مقالة منهجية

تصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس الأصفر لوسيفر

DOI:

10.3791/60225

⸱

سبتمبر 14, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles, 2Department of Neurobiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا النجمية هي خلايا معقدة من الناحية الشكلية، وتتمثل في عملياتها المتعددة وأراضيها الكثيفة. لتحليل مورفولوجيا تفصيلا، ونحن نقدم بروتوكول موثوق بها لأداء الأيونتوبهوريس الأصفر داخل الخلايا في الأنسجة الثابتة طفيفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا النجمية هي مكونات أساسية للدوائر العصبية. أنها البلاط الجهاز العصبي المركزي بأكمله (CNS) وتشارك في مجموعة متنوعة من الوظائف, التي تشمل إزالة الناقل العصبي, تنظيم أيون, تعديل متشابك, دعم التمثيل الغذائي للخلايا العصبية, وتنظيم تدفق الدم. الخلايا النجمية هي خلايا معقدة تحتوي على سوما، والعديد من الفروع الرئيسية، والعديد من العمليات الدقيقة التي تتصل بالعناصر الخلوية المتنوعة داخل neuropil. من أجل تقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية ، من الضروري أن يكون لديك طريقة موثوقة واستنساخ لتصور بنيتها. نحن الإبلاغ عن بروتوكول موثوق به لأداء الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من الخلايا النجمية باستخدام الفلورسنت لوسيفر الأصفر (LY) صبغ في أنسجة الدماغ ثابتة طفيفة من الفئران الكبار. هذه الطريقة لديها العديد من الميزات التي هي مفيدة لوصف مورفولوجيا الخلايا النجمية. وهو يسمح بإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية ثلاثية الأبعاد، وهو أمر مفيد لإجراء تحليلات مورفولوجية على جوانب مختلفة من هيكلها. الكيمياء المناعية جنبا إلى جنب مع الأيونتوبهوريسيسي LY يمكن أيضا أن تستخدم لفهم تفاعل الخلايا النجمية مع مكونات مختلفة من الجهاز العصبي وتقييم التعبير عن البروتينات داخل الخلايا النجمية المسمى. ويمكن تنفيذ هذا البروتوكول في مجموعة متنوعة من نماذج الماوس من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي لفحص دقيق مورفولوجيا الخلايا النجمية مع الفحص المجهري الخفيف. يوفر داء الأيونتوبهوريس لي نهجا تجريبيا لتقييم بنية الخلايا النجمية، وخاصة في سياق الإصابة أو المرض حيث يقترح أن تخضع هذه الخلايا لتغيرات مورفولوجية كبيرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا النجمية هي الخلايا الغليفية الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي (CNS). أنها تلعب أدوارا في التوازن أيون, تنظيم تدفق الدم, تشكيل متشابك، فضلا عن القضاء, والناقل العصبي التناول1. وينعكس مجموعة واسعة من وظائف الخلايا النجمية في بنيتها المورفولوجية المعقدة2،3. تحتوي الخلايا النجمية على العديد من الفروع الأولية والثانوية التي تنقسم إلى الآلاف من الفروع الدقيقة والمنشورات التي تتفاعل مباشرة مع نقاط الاشتباك العصبي، dendrites، المحاور، الأوعية الدموية، وغيرها من الخلايا الدبقية. يختلف مورفولوجيا الخلايا النجمية عبر مناطق الدماغ المختلفة، والتي قد تلمح إلى قدرتها على أداء وظائفها بشكل تفاضلي في الدوائر العصبية4. وعلاوة على ذلك، من المعروف أن الخلايا النجمية لتغيير مورفولوجيا أثناء التنمية، وخلال الظروف الفسيولوجية، وفي حالات المرض متعددة3،5،6.

