يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila

6.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60218

⸱

سبتمبر 5, 2019

 ,  , 
1Department of Genetics and Evolution, University of Geneva

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكولا ً لانفصال وفرز خلايا محددة من الغدد التبعية الذكور دروسوفيلا (الخلايا الثانوية) لتسلسل الحمض النووي الريبي وRT-qPCR. يتم تحقيق عزل الخلايا من خلال تنقية FACS للخلايا الثانوية التي تعبر عن GFP بعد عملية فصل متعددة الخطوات التي تتطلب تشريح، والهضم البروتياز والتشتت الميكانيكي.

الملخص

لفهم وظيفة الجهاز، غالباً ما يكون من المفيد فهم دور مجموعات الخلايا المكونة له. لسوء الحظ، فإن ندرة مجموعات الخلايا الفردية غالباً ما تجعل من الصعب الحصول على ما يكفي من المواد للدراسات الجزيئية. على سبيل المثال، الغدة التبعية للجهاز التناسلي الذكور دروسوفيلا يحتوي على نوعين من الخلايا السرية متميزة. تشكل الخلايا الرئيسية 96% من الخلايا السرية للغدة، في حين تشكل الخلايا الثانوية (SC) 4% المتبقية من الخلايا (حوالي 80 خلية لكل ذكر). على الرغم من أن كلا النوعين من الخلايا تنتج مكونات هامة من السائل المنوي، ومن المعروف أن عدد قليل فقط من الجينات تكون محددة لSCs. وقد أعاقت ندرة الـ SCs، حتى الآن، دراسة تحليل النسخ من هذا النوع المهم من الخلايا. هنا، يتم تقديم طريقة تسمح لتنقية SCs لاستخراج الحمض النووي الريبي والتسلسل. يتكون البروتوكول في تشريح الغدد أولا من الذباب التعبير عن مراسل GFP SC محددة ومن ثم إخضاع هذه الغدد لهضم البروتياز والتفكك الميكانيكي للحصول على الخلايا الفردية. بعد هذه الخطوات، يتم فرز الخلايا الفردية والحية، التي تحمل علامة GFP باستخدام فارز الخلايا المنشطة الفلورسنت (FACS) لتنقية RNA. ينتج عن هذا الإجراء RNAs SC محددة من ~ 40 الذكور لكل شرط لRT-qPCR المصب و / أو تسلسل RNA في غضون يوم واحد. تسمح سرعة وبساطة الإجراء بتحديد نسخ العديد من الذبابات المختلفة، من الأنماط الجينية المختلفة أو الظروف البيئية، في فترة قصيرة من الزمن.

المقدمة

تتكون الأعضاء من أنواع خلايا متعددة، لكل منها وظائف منفصلة وتعبر في بعض الأحيان عن مجموعات مختلفة إلى حد كبير من الجينات. للحصول على فهم دقيق لكيفية عمل الجهاز، غالباً ما يكون من الضروري دراسة كل نوع خلية متميزة التي تشكل هذا الجهاز. واحدة من الطرق الأساسية المستخدمة لاستكشاف وظيفة ممكنة هو تحليل النسخ. توفر هذه الطريقة القوية لقطة من التعبير الجيني في الخلية، للكشف عن العمليات والمسارات النشطة. ومع ذلك، هذا النوع من التحليل غالباً ما يكون من الصعب على مجموعات الخلايا النادرة التي يجب تنقيتها من الخلايا المجاورة أكثر وفرة بكثير. على سبيل المثال، الغدة التبعية الذكور دروسوفيلا هو جهاز تتكون في المقام الأول من نوعين من الخلايا السرية. وبما أن أندر من نوعي الخلايا لا يشكل سوى 4٪ من خلايا هذه الغدة، لم يتم استخدام تحليل النسخ من نوع الخلية المحددة للمساعدة في تحديد وظيفة هذه الخلايا.

