هنا، نقدم بروتوكولا ً لانفصال وفرز خلايا محددة من الغدد التبعية الذكور دروسوفيلا (الخلايا الثانوية) لتسلسل الحمض النووي الريبي وRT-qPCR. يتم تحقيق عزل الخلايا من خلال تنقية FACS للخلايا الثانوية التي تعبر عن GFP بعد عملية فصل متعددة الخطوات التي تتطلب تشريح، والهضم البروتياز والتشتت الميكانيكي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لفهم وظيفة الجهاز، غالباً ما يكون من المفيد فهم دور مجموعات الخلايا المكونة له. لسوء الحظ، فإن ندرة مجموعات الخلايا الفردية غالباً ما تجعل من الصعب الحصول على ما يكفي من المواد للدراسات الجزيئية. على سبيل المثال، الغدة التبعية للجهاز التناسلي الذكور دروسوفيلا يحتوي على نوعين من الخلايا السرية متميزة. تشكل الخلايا الرئيسية 96% من الخلايا السرية للغدة، في حين تشكل الخلايا الثانوية (SC) 4% المتبقية من الخلايا (حوالي 80 خلية لكل ذكر). على الرغم من أن كلا النوعين من الخلايا تنتج مكونات هامة من السائل المنوي، ومن المعروف أن عدد قليل فقط من الجينات تكون محددة لSCs. وقد أعاقت ندرة الـ SCs، حتى الآن، دراسة تحليل النسخ من هذا النوع المهم من الخلايا. هنا، يتم تقديم طريقة تسمح لتنقية SCs لاستخراج الحمض النووي الريبي والتسلسل. يتكون البروتوكول في تشريح الغدد أولا من الذباب التعبير عن مراسل GFP SC محددة ومن ثم إخضاع هذه الغدد لهضم البروتياز والتفكك الميكانيكي للحصول على الخلايا الفردية. بعد هذه الخطوات، يتم فرز الخلايا الفردية والحية، التي تحمل علامة GFP باستخدام فارز الخلايا المنشطة الفلورسنت (FACS) لتنقية RNA. ينتج عن هذا الإجراء RNAs SC محددة من ~ 40 الذكور لكل شرط لRT-qPCR المصب و / أو تسلسل RNA في غضون يوم واحد. تسمح سرعة وبساطة الإجراء بتحديد نسخ العديد من الذبابات المختلفة، من الأنماط الجينية المختلفة أو الظروف البيئية، في فترة قصيرة من الزمن.
المقدمة
تتكون الأعضاء من أنواع خلايا متعددة، لكل منها وظائف منفصلة وتعبر في بعض الأحيان عن مجموعات مختلفة إلى حد كبير من الجينات. للحصول على فهم دقيق لكيفية عمل الجهاز، غالباً ما يكون من الضروري دراسة كل نوع خلية متميزة التي تشكل هذا الجهاز. واحدة من الطرق الأساسية المستخدمة لاستكشاف وظيفة ممكنة هو تحليل النسخ. توفر هذه الطريقة القوية لقطة من التعبير الجيني في الخلية، للكشف عن العمليات والمسارات النشطة. ومع ذلك، هذا النوع من التحليل غالباً ما يكون من الصعب على مجموعات الخلايا النادرة التي يجب تنقيتها من الخلايا المجاورة أكثر وفرة بكثير. على سبيل المثال، الغدة التبعية الذكور دروسوفيلا هو جهاز تتكون في المقام الأول من نوعين من الخلايا السرية. وبما أن أندر من نوعي الخلا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خطوط دروسوفيلا المستخدمة وجمع الذكور
- لهذا البروتوكول، استخدم الذكور التعبير GFP في SCs وليس الخلايا الرئيسية. هنا، يتم استخدام برنامج تشغيل عبد الب-GAL4 (الموضح في المرجع18)،مع UAS-GFP (على كروموسوم 2). كما يمكن استخدام برامج التشغيل المناسبة الأخرى. لعزل SCs في ظل ظروف متحولة مختلفة، عبر الطفرة إلى خطوط تحتوي على خط GFP الخاص بـ SC.