هناك حاجة إلى طريقة متسقة، قابلة للاستنساخ لحل بدقة تعقيد مورفولوجيا الخلايا النجمية. تقليديا، وقد استخدمت الكيمياء المناعية لتصور الخلايا النجمية مع استخدام علامات البروتين الغنية بالخلايا النجمية أو astrocyte محددة. ومع ذلك، تكشف هذه الطرق عن نمط التعبير البروتين بدلاً من بنية الخلايا النجمية. علامات شائعة الاستخدام، مثل البروتين الحمضي الفيبريلي الغليفي (GFAP) وS100 بروتين الكالسيوم ملزمة β (S100β)، لا تعبر في حجم الخلية بأكمله، وبالتالي لا تحل مورفولوجيا كاملة7. يمكن للنهج الوراثية للتعبير عن البروتينات الفلورية في كل مكان في الخلايا النجمية (الحقن الفيروسية أو خطوط مراسل الماوس المعدلة وراثيا) تحديد الفروع الدقيقة والأراضي عموما. ومع ذلك، فمن الصعب التمييز بين الخلايا النجمية الفردية، والتحليلات قد تكون متحيزة من قبل السكان astrocyte المستهدفة من قبل المروج محددة8. وقد استخدم المقطع التسلسلي مجهري الإلكترون للكشف عن صورة مفصلة للتفاعلات من عمليات الخلايا النجمية مع نقاط الاشتباك العصبي. بسبب الآلاف من عمليات الخلايا النجمية الاتصال نقاط الاشتباك العصبي، فإنه من غير الممكن حاليا لإعادة بناء خلية كاملة مع هذه التقنية9، على الرغم من أن هذا من المتوقع أن تتغير مع استخدام نهج التعلم الآلي لتحليل البيانات.

في هذا التقرير، نركز على إجراء لتوصيف الخلايا النجمية للماوس باستخدام أيونتوبهوريس داخل الخلايا مع صبغة لوسيفر الصفراء (LY)، وذلك باستخدام أشعة الطبقة CA1 كمثال. ويستند الأسلوب على العمل السابق الرائد من قبل اريك Bushong ومارك Ellisman10،11. يتم تحديد الخلايا النجمية من شرائح الدماغ ثابتة بخفة من خلال شكل هاسيما مميزة ومليئة LY. ثم يتم تصوير الخلايا مع الفحص المجهري البؤري. نبين كيف يمكن استخدام الأيونوفوريسيس LY لإعادة بناء الخلايا النجمية الفردية وإجراء تحليلات مورفولوجية مفصلة لعملياتها وأراضيها. أيضا، يمكن تطبيق هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع الكيمياء المناعية لتحديد العلاقات المكانية والتفاعلات بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية، والخلايا الدبقية الأخرى، والأوعية الدموية في الدماغ. ونحن نعتبر LY iontophoresis لتكون أداة مناسبة جدا لتحليل مورفولوجيا في مناطق الدماغ المختلفة ونماذج الماوس من الظروف الصحية أو المرض7،12،13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت التجارب الحيوانية في هذه الدراسة وفقا للمعهد الوطني للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية ووافقت عليها لجنة البحوث الحيوانية المستشار في جامعة كاليفورنيا، لوس انجليس. استخدمت الفئران البالغة (6-8 أسابيع) من الجنس المختلط في جميع التجارب.

1. إعداد الحلول

  1. حل السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF)
    1. إعداد حل جديد ACSF (135 M NaCl، 5 M M KCl، 1 M MgCl2،14.7 m NaHCO3،11 mM D-الجلوكوز، 1.25 mM Na2HPO4،و 2 MM CaCl2)قبل كل تجربة. إضافة MgCl2 و CaCl2 في الخطوة الأخيرة. إذابة المكونات في المياه منزوعة الأيونات عالية الجودة.
    2. احتضان حل ACSF في 35 درجة مئوية في حمام مائي وفقاعة مع 95٪ س2/ 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التجربة.
    3. إضافة 2٪ هيدروكلوريد ليدوكائين للوصول إلى تركيز نهائي من 0.02٪ في ACSF (في 100 مل).
  2. الحل المصلح
    1. استخدام 10٪ رسميافين الفوسفات المخزنة مؤقتا.
  3. LY صبغ الحل
    1. إعداد 1.5٪ LY حل صبغ عن طريق حل لي CH ديالليثيوم الملح أو لي CH ديبوتاسيوم الملح في 5 M KCl. دوامة تماما. حجم 1 مل يكفي لعدة تجارب.
    2. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 16800 × ز. ثم، قم بتصفية supernatant مع مرشح حقنة 0.2 م في أنبوب جديد. يمكن الاحتفاظ Aliquots عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
      ملاحظة: من المهم أن تطرد الطرد المركزي وتصفية محلول الصبغة لمنع تجميع جزيئات الصبغة، والتي قد تسد القطب الكهربائي.