الغدد التبعي (AGs) هي أجهزة الجهاز التناسلي الذكور في الحشرات. وهي مسؤولة عن إنتاج معظم بروتينات السائل المنوي (بروتينات السوائل المنوية (SFPs) وبروتينات الغدة التبعي (ACPs)). ومن المعروف أن بعض هذه SFPs للحث على الاستجابات الفسيولوجية والسلوكية في الإناث التزاوج، وتسمى عادة استجابة ما بعد التزاوج (PMR). وتشمل بعض PMRs: زيادة معدل الإباضة ووضع البيض، وتخزين والإفراج عن الحيوانات المنوية، وتغيير في النظام الغذائي للإناث، وانخفاض في تقبل الإناث إلى الذكور التودد الثانوي1،2. وبما أن الحشرات تؤثر على العديد من القضايا المجتمعية الرئيسية من الصحة البشرية (كناقلات للأمراض الفتاكة) إلى الزراعة (يمكن أن تكون الحشرات آفات، ومع ذلك فهي حاسمة بالنسبة للتلقيح ونوعية التربة)، فإن فهم تكاثر الحشرات هو مجال هام من مجالات البحث. وقد تقدمت دراسة AGs وACPs بشكل ملحوظ مع الكائن الحي النموذجي Drosophila melanogaster. وقد أبرزت هذه الدراسات دور AGs وبعض البروتينات الفردية التي تنتجها في خلق PMR، مما يؤثر على العمل في الأنواع الأخرى مثل ناقلات المرض Aedes aegypti3،4، وغيرها من الحشرات1 ،5. وعلاوة على ذلك، كما تفرز AGs مكونات السائل المنوي1،6 وغالبا ما يعتقد أنها التناظرية الوظيفية للغدة البروستاتا الثدييات والحويصلة المنوية. هذا التشابه وظيفة جنبا إلى جنب مع أوجه التشابه الجزيئي بين اثنين من أنواع الأنسجة، جعلت من AGs نموذجا للغدة البروستاتا في الذباب7.

داخل الذكور دروسوفيلا، وهناك اثنين من الفصوص من الغدد التبعي. يمكن النظر إلى كل فص على أنه هيكل يشبه الكيس يتكون من طبقة أحادية من الخلايا السرية المحيطة بالتجويف المركزي، وملفوفة بعضلات ناعمة. كما ذكر أعلاه، هناك نوعان من الخلايا السرية المورفولوجية والتنموية والمتميزة وظيفيا ً التي تشكل هذه الغدة: الخلايا الرئيسية على شكل مضلع (تشكل حوالي 96٪ من الخلايا)، والخلايا الثانوية المستديرة الأكبر (SC) (تشكل 4٪ المتبقية من الخلايا، أو حوالي 40 خلية لكل فص). وقد تبين أن كلا النوعين من الخلايا ينتجان مجموعات متميزة من الـ ACPs للحث على وجود التصوير بالرنين المغناطيسي والحفاظ عليه. معظم البيانات التي تم الحصول عليها حتى الآن تسليط الضوء على دور بروتين واحد في إثارة معظم السلوكيات المميزة للPMR. هذا البروتين، الببتيد الجنس، هو صغير، 36 الببتيد الأحماض الأمينية التي تفرزها الخلايا الرئيسية8،9،10. على الرغم من أن الببتيد الجنس يبدو أن تلعب دورا رئيسيا في PMR، ACPs الأخرى، التي تنتجها كل من الخلايا الرئيسية والثانوية، كما تبين أن تؤثر على جوانب مختلفة من PMR11،12،13،14 ،15،16،17. على سبيل المثال، استنادا إلى معرفتنا الحالية، يبدو أن SCs، عن طريق البروتينات التي تنتجها، مطلوبة لإدامة إشارة SP بعد اليوم الأول18.