- جمع دفعتين من حوالي 25 صحية، الذكور العذراء لكل النمط الجيني والعمر لهم في 25 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام في قارورة مع الطعام Drosophila الطازجة.
ملاحظة: ومع تقدم السن، وحالة التزاوج، والتغذية، والبيئة الاجتماعية، تؤثر كل منها على البيولوجي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
البروتوكول المعروض هنا يمكّن أحد التجارب من عزل الخلايا الثانوية عن الغدد التبعية الذكور ية دروسوفيلا واستخراج الحمض النووي الريبي في غضون يوم واحد(الشكل 1).
نحن نستخدم بناء عبد-B-GAL4 18 لتسمية الخلايا الثانوية (SC) ولكن ليس الخلايا الرئيسية (MC) مع GFP(الشكل 2A). أحد أهداف هذا الإجراء هو الحصول على نسخة النوع .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طرق انفصال الخلايا من أنسجة دروسوفيلا مثل الأقراص التخيلية هي بالفعل وصف23. فشلت محاولاتنا ببساطة لاستخدام هذه الإجراءات على الغدد الملحقة، وتشجيعنا على تطوير هذا البروتوكول الجديد. وكان الهضم البروتياز وtrituration الميكانيكية الخطوات الحاسمة ونحن troubleshot لنجاح الإجراء، وبالتالي وضعنا العديد من الملاحظات في الأقسام 2 إلى 5 لمساعدة التجارب للحصول على نتائج مرضية. لكي ينجح التفكك، يجب أن تصل البتيدات إلى خلايا الغدة الملحقة، والتي تحميها السوائل المنوية اللزجة في التجويف وطبقة العضلات .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون لأعضاء مختبر "كارش"، وللتشكيل الأنسيولوجي iGE3، والمرفق الأساسي لـ "فلو سيتومتري" التابع لجامعة جنيف، وللدكتور جان بيير أوبري - لاشيناي الذي وضع البروتوكول الخاص بـ FACS. نشكر لوكا ستيكلي على مساعدته في تصور القراءات على IGV. نشكر أنفسنا على الإذن اللطيف لإعادة استخدام الأرقام، والمحررين لدفعتنا إلى أن نكون مبدعين مع الكتابة.
تم تمويل هذا البحث من قبل دولة جنيف (CI، RKM، FK)، والصندوق الوطني السويسري للبحوث (www.snf.ch) (FK وRKM) والتبرعات من مؤسسة كلاراز (FK).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 24 بئرا لوحة زراعة الأنسجة | VWR | 734-2325 | |
| مجهر مجهر للتشريح | |||
| مجهر مع مصدر ضوء ل GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 ملي مولار | BioStatus | DR71000 | |
| الأنابيب الدقيقة البلاستيكية 1.5 مل | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| ملقط تشريح دقيق مصل | |||
| بقري الجنين | Gibco | 10270-106 | تم تعطيل الحرارة قبل الاستخدام |
| الأطباق الزجاجية لتشريح | |||
| دلو | |||
| ImProm-II نظام النسخ العكسي | Promega | A3800 | |
| طقم تنقية الحمض النووي الريبي MasterPure | مركز MCR85102 | ||
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html< / a> | |
| P1000 | جيلسون | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U / mL مخزون | ||
| PBS | محلي الصنع | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| بادئات | |||
| بادئات سداسية | |||
| RNA 6000 طقم بيكو | أجيلينت | ||
| شنايدر s ذبابة الفاكهة< / em> متوسط | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer مجموعة توليف cDNA | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits< / a> | |
| SYBR حدد المزيج الرئيسي ل CFX | المطبق الأنظمة الحيوية | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 & mu ؛ L نصيحة متدرجة | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 & mu ؛ طرف مشطوف L | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
المراجع
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmen....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