2. الماوس عبر التسريب وتشريح الدماغ

  1. إعداد المعدات والفأرة للتسريب عبر العضلة
    ملاحظة:     يمكن استخدام الفئران C57/BL6 من أي من الجنسين. وقد لوحظ تجريبيا أن الطريقة للعمل بشكل موثوق، من المهم أن الفئران ليست أقدم من 3 أشهر (6-8 أسابيع من العمر مثالية). ويرد أدناه وصف لبروتوكول التسريب. ويرد مرجع إضافي لمزيد من التفاصيل14.
    1. واضح أنابيب التسريب مع حل ACSF لإزالة أي فقاعات الهواء في الخط. إعداد أدوات الجراحة حسب ترتيب الاستخدام (ملاقط، منحنية، مقص حادة، مقص قزحية).
    2. التخدير العميق للفأر من خلال وضعه في غرفة تحريض isoflurane، بعد إضافة 2-3 مل من isoflurane إلى الغرفة. السماح بدقيقة واحدة أو دقيقتين للمخدر ليدخل حيز التنفيذ. تأكد من عدم توقف التنفس.
    3. اختبار لقرصة اصبع القدم منعكس. المضي قدما عندما يكون الماوس لا يستجيب لتحفيز الألم وردود الفعل غائبة. تأمين الحيوان في موقف supine مع وضع الرأس في مخروط التنفس مع إمدادات من 5٪ isoflurane في الأكسجين والأطراف والذيل مسجلة أسفل داخل غطاء الدخان الكيميائية.
  2. التسريب عبر الكارديل
    1. باستخدام ملاقط، رفع الجلد تحت القفص الصدري. قم بعمل شق 5-6 سم مع المقص المنحني غير الحاد عبر الجلد لفضح تجويف البطن. قطع صعودا من خلال جدار البطن حتى الكبد والحجاب الحاجز مرئية.
    2. نقل الكبد بلطف بعيدا عن الرسم التخطيطي. مع مقص قزحية العين، قم بعمل شق جانبي 3-4 سم في الحجاب الحاجز.
    3. قطع من خلال القفص الصدري على طول جانبي الجسم لفضح تجويف الصدر. يجب الحرص على عدم تلف القلب وتجنب الرئتين. رفع القص حتى لفضح القلب.
    4. بمجرد ظهور القلب، حقن 0.05 مل من محلول الصوديوم الهيبارين (1000 USP لكل مل) في البطين الأيسر كمضاد للتخثر. ثم، أدخل إبرة التسريب بعناية في البطين الأيسر. تأكد من أن الإبرة تبقى في البطين ولا تخترق غرف القلب الأخرى. قم بعمل شق صغير في الأذين الأيمن مع مقص قزحية العين.
    5. يُملّق مع محلول ACSF بمعدل 10 مل/دقيقة تقريبًا حتى يتم تطهير السائل الموجود في الجسم من الدم (1-2 دقيقة).
    6. التبديل من حل ACSF إلى الحل المثبت دون إدخال أي فقاعات الهواء. مع محلول تثبيتي لمدة 10 دقائق عند 10-20 مل/دقيقة.
      تحذير: الحرص على أن أي حل إصلاحي هو استنزاف من الأنف. وهذا يشير إلى أن الإبرة وصلت إلى البطين الأيمن والمثبت يسافر إلى الرئتين بدلا من خلال الدائرة الجهازية إلى بقية الجسم.
  3. تشريح الدماغ
    1. إزالة رأس الماوس مع مقص وتشريح بعناية من الدماغ الماوس من الجمجمة. ضعها في محلول تثبيتي لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة لفترة قصيرة بعد التثبيت.
      ملاحظة: التسريب الجيد ضروري لنجاح ILY الأيونهوريس. يجب أن يكون الدماغ أبيض اللون وغائب من الدم في الأوعية الدموية في الدماغ. يجب أن يظهر الجسم والأطراف قاسية.