وبالنظر إلى ندرة SCs (80 خلية فقط لكل ذكر)، فإن كل معرفتنا بهذه الخلايا والبروتينات التي تنتجها تأتي من علم الوراثة ونهج المرشح. وحتى الآن، لم يُثبت سوى قائمة صغيرة نسبياً من الجينات أنها خاصة بشركة SC. وتشمل هذه القائمة البروتين homeodomain المعيبة proventriculus (Dve)19, وlncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 و 1921, CG1656 و CG1757511, 15،21 وعامل النسخ homeobox البطن-B (عبد الب)18. في السابق، أظهرنا أن متحولة ناقصة لكل من التعبير عن عبد الب وMSA lncRNA في الخلايا الثانوية(iab-6cocuD1 متحولة) تقصير طول PMR من ~ 10 أيام إلى يوم واحد فقط12 , 18 سنة , 20.ويبدو أن هذا النمط الظاهري هو سبب التخزين غير السليم من SP في الجهاز التناسلي الأنثوي12,18,20. على المستوى الخلوي، تظهر الخلايا الثانوية لهذا المتحولمورولوجيا غير طبيعية، وفقدان هياكلها المميزة مثل الفراغول18،20،21. باستخدام هذا الخط متحولة، حاولنا سابقا لتحديد الجينات المشاركة في وظيفة SC عن طريق مقارنة ملامح النسخ من AGs كله من نوع البرية أو الغدد التبعي متحولة12. أيضا، وأظهرت مختبرات أخرى أن عدد SC، مورفولوجيا ومحتوى vacuolar تعتمد على النظام الغذائي الذكور، وحالة التزاوج والعمر21،25،26.

وعلى الرغم من إحراز تقدم إيجابي باستخدام هذه النهج، فإن نسخة كاملة من اللجنة لم تتحقق بعد. ندرة هذه الخلايا في هذا الجهاز جعلت من الصعب التقدم أكثر حتى من خلايا النوع البرية. لاختبار التعبير الجيني، فإن التغيرات في هذه الخلايا بعد محفزات بيئية معينة ستكون أكثر صعوبة. وهكذا، هناك حاجة إلى طريقة لعزل وتنقية الحمض النووي الريبي SC التي كانت سريعة وبسيطة بما فيه الكفاية لأداء في ظل خلفيات وراثية مختلفة والظروف البيئية.

كل من الجينات عبد-B وMSA تتطلب محسن 1.1 كيلو بايت محددة من مجمع Drosophila Bithorax (يسمى محسن D1) للتعبير عنها في SCs18,20. وقد تم استخدام هذا محسن سابقا لإنشاء برنامج تشغيل GAL4 التي، عند ربطها UAS-GFP،قادرة على دفع تعبير GFP قوية على وجه التحديد في SCs. وهكذا، استخدمنا هذا الخط كأساس لبروتوكول FACS لعزل هذه الخلايا من كل من النوع البري وiab-6cocuD1 AGs). كما iab-6cocuD1 متحولة SCuD1 عرض مورفولوجيا الخلوية المختلفة، ونحن نظهر أن هذا البروتوكول يمكن استخدامها لعزل الخلايا لتحديد النسخ من هذا النوع من الخلايا النادرة في ظل ظروف مختلفة إلى حد كبير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. خطوط دروسوفيلا المستخدمة وجمع الذكور

  1. لهذا البروتوكول، استخدم الذكور التعبير GFP في SCs وليس الخلايا الرئيسية. هنا، يتم استخدام برنامج تشغيل عبد الب-GAL4 (الموضح في المرجع18)،مع UAS-GFP (على كروموسوم 2). كما يمكن استخدام برامج التشغيل المناسبة الأخرى. لعزل SCs في ظل ظروف متحولة مختلفة، عبر الطفرة إلى خطوط تحتوي على خط GFP الخاص بـ SC.
  2. جمع دفعتين من حوالي 25 صحية، الذكور العذراء لكل النمط الجيني والعمر لهم في 25 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام في قارورة مع الطعام Drosophila الطازجة.
    ملاحظة: ومع تقدم السن، وحالة التزاوج، والتغذية، والبيئة الاجتماعية، تؤثر كل منها على البيولوجيا الإنجابية، يجب اتباع بروتوكولات صارمة للسيطرة على هذه البارامترات. الذكور العذراء تتراوح أعمارهم بين 3-4 أيام بعد eclosion pupal في 25 درجة مئوية مع 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / دورة مظلمة، على الغذاء القياسية وجبة الذرة أجار الخميرة، في مجموعات من 20-25 الذكور في قارورة.

