البناء. وقد دعم هذا العمل من قبل NINDS منح K12NS80223 و K08NS101091 إلى p. P.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.4٪ انخفاض درجة حرارة الانصهار agarose IBIScientific IB70058
0.45 & micro; وحدة التصفية المعقمة MMerck MilliporeSLH033RS
1.5 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق Eppendorf22431081
6 ألواح آبار   ؛Greiner Bio-One657160
الفئران اللورمية (FoxN1 nu / nu)Envigo069 (nu) / 070 (nu /+)
B-27 Supplement   ؛12587010Thermo Fisher Scientific
Greiner Bio-One660175
Cell Scraper ، 16 سمSarstedt83.1832
السيزيوم 137 irradiator   ؛مرفق JL Sheperd and AssociatesCore (كلية الطب بجامعة هارفارد)
الكلوروفورمسيجما ألدريتش439142-4L
DMEM ، ارتفاع الجلوكوز ، البيروفات   ؛ثيرمو فيشر11995040
Dulbecco s محلول ملحي مخزن بالفوسفات   ؛Gibco14190144
Eosin Y solution سيجما ألدريتشE4009
مصل الأبقار الجنينية سيجما ألدريتشF9665
محلول الفورمالينسيجما ألدريتشHT501128
الجلوتا ماكس الملحق Thermo Fisher Scientific35050061
HEK-293American Type Culture CollectiATCC CRL-1573
محلول HematoxylinSigma-Aldrich1051750500
الخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الدبقي الأولي البشري (GBM62)مقدمة من الدكتور إي إيه شيوكا (بريغهام والنساء مستشفى ، بوسطن ، ماساتشوستس)
الخلايا الجذعية الشبيهة بالورم الدبقي الأولي البشري (MGG4)مقدمة من الدكتور هيرواكي واكيموتو (مستشفى ماساتشوستس العام ، بوسطن ، ماساتشوستس) ناقل
الفيروسات pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPنظام العلوم البيولوجيةCD511B-1
ليبوفيكتامين 2000   ؛ثيرمو فيشر 11668019
الطرد المركزي الدقيقة المبردةإيبندورفموديل رقم 5424 R ، القط رقم 5404000138
تركيب المتوسطة Thermo Fisher Scientific4112APG
Nalgene أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة من البولي كربونات المستديرة السفلية   ؛ثيرمو فيشر العلمية 3117-0380PK
NanoDropThermo Fisher Scientific2000c
الخلايا السلفية العصبية (NPC)مقدمة من الدكتور جاكوب جودلوسكي (بريغهام والنساء s مستشفى ، بوسطن ، ماساتشوستس)
Neurobasal Medium   ؛Thermo Fisher Scientific21103049
نيكون eclipse Ti نظام مجهر الفلورسنت الآلينيكون ، اليابان14314
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985088
أنابيب PCR  سيجما ألدريتشCLS6571-960EA
البنسلين الستربتومايسين ترمو فيشر 15140122
أطباق بيتري 94/16 Greiner Bio-One632180
Poly-D-Lysine سيجما- AldrichP4707
المؤتلف البشري EGF PeproTech AF-100-15
المؤتلف البشري FGF-basic PeproTech AF-100-18B
حمض الريتينويكجيبكو12587-010   ؛
RNA Miniprep KitDirect-zolR2050
S1000 Thermal Cycler Bio-Rad1852196
المشع الصغير الموجه بالصور للحيوانات الصغيرة  Xstrahal Life Sciences ، المملكة المتحدةالمنشأة الأساسية (معهد دانا فاربر للسرطان ، بوسطن ، ماساتشوستس) Sorvall
WX + Ultracentrifuge  ؛ثيرمو فيشر العلمية 75000100
StemPro Accutase Thermo Fisher ScientificA1110501
StepOne نظام PCR في الوقت الحقيقيللأنظمة الحيوية التطبيقية 4376357
خزانة السلامة البيولوجية SterilGARD شركة بيكرSG403A-HE
سكروزسيجما-ألدريتشS9378
T98-Gنوع أمريكي ثقافة كوليكتيريATCC CRL-1690
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher Scientific4366596
TaqMan Universal PCR Master MixThermo Fisher Scientific4324018
TemozolomideTocris Bioscience2706
Tissue-Tek درجة حرارة القطع المثلى   ؛فيشر NC9636948
TRIzol Reagent كاشف تحلل15596026 الحراري
Thermo Fisher U251-MGنوع أمريكي ثقافة CollectiATCC HTB-17
U87-MG & nbsp ؛American Type Culture CollectiATCC HTB-14
ViraPower Lentivector Expression system ثيرمو فيشر العلميK4970-00
المياه ، HPLC الصففيشرW54
الزيلين   ؛سيجما ألدريتش534056
قارورة ثقافة الخلايا العلميعلمي أجهزة علميةالعلمي العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  2. Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature Reviews Genetics. 12, 861-874 (2011).
  3. Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767(2018).
  4. Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
  5. Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
  6. Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
  7. Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
  8. He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
  9. Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
  10. Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442(2019).
  11. Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
  12. Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
  13. Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
  14. Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044(2009).
  15. Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
  16. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
  17. Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
  18. Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
  19. Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
  20. Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
  21. Aken, B. L., et al. Ensembl 2017. Nucleic Acids Research. 45, D635-D642 (2017).
  22. Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
  23. Lorenz, R., et al. Vienna RNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6 (1), 26(2011).
  24. Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812(2017).
  25. Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
  26. Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
  27. Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
  28. Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
  29. Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
  30. Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437(2011).
  31. Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

microRNA miR 17 92 TargetScan ToppGene RNA

مقالات ذات صلة