3. إعداد شريحة

  1. إعداد شرائح فرس النهر
    1. غسل الدماغ مع 0.1 M الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم، تجف الدماغ مع ورقة مرشح وإزالة لمبة الشم والمخيخ مع شفرة حلاقة حادة.
    2. جبل الدماغ على علبة الاهتزاز باستخدام الغراء cyanoacrylate وملء علبة مع PBS في درجة حرارة الغرفة. قطع أقسام الإكليل فرس النهر من سمك 110 درجة مئوية.
      ملاحظة: ضبط إعداد الاهتزاز للتأكد من أن شرائح لها نفس سمك وحتى السطح. لهذه التجربة، تم استخدام إعداد السرعة من 4.5 وإعداد تردد من 8، والتي هي إعدادات تعسفية على الصك(جدول المواد). قد يحتاج المستخدمون إلى تجربة الإعدادات على الأجهزة الأخرى.
    3. جمع المقاطع من علبة ووضعها في طبق من PBS على الجليد.

4. إعداد القطب الكهربائي

  1. إعداد قطب حاد مع المقاومة المناسبة.
    1. استخدام زجاج البورسليكات قطب برميل واحد مع خيوط (O.D. 1.0 مم، I.D. 0.58 مم). سحب قطب كهربائي على سحب micropipette(جدول المواد). الأقطاب الكهربائية المثالية مليئة 1.5٪ LY في 5 MM KCl يجب أن يكون لها مقاومة من 200 MΩ عند وضعها في حمام من PBS.
      ملاحظة: يختلف إعداد الساحبة اعتمادا على الجهاز (نوع من آلة المستخدمة وخيوط puller). عادة ما يعطي إعداد الحرارة العالي نصائح أطول وأدق. لبكرة micropipette المستخدمة في هذه التجربة، وكانت الإعدادات: الحرارة: 317، وسحب: 90، والسرعة: 70، والتأخير: 70. تم استخدام خيوط من نوع الحوض الصغير.
    2. تخزين الأقطاب الكهربائية في حاوية مغلقة لمنع الغبار من دخول طرف. الحفاظ على الأقطاب الكهربائية مرتفعة من الجزء السفلي من المربع لمنع طرف من كسر.
  2. ملء القطب الكهربائي مع LY صبغ الحل.
    1. ضع قطب كهربائي في وضع عمودي مع طرف تواجه إلى أسفل. ماصة 1-2 درجة مئوية من محلول LY في الجزء الخلفي من القطب والانتظار لمدة 5-10 دقائق للحل للانتقال إلى طرف عن طريق العمل الشعرية.
    2. قم بتأمين القطب المملوء بلطف في حامل القطب الكهربائي المتصل بالمتلاعب.
      ملاحظة: الأسلاك الفضية لحامل القطب الكهربائي يجب أن تكون على اتصال مع LY داخل القطب الكهربائي. ضبط حجم الحل LY إذا لزم الأمر، اعتمادا على طول السلك.