2. الحلول وإعداد المواد

  1. إعداد الحلول التالية.
    1. إعداد المصل المكمّل المتوسطة (SSM): المتوسط دروسوفيلا شنايدر تكمل مع 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنين و 1٪ البنسلين-ستربيتومايسين.
    2. إعداد aliquots من إنزيم التربسين 1X (على سبيل المثال، إنزيم تريبل اكسبرس) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد aliquots من الباباين [50 U / مل] (المخزنة في -20 درجة مئوية وذاب مرة واحدة فقط).
    4. إعداد 1X الفوسفات العازلة المالحة (PBS، المخزنة في درجة حرارة الغرفة).
  2. إعداد العديد من النصائح الأنابيب لهب مدورة للانفصال المادي للغدد التبعي.
    ملاحظة:     استخدام نصائح الاحتفاظ منخفضة للتعامل مع الغدد التبعي لأنها تميل إلى التمسك البلاستيك غير المعالجة. عملية التقريب اللهب يقلل من فتح طرف وينعم حواف الطرف. وهذا يضمن تفكك فعال بعد الهضم peptidase دون القص أغشية الخلايا.
    1. قطع طرف واحد 200 درجة مئوية مع شفرة حادة وتمريربلطف على لهب لتقريب طرفه بحيث فتح أوسع ولكن على نحو سلس للتعامل خلال الخطوة 3.7.
    2. تضييق فتح عدة 1000 نصائح درجة مئوية عن طريق تمرير فتح طرف بالقرب من اللهب لأقل من ثانية واحدة. تدوير غيض قليلا لتجنب الإفراط في ذوبان أو انسداد. فرز النصائح التي تم إجراؤها من أضيق إلى أوسع. ويمكن القيام بذلك عن طريق توقيت سرعة الطموح. في محاولة لفصل عينة صغيرة الحجم من AGs لاختبار كفاءة أضيق النصائح.
      ملاحظة: هذه النصائح حاسمة للهياج الميكانيكي (الخطوتين 5.2 و 5.3). تسمح نصائح الأنابيب ذات الهب المستديرة عالية الجودة بالتفكك الكامل مع الحفاظ على قدرة الخلية على البقاء. على هذا النحو، يتم غسل هذه النصائح جيدا بالماء في نهاية الإجراء لإعادة الاستخدام. وهذا يسمح للانفصال من يوم إلى يوم استنساخ.

3. تشريح الغدد التبعي

  1. وضع 20 إلى 25 ذكر Drosophila في طبق زجاجي على الجليد.
  2. تشريح 1 ذكر في SSM. خلع الجهاز التناسلي ومسح زوج الغدة التبعي من جميع الأنسجة الأخرى وبصرف النظر عن القناة القذفية.
    ملاحظة: إزالة الخصيتين لأن الحيوانات المنوية التي تم تحريرها يمكن أن تخلق كتل وتعكر صف وتعكير صفو عملية التفكك. إزالة لمبة القذف، مما يجعل التعامل مع صعبة عندما يطفو.
  3. مع ملقط، نقل الغدد التبعي إلى لوحة زجاجية مليئة SSM في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوات 3.2-3.3 20 مرات للحصول على دفعة من 20 زوجا من الغدد في SSM.
    ملاحظة: وسيتم تحقيق هذه الخطوات في 15 إلى 20 دقيقة. يمكن رصد GFP باستخدام المجهر الفلورسنت.
  4. نقل الغدد التبعي إلى 1X PBS لغسل 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لتحسين التفكك ، لا بد من شطف الغدد بـ PBS. مدة هذه الخطوة، ومع ذلك، ينبغي أن تكون محدودة كما تظهر على الخلايا علامات الإجهاد في PBS. الخلايا الثانوية المنفصلة في PBS تنتفخ بسرعة وتموت.
  5. تمييع 20 ميكرولتر بابين [50 U/mL] إلى 180 ميكرولتر من إنزيم التربسين 1x للحصول على محلول التفكك (لتوسيع أو أسفل الحفاظ على 9 ميكرولتر من إنزيم التربسين و 1 ميكرولتر من البابين لكل ذكر). مع ملقط، نقل الغدد التبعي لهذا الحل.
  6. عزل طرف الغدد التبعية (التي تحتوي على الخلايا الثانوية) من الجزء القريب. استخدام ملقط غرامة لقرصة بحزم وسط الفص الغدي وقطع مع غيض حاد من ملقط الثانية. إزالة الجزء القريب من الغدد التبعي والقناة القذفية لتحسين التفكك وتقليل وقت فرز الخلايا.
    ملاحظة: تشريح الجزء القاصي من 20 زوجا من الغدد سوف يستغرق 15 إلى 20 دقيقة والهضم من قبل peptidases وبالتالي سوف تبدأ في درجة حرارة الغرفة.
  7. بعد أن تم تشريح جميع نصائح الغدة، نقلها إلى أنبوب 1.5 مل باستخدام طرف pipet 200 ميكرولتر خاص أعدت في الخطوة 2.2.1. وينبغي أن تكون واسعة, تقريب والرطب قبل التعامل مع الغدد.
    ملاحظة: لأنسجة الغدة التبعي pipet، يجب أن تكون دائما نصائح قبل الرطب مع الحل المناسب (إنزيم التربسين أو SSM، والحفاظ على أنبوب واحد من كل لهذا الغرض). شطف بعناية نصائح بين العينات لتجنب التلوث.

4. هضم الأنسجة

  1. ضع الأنبوب الصغير في 37 درجة مئوية شاكر لمدة 60 دقيقة، هزاز في 1000 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: كل من التحريض ووقت الهضم أمر بالغ الأهمية لنجاح التفكك. سوف الهضم أقصر أو بلا حراك تعطي تفكك الفقراء، وربما لأن طبقة العضلات الخارجية والسوائل اللزجة الداخلية الأساسية حماية خلايا الغدة التبعي من peptidases.
  2. إضافة 1 مل من SSM في درجة حرارة الغرفة لوقف الهضم والمضي قدما على الفور إلى الخطوة 5.

5. التفكك الميكانيكي للخلايا

  1. باستخدام طرف تقريب واسع 1000 درجة مئوية، قبل الرطب مع SSM، نقل العينة إلى لوحة 24 جيدا. رصد الفلورة GFP تحت المجهر: معظم نصائح الغدة يجب أن تبدو سليمة وينبغي فصل عدد قليل من SC.
  2. باستخدام طرف الأنابيب الضيقة المستديرة التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.2.2، pipet صعودا وهبوطا 3 إلى 5 مرات لتعطيل أنسجة الغدة التبعي.
    ملاحظة: مراقبة الفلورة للتأكد من أن بقع الأنسجة الكبيرة قد تم تقسيمها. كرر الخطوة 5.2 إذا لم يكن هذا هو الحال.
  3. باستخدام طرف pipet مدورة ضيقة جدا (التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.2.2)، pipet صعودا وهبوطا 1-2 مرات.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا الفردية فقط مرئية بعد الخطوة 5.3. ينصح باستخدام لوحات 24-جيدا لأنها تمكن من مراقبة سهلة للعملية. عندما تمت معالجة عدد قليل من العينات وأعطى نتيجة مرضية (الخلايا الثانوية يبحث صحية مفككة تماما)، سيتم تنفيذ خطوات الأنابيب في الأنبوب الصغير.
  4. انتظر 15 دقيقة على الأقل للسماح للخلايا تسوية في الجزء السفلي من البئر وإزالة SSM الزائدة لتقليل وقت الفرز.
    ملاحظة: ترك الخلايا تسوية ثبت متفوقة على الأساليب البديلة مثل الطرد المركزي، ويسمح التفتيش البصري الأخير للخلايا قبل FACS.
  5. الأنابيب الخلايا في أنبوب 1.5 مل نظيفة وتجميع عينات متطابقة (دفعتين من 20 الذكور لكل شرط). شطف الآبار مع SSM لاسترداد الخلايا الأخيرة، والأنابيب لهم في الأنبوب (استخدام حجم صغير).
  6. في الأنابيب الدقيقة 1.5 مل، أضف 300 ميكرولتر من محلول اللليس الخلوي و1 ميكرولتر من بروتيناسي K [50 ميكروغرام/ميكرولتر] (الحلول المقدمة في مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي، انظر الخطوة 7). إعداد أنبوبين لكل عينة (واحد للشركات الصغيرة والمتوسطة وواحد لSCs).