5. ملء الخلايا النجمية مع الأيونة

  1. اختبار القطب الكهربائي.
    1. ضع شريحة الدماغ برفق في طبق سفلي زجاجي مملوء بـ 0.1 مليون دولار في درجة حرارة الغرفة. عقد شريحة في مكان مع القيثارة البلاتين مع سلاسل النايلون.
    2. تأكد من توصيل القطب الكهربائي بمصدر الجهد ووضع القطب الأرضي في الحمام الذي يحتوي على شريحة الدماغ.
    3. نقل الهدف إلى منطقة الدماغ من الفائدة.
    4. خفض القطب الكهربائي في الحل. تحت الحقل الساطع، نقله إلى مركز مجال الرؤية وفحصه بعناية مع عدسة غمر المياه 40X للتأكد من أنه يبدو واضحا وبدون حطام أو فقاعات. إذا كان هناك أي شيء انسداد طرف القطب الكهربائي، واستبداله ابد.
      ملاحظة: انسداد هو مصدر قلق للقطب 200 MΩ. مع الطرد المركزي والترشيح من حل صبغ قبل كل تجربة، وهذا لا ينبغي أن يكون مشكلة متكررة. ومع ذلك، لأن طرف القطب هو صغير، قد تصبح الأنسجة عالقة في بعض الأحيان في الافتتاح. لم يجد المؤلفون طريقة لمنع ذلك، ولكن يمكن التعامل معها بسهولة ببساطة باستخدام قطب كهربائي جديد.
    5. مراقبة غيض من القطب تحت المجهر الليزر المسح الضوئي مع الليزر 488 نانومتر. ثم، اختبار طرد صبغ عن طريق تشغيل محفز في 12 V. لاحظ سحابة صبغ الفلورسنت كبيرة حول غيض من القطب في حين أن محفز هو على. إذا لم يتم إخراج أي صبغة أو القليل عند تحفيز الجهد، استبدل القطب الكهربائي.
    6. تحت الحقل الساطع، خفض ببطء القطب نحو شريحة وقف فقط فوق السطح.
  2. ملء الخلايا النجمية مع الأيونة.
    1. تحديد الخلايا النجمية 40-50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة مع تباين التداخل التفاضلي بالأشعة تحت الحمراء (IR-DIC). ابحث عن الخلايا ذات السوماتا على شكل بيضاوي حوالي 10 ميكرومتر في القطر. بمجرد اختيار الخلايا النجمية، نقله إلى مركز مجال الرؤية.
      ملاحظة: خلية جيدة لiontophoresis لديها حدود واضحة ومحددة من حوله. لا تختار الخلايا القريبة جدا من سطح الشريحة لأنه لا يمكن تعبئتها تماما. يستغرق بعض الممارسة على مدى بضعة أيام لتكون قادرة على تحديد الخلايا النجمية بشكل روتيني لملء الصبغة. اعتمادا على منطقة الدماغ المستخدمة في التجربة، قد يختلف عدد الخلايا النجمية. قد يؤثر هذا على الوقت اللازم لتحديد الخلايا النجمية قبل الملء.
    2. قم بتقليل طرف القطب الكهربائي ببطء في الشريحة، والتنقل عبر الأنسجة، حتى يكون على نفس المستوى مثل جسم الخلية.
      ملاحظة: تحريك القطب ببطء لتجنب إتلاف الأنسجة.
    3. مرة واحدة في الجسم الخلية من الخلايا النجمية مرئية بوضوح والمبينة، ببطء وبلطف تقدم القطب إلى الأمام. نقل القطب الكهربائي حتى طرف يصطدم سوما من الخلية. نقل التركيز على الهدف ببطء صعودا وهبوطا لملاحظة ما إذا كان القطب هو داخل سوما.
      ملاحظة: يجب أن يكون طرف القطب الكهربائي داخل جسم الخلية، وينبغي ملاحظة مسافة بادئة صغيرة على السوما. لا تحرك القطب أي أبعد من ذلك لتجنب تلميح يمر عبر الخلية.
    4. بمجرد أن يكون طرف القطب الكهربائي داخل الخلية، قم بتشغيل المحفز عند حوالي 0.5−1 فولت وطرد التيار باستمرار إلى الخلية. باستخدام المجهر البؤري، ومشاهدة ملء الخلية. قم بزيادة التكبير/التصغير الرقمي لمعرفة تفاصيل الخلية وتأكد من أن طرف القطب الكهربائي مرئي داخل الخلية.
      ملاحظة: خفض الجهد إذا كان يبدو أن صبغ يتسرب من الخلية أو ملء خلايا أخرى في المنطقة المجاورة. إذا كان يبدو أن الصبغة لا تزال تتسرب من الخلية، وسحب القطب ببطء والعثور على خلية أخرى. من المهم أن الصبغة لا تسرب أن يكون إشارة عالية / نسبة الخلفية في الصورة النهائية.
    5. انتظر حوالي 15 دقيقة حتى تظهر أدق الفروع والعمليات محددة، وإيقاف الجهد وسحب بلطف طرف القطب الكهربائي من الخلية.
  3. صورة الخلية المعبأة.
    ملاحظة:     يمكن إجراء التصوير مباشرة بعد ملء أو بعد تلطيخ مع الكيمياء المناعية. يؤدي الهدف ذو الفتحة الرقمية الأعلى (NA) إلى دقة أفضل.
    1. انتظر حتى تعود الخلية إلى النموذج الأصلي قبل التصوير (15-20 دقيقة) بهدف 40 x. لتصوير الخلية، اضبط الإعداد على البؤرة للتأكد من أن الفروع والعمليات الدقيقة تظهر معرّفة.
    2. إعداد مكدس z بحجم خطوة 0.3 ميكرومتر. أثناء التصوير، حرك الهدف حتى لا يكون هناك إشارة من الخلية وتعيين ذلك كأعلى. ثم، نقل الهدف إلى أسفل (التركيز من خلال الخلية) حتى لا يكون هناك إشارة، تعيين ذلك كما أسفل.
    3. بعد اكتمال التصوير، تحقق من القطب الكهربائي لطرد الصبغة. إذا ظهرت سحابة صبغ كبيرة، يمكن استخدامها للشريحة التالية. وإلا، استبدله بقطب كهربائي جديد.
      ملاحظة: صبغ ملء astrocyte واحد والتصوير يستغرق حوالي 45 دقيقة إلى 1 ساعة. لهذه التجربة المحددة، كان من الممكن الحصول على حوالي 3-6 خلايا لكل ماوس. إذا لزم الأمر، يمكن تسمية خلايا متعددة على نفس الشريحة. ومع ذلك، للتمييز بين الخلايا النجمية الفردية، تأكد من الحفاظ على مسافة حوالي 200 ميكرومتر بين الخلايا.