6. FACS (الفلورة تنشيط فرز الخلايا)

  1. إضافة علامة صلاحية إلى كل عينة ليتم فرزها بضع دقائق قبل الفرز (0.3 mM Draq7).
    تحذير: يجب التعامل مع Draq7 بحذر.
  2. فرز مجموعة متجانسة من الخلايا الثانوية الحية (GFP إيجابية، Draq7-الخلايا السلبية). في أنبوب صغير آخر، قم بفرز مجموعة من الخلايا الرئيسية (أصغر، GFP-سلبي، Draq7-الخلايا السلبية). استخدم استراتيجية التغرير الخاصة بـ FACS التالية:
    ملاحظة:     تعيين ضغط فارز الخلية في 25 PSI وتمرير الخلايا من خلال فوهة 100 ميكرومتر. معدل الفرز حوالي 2000 خلية / ث.
    1. استبعاد الحطام واختيار الخلايا الإجمالية على أساس FSC-SSC(الشكل 2E)من أجل استبعاد الحطام.
    2. استبعاد الخلايا الميتة. إثارة Draq7 مع ليزر 640 نانومتر وجمع الفلورة المنبعثة مع مرشح 795/70 الفرقة تمرير. بوابة Draq7 الخلايا الإيجابية خارج(الشكل 2F).
    3. إزالة doublets باستخدام gating مزدوجة على SSC-H مقابل SSC-W و FSC-A مقابل FSC-H(الشكل 2H).
      ملاحظة: استبعاد doublets الخلية بدقة باستخدام gating مزدوجة، للحد من تلوث الخلايا الرئيسية.
    4. فرز ~ 550 الخلايا الإيجابية GFP في ميكروتوب 1.5 مل مع العازلة Lysis وProteinase K. وتعتبر هذه المجموعة خلايا ثانوية (SC, الشكل 2G). تثير GFP في 488 نانومتر وجمع الفلورة المنبعثة مع مرشح 526/52 الفرقة تمرير.
    5. فرز ~ 1000 الخلايا السلبية GFP، متجانسة وصغيرة في الحجم، في ميكروتوب 1.5 مل مع العازلة Lysis وProteinase K. وتعتبر هذه المجموعة من الخلايا الرئيسية (MC، الشكل 2G).
    6. دوامة جميع العينات.
      ملاحظة: من 40 ذكراً (حوالي 40 × 80 SC = 3200 خلية ثانوية)، يتم الحصول على 600 إلى 800 خلية ثانوية فردية حية (حوالي 20-25٪ استرجاع). إيقاف الفرز حول 550 SC و 1000 MC لتطبيع العينات.

7. استخراج الحمض النووي الريبي

ملاحظة: استخدمنا مركز MasterPure RNA تنقية كيت لاستخراج الحمض النووي الريبي، مع التعديلات التالية. ويمكن استخدام مجموعات أخرى طالما أن الغلة عالية بما يكفي لإعداد مكتبة للتسلسل من حوالي 500 خلية (تم استخدام 2 نانوغرام RNAs هنا).

  1. عينات الحرارة في 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ودوامة كل 5 دقائق لاستكمال lysis الخلية.
  2. وضع عينات على الجليد لمدة 5 دقائق اتبع توصيات الشركة المصنعة لهطول الأمطار الأحماض النووية (أجزاء "هطول الأمطار من الأحماض النووية الإجمالية" و "إزالة الحمض النووي الملوث من مجموع الاستعدادات الأحماض النووية").
  3. تعليق بيليه RNA في 10 درجة مئوية من RNase خالية من TE العازلة.
  4. إضافة مثبط RNase (اختياري).
  5. تخزين العينات في -80 درجة مئوية.

8. ضوابط الجودة من الكمية والجودة والخصوصية RNA

  1. تقدير جودة الحمض النووي الريبي والتركيز. بسبب حجم صغير والتركيز، واستخدام RNA 6000 رقائق بيكو هنا. ويعرَّف الحمض النووي الريبي الجيد النوعية بأنه غير متدهور، ومرئي كخط أساس منخفض مع قمم حادة تقابل الرنا.
  2. RT-qPCR للتحكم في هوية الخلايا التي تم فرزها
    1. إجراء النسخ العكسي مع 2 نانوغرام من مجموع RNAs باستخدام سداسيات عشوائية كمواد أولية. إجراء RT على الحمض النووي الريبي الخلية الثانوية والحمض النووي الريبي الخلية الرئيسية.
      ملاحظة: يمكن تخفيف cDNAs، aliquoted، والاحتفاظ المجمدة للاستخدام في وقت لاحق.
    2. إجراء PCR الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام أزواج التمهيدي المناسبة لتحديد الجينات التدبير المنزلي(ألفا توبولين، 18S rRNA)،الجينات الخلية الثانوية محددة(MSA، Rab19، عبد ب)والجينات الخلية الرئيسية محددة(الببتيد الجنس).

9- التسلسل (إعداد مكتبة اللجنة الوطنية للبيانات والتسلسل وتحليل البيانات)

  1. استخدام 2 نانوغرام من مجموع RNAs لتجميع cDNAs مع التمهيديات polydT. استخدام تكنولوجيا SMARTer لتضخيملهم لتضخيم.
  2. استخدم مجموعة Nextera XT لإعداد المكتبة.
  3. تسلسل يستعمل يتعدّد, 100 [نوكليوتيدس] يقرأ وحيد تسلسل (رغم أنّ 50 [نوكليوتيدس] يقرأ مناسبة ل معظم أغراض) أن ينتج حوالي 30 مليون يقرأ لكلّ عينة.

10. تحليل البيانات

  1. تشغيل FastQC.
  2. استخدم محاذاة STAR لتعيين القراءات على الجينوم المرجعي Drosophila UCSC dm6 وإنشاء ملفات .bam. استخدام عارض الجينوم التكاملي (IGV) لتصور يقرأ على متصفح الجينوم.
  3. استخدام HTSeq لإجراء عمليات عد الجينات.
  4. استخدم طريقة المتوسط المشذب للقيم M (TMM) لتطبيع عدد الجينات22. استخدام edgeR لإجراء تحليل إحصائي للتعبير التفاضلي، والمؤامرات MA والأنيبيسيولا.
  5. لتحليل التعبير الجيني والإحصاءات، استخدم النموذج الخطي العام، شبه المحتمل F-اختبار مع معدل الكشف كاذبة (FDR) وتصحيح Benjamini & Hochberg (BH).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

البروتوكول المعروض هنا يمكّن أحد التجارب من عزل الخلايا الثانوية عن الغدد التبعية الذكور ية دروسوفيلا واستخراج الحمض النووي الريبي في غضون يوم واحد(الشكل 1).