6. تلطيخ مع الكيمياء المناعية (اختياري)

  1. بمجرد الانتهاء من التصوير، على الفور وضع شريحة في 10٪ رسمي على الجليد للحفاظ على الكيمياء المناعية. الحفاظ على شرائح الدماغ في الظلام وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. غسل أقسام الدماغ 3X في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية (أي، تريتون X 100) لمدة 5 دقائق لكل منهما. ثم احتضان في حل حجب من 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية و 10٪ مصل الماعز العادي (NGS) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع التحريض لطيف.
  3. حضانة الأقسام مع التحريض في الأجسام المضادة الأولية المخففة في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية و 5٪ NGS لمدة 2 أيام في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بسبب سمك شرائح الدماغ ، تحتاج فترة حضانة الأجسام المضادة الأولية إلى تمديدها لتحسين الاختراق ويمكن زيادة تركيز الأجسام المضادة. في هذه التجربة، تم استخدام تخفيف 1:500 لمكافحة GFAP الأجسام المضادة وتم استخدام تخفيف 1:500 لمكافحة aquaporin-4 الأجسام المضادة.
  4. غسل الأقسام 3X في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية لمدة 10 دقيقة لكل منهما ومن ثم حضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 0.1 M PBS مع 0.5٪ السطحي غير الأيونية و 10٪ NGS لمدة 6 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: لا تختار الأجسام المضادة الثانوية متحمس من قبل 488 نانومتر، وهو الطول الموجي المستخدمة لتصور صبغLY. في هذه التجربة، تم استخدام تخفيف 1:1000 لاليكسا فلور 546 الماعز المضادة للدجاج IgG (H + L) واليكسا فلور 647 الماعز المضادة للأرنب IgG (H + L).
  5. شطف المقاطع 3X في 0.1 M PBS لمدة 10 دقيقة لكل منهما. ثم جبل المقاطع على الشرائح المجهر الزجاجي في تصاعد وسائل الإعلام المناسبة للفلورة. ختم الشرائح. خلايا الصورة في حجم خطوة من 0.3 ميكرومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيانات الواردة في هذه الدراسة هي من 7-12 خلية من 4 فئران في كل تجربة. ويُبلَّغ عن متوسط البيانات في أفرقة الأرقام حسب الاقتضاء.