نحن نستخدم بناء عبد-B-GAL4 18 لتسمية الخلايا الثانوية (SC) ولكن ليس الخلايا الرئيسية (MC) مع GFP(الشكل 2A). أحد أهداف هذا الإجراء هو الحصول على نسخة النوع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

طرق انفصال الخلايا من أنسجة دروسوفيلا مثل الأقراص التخيلية هي بالفعل وصف23. فشلت محاولاتنا ببساطة لاستخدام هذه الإجراءات على الغدد الملحقة، وتشجيعنا على تطوير هذا البروتوكول الجديد. وكان الهضم البروتياز وtrituration الميكانيكية الخطوات الحاسمة ونحن troubleshot لنجاح الإجراء، وبالتالي وضعنا العديد من الملاحظات في الأقسام 2 إلى 5 لمساعدة التجارب للحصول على نتائج مرضية. لكي ينجح التفكك، يجب أن تصل البتيدات إلى خلايا الغدة الملحقة، والتي تحميها السوائل المنوية اللزجة في التجويف وطبقة العضلات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ أي كشف.

شكر وتقدير

ونحن ممتنون لأعضاء مختبر "كارش"، وللتشكيل الأنسيولوجي iGE3، والمرفق الأساسي لـ "فلو سيتومتري" التابع لجامعة جنيف، وللدكتور جان بيير أوبري - لاشيناي الذي وضع البروتوكول الخاص بـ FACS. نشكر لوكا ستيكلي على مساعدته في تصور القراءات على IGV. نشكر أنفسنا على الإذن اللطيف لإعادة استخدام الأرقام، والمحررين لدفعتنا إلى أن نكون مبدعين مع الكتابة.

تم تمويل هذا البحث من قبل دولة جنيف (CI، RKM، FK)، والصندوق الوطني السويسري للبحوث (www.snf.ch) (FK وRKM) والتبرعات من مؤسسة كلاراز (FK).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
24 بئرا لوحة زراعة الأنسجةVWR734-2325
مجهر مجهر للتشريح
مجهر مع مصدر ضوء ل GFP
Bunsen
Draq7 0.3 ملي مولارBioStatusDR71000
الأنابيب الدقيقة البلاستيكية 1.5 ملEppendorf
FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios
ملقط تشريح دقيق مصل
بقري الجنينGibco10270-106تم تعطيل الحرارة قبل الاستخدام
الأطباق الزجاجية لتشريح
دلو
ImProm-II نظام النسخ العكسيPromegaA3800
طقم تنقية الحمض النووي الريبي MasterPureمركز MCR85102
Nextera XT kitilluminahttps://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html< / a>
P1000جيلسون
P20Gilson
P200Gilson
Papain50U / mL مخزون
PBSمحلي الصنع
Penicillin-StreptomycinGibco15070-063
بادئات
بادئات سداسية
RNA 6000 طقم بيكوأجيلينت
شنايدر s ذبابة الفاكهة< / em> متوسطGibco21720-001
SMARTer مجموعة توليف cDNATakarahttps://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits< / a>
SYBR حدد المزيج الرئيسي ل CFXالمطبق الأنظمة الحيوية4472942
Thermo ShakerHangzhou Allsheng intrumentsMS-100
Tipone 1250 & mu ؛ L نصيحة متدرجةStarlabS1161-1820
Tipone 200 & mu ؛ طرف مشطوف LStarlabS1161-1800
TrypLE Express EnzymeGibco12604013
Vortex
الثلجPolydTعشوائية

المراجع

  1. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
  2. Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
  3. League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
  4. Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
  5. Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
  6. Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
  7. Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
  8. Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
  9. Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
  10. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  11. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238(2007).
  12. Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Genetics. 202 (3), 1029-1041 (2016).
  13. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
  14. Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
  15. Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
  16. Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
  17. Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
  18. Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395(2013).
  19. Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302(2012).
  20. Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519(2018).
  21. Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
  22. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25(2010).
  23. Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
  24. Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
  25. Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
  26. Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
  27. Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

بروتوكول يستند إلى FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية للغدد التبعي الذكور Drosophila
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.