لتقييم مورفولوجيا الخلايا النجمية، قمنا بإجراء تيونات الخلايا باستخدام صبغLY لملء الخلايا النجمية في الطبقة CA1 رادياتوم، والتي يتم تلخيصها في الشكل 1. يصور الشكل 2 الخلايا النجمية التمثيلية وبنيتها المورفولوجية المعقدة. تم تصوير الخلية بعد التثبيت مع عدسة الغمر بالزيت 60x على مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري باستخدام خ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطريقة المبينة في هذه الورقة تصف طريقة لتصور مورفولوجيا الخلايا النجمية باستخدام الأيونتوبهوريس داخل الخلايا من صبغ LY في شرائح الدماغ ثابتة قليلا. هناك العديد من العوامل الحاسمة التي تم تسليط الضوء عليها في هذا البروتوكول التي تسهم في نجاح LY الأيونتوبهوريسوإعادحي المورفولوجية للخلايا. أحد العوامل هو نوعية واستنساخ الصور، والتي يتم تحديدها إلى حد كبير من قبل عمر الماوس ونتيجة التسريب. في هذه الدراسة، استخدمنا الفئران C57/BL6N 6-8 أسابيع من العمر. التسريب الناجح (يعتمد إلى حد كبير على التنسيب السليم للإبرة المندمجة ولاح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويشكر أصحاب البلاغ السيدة سوتو والدكتور يو والدكتور أوكتو على التوجيه وكذلك على التعليقات على النص. هذا العمل معتمد من قبل NS060677.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ مخزن فورمالين فوسفاتفيشرSF 100-20يمكن استخدام بديل مماثل
مرشحات حقنة Acrodisc مع غشاء سوبورPall 4692استخدام بديل مماثل
Ag / AgCl الحبيبات الأرضيةWPIEP2استخدام بديل مماثل
Alexa Fluor 546 الماعز المضاد للدجاج IgG (H + L)Thermo ScientificA-11040يمكن استخدام بديل مماثل
Alexa Fluor 647 الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L)Thermo ScientificA27040يمكن استخدام بديل مماثل
الأجسام المضادة المضادة للأكوابورين -4Novus BiologicalsNBP1-87679يمكن استخدام بديل مماثل
للجسم المضاد ل GFAPAbcamab4674يمكن استخدام بديل مماثل
ماصات زجاجية من البورسليكات مع خيوطأدوات الدقة العالمية1B150F-4
C57BL / 6NTac الفئرانتاكونيك الأسهمB6يمكن استخدام بديل مماثل
كلوريد الكالسيومسيجما21108يمكن استخدام بديل مماثل
مجهر المسح بالليزر متحد البؤرأوليمبوسFV1000MPEيمكن استخدام بديل مماثل
D-glucoseSigmaG7528متطابق يمكن استخدام البديل
ثنائي فوسفات الصوديومسيجما255793يمكن استخدام بديل مماثل
مجتذب القطب الكهربائي- موديل P-97SutterP-97استخدام بديل مماثل
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01استخدام بديل مماثل
حقن الصوديوم الهيبارين (1,000 USP لكل مل)Sagent Pharmaceuticals400-10يمكن استخدام بديل مماثل
لبرنامج Imaris (الإصدار 7.6.5)Bitplane Inc.يمكن استخدام بديل مماثل
IsofluoraneHenry Schein Animal Health29404استخدام بديل مماثل
Lidocaine Hydrochloride للحقن (2٪)Clipper1050035يمكن استخدام بديل مماثل
لوسيفر الأصفر CH ملح ثنائي الليثيومSigmaL0259
لوسيفر الأصفر CH ملح ثنائي البوتاسيومSigmaL0144
كلوريد المغنيسيومسيجماM8266استخدام بديل متطابق
مجهر زجاجيحراري علمي24X60-1يمكن استخدام بديل متطابق
شرائح مجهرفيشر12-544-2استخدام بديل متطابق
مختبرات ناقلاتمصل الماعزالعادي S-1000استخدام بديل مماثل
عدسة موضوعية (40x)OlympusLUMPLFLN 40XWيمكن استخدام بديل مماثل
عدسة موضوعية (60x)OlympusPlanAPO 60Xيمكن استخدام بديل مماثل
أقراص PBS ، 100 ملVWRVWRVE404استخدام بديل مماثل
مناور الماصة الدقيقة - موديل ROE-200SutterMP-285 / ROE-200 / MPC-200أن يكون بديل مماثل تستخدم
كلوريد البوتاسيومسيجماP3911استخدام بديل متطابق
بيكربونات الصوديومسيجماS5761استخدام بديل مماثل
كلوريد الصوديومسيجماS5886يمكن استخدام بديل متطابق
المحفز- نموذج Omnical 2010أدوات الدقة العالميةOmnical 2010استخدام بديل مماثل
تريتون X 100سيجماT8787يمكن استخدام بديل مماثل
Vibratome- موديل # 3000Pelco100-Sيمكن استخدام بديل مماثل
يمكن يمكن يمكن يمكن يمكن يمكن غطاء يمكن يمكن يمكن يمكن يمكن يمكن يمكن

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
  2. Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
  3. Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261(2018).
  4. Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
  5. Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
  6. Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
  7. Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
  8. Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143(2013).
  9. Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
  10. Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
  11. Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
  12. Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
  13. Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neuroscience. 113 (1), 221-233 (2002).
  14. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  15. Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
  16. Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
  17. Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096(2015).
  18. Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
  19. Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
  20. Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
  21. Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
  22. Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
  23. Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
  24. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة