هنا نقوم بوصف طريقة التصوير الحي في المختبر لتصور النقل داخل الخلايا من العضيات والاتجار ببروتينات غشاء البلازما في الخلايا النجمية المورين. ويقدم هذا البروتوكول أيضا منهجية لتحليل الصور لتحديد مسارات نقل البضائع وحركيتها.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصور وتحليل النقل داخل الخلايا من العضيات وغيرها من الشحنات في الخلايا النجمية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا النجمية هي من بين أنواع الخلايا الأكثر وفرة في الدماغ الكبار، حيث أنها تلعب أدوارا رئيسية في تعدد الوظائف. كلاعب مركزي في التوازن الدماغي، توفر الخلايا النجمية الخلايا العصبية مع الأيض الحيوي والمياه العازلة خارج الخلية، والأيونات، والغلوتامات. جزء لا يتجزأ من متشابك "ثلاثي الأطراف"، والخلايا النجمية هي أيضا حاسمة في تشكيل، وتقليم، والصيانة، وتعديل نقاط الاشتباك العصبي. لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها ومع الخلايا الدبقية الأخرى، والخلايا العصبية، والأوعية الدموية الدماغ، والبيئة خارج الخلية من خلال العديد من البروتينات غشاء المتخصصة التي تشمل الخلية جزيئات التصاق، aquaporins، قنوات أيون، الناقلالعصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. لدعم هذا التدفق الديناميكي، تعتمد الخلايا النجمية، مثل الخلايا العصبية، على النقل داخل الخلايا المنسق والصارم. وعلى عكس الخلايا العصبية، حيث تم تحديد الاتجار داخل الخلايا على نطاق واسع، فإن النقل القائم على الأنابيب الدقيقة في الخلايا النجمية كان أقل دراسة. ومع ذلك، فإن الاتجار الخارجي والداخلي لبروتينات غشاء الخلية ونقل الأعضاء داخل الخلايا ينظم البيولوجيا الطبيعية للخلايا النجمية، وغالبا ً ما تتأثر هذه العمليات بالمرض أو استجابة للإصابة. هنا نقدم بروتوكول اعلام يُقدم مباشرة للثقافة ذات جودة عالية من الخلايا النجمية، لتسمية البروتينات الفلكية والعضيات ذات الأهمية، وتسجيل ديناميات النقل داخل الخلايا باستخدام الفحص المجهري البؤري الفاصل زمنياً. كما نبين كيفية استخراج وتحديد معايير النقل ذات الصلة من الأفلام المكتسبة باستخدام برامج تحليل الصور المتاحة (أي ImageJ /FIJI) الإضافات.
المقدمة
الخلايا النجمية هي الخلايا الأكثر وفرة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين، حيث أنها تؤدي وظائف تنموية ومنزلية فريدةمننوعها 1. Astrocytes تحوير تطوير متشابك من خلال الاتصال المباشر مع محطات ما قبل وpostsynaptic كجزء من متشابك ثلاثي الأطراف، والذي يحتوي على مستقبلات الناقل العصبي، وناقلات، وجزيئات التصاق الخلايا التي تسهل تشكيل متشابك والخلايا العصبية-astrocyte الاتصالات2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا النجمية تتحكم بنشاط في انتقال متشابك ومنع السمية الطاردة للخلايا العصبية عن طريق إزالة الناقلات العصبية المحفزة بسرعة من المشقوق متشابك، وإعادة تدوير الناقلات العصبية، والمشاركة في تقليم متشابك3 , 4 , 5 , 6.لتمكين هذه الوظائف التفاعلية للغاية، والخلايا النجمية التواصل فيما بينها، مع الخلايا الدبقية الأخرى، ومع الخلايا العصبية من خلال بروتينات الغشاء المتخصصة، بما في ذلك جزيئات التصاق الخلية، aquaporins، قنوات أيون، الناقل العصبي، وجزيئات تقاطع الفجوة. الخلايا النجمية تغير بنشاط مستويات سطح هذه البروتينات استجابة للتقلبات في بيئتها داخل الخلايا وغير الخلوية7. وعلاوة على ذلك، فإن التغيرات في مستويات وتوزيع الميتوكوندريا، قطرات الدهون، والعضيات المهينة وإعادة التدوير تحوير إمدادات الطاقة، وتوافر المستقلب، وعمليات المقاصة الخلوية التي تعتبر ضرورية لوظيفة الخلايا النجمية و بقاء.
يتم تسهيل التغيرات الديناميكية في الاتجار ببروتين الغشاء وorganelle وتحديد المواقع في الخلايا النجمية من خلال وظيفة منسقة من البروتينات الحركية ومحولات التي تعزز حركة البضائع8،9. وبالمثل، يتم تعديل مستويات السطح من بروتينات الغشاء من خلال الاستيعاب وإعادة التدوير الأحداث10. يتم نقل هذه الشحنات عن طريق شبكة معقدة من الأكتين، microtubules، وربما خيوط وسيطة المسارات8. تشير الدراسات المستندة إلى تلطيخ الفلورة المناعية للبروتين النهائي الملزم 1 (EB1)، الذي يتراكم في الأنابيب الدقيقة المتنامية بالإضافة إلى النهايات، إلى أنه في حزم الخلايا النجمية من الأنابيب الدقيقة تشع من النوى المحيطية وتمتد نهايتها الزائدة نحو محيط11. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص في الفحص الشامل لتنظيم وقطبية الأنابيب الدقيقة وغيرها من العناصر الخلوية الهيكلية باستخدام التصوير بالخلايا الحية. في حين أن العديد من الآليات الكامنة وراء ديناميات العضيات والبروتينات الغشاء قد درست على نطاق واسع في الخلايا العصبية وأنواع الخلايا الأخرى، وحركة البضائع في الخلايا النجمية هو أقل فهما جيدا. ويستند معظم معرفتنا الحالية حول التغيرات في توزيع البروتين والجهاز في الخلايا النجمية على وضع العلامات التقليدية المستندة إلى الأجسام المضادة من إعداد ثابت، مما يحول دون الفحص المكاني والزمني الدقيق لديناميات البضائع7، 12.
هنا، ونحن نصف طريقة لتسمية البروتينات غشاء والعضيات للتصوير الحي في الثقافات الماوس التبويض ة الأولية عالية النقاء. باستخدام هذا البروتوكول، نقدم أمثلة نتتبع فيها التوطين الديناميكي للبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) - البروتينات الغشاء الموسومة في الخلايا النجمية المنقولة، بما في ذلك تقاطع الفجوة البروتين connexin 43 (Cx43-GFP) والأحماض الأمينية المحفزة الناقل 1 (EAAT1-GFP). كما نوصف استخدام مسبار حمضي فلورسنت لتصور العضيات الحمضية واتباع ديناميات الاتجار بها في الخلايا النجمية الحية. وأخيرا، نبين كيفية تحليل بيانات الفاصل الزمني لاستخراج وتقييم بارامترات النقل لفرادى الشحنات.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة جامعة كارولينا الشمالية في لجنة تشابل هيل للعناية بالحيوان واستخدامه (IACUC).
1. تشريح الدماغ وثقافة الخلايا النجمية الماوس الأولية
ملاحظة: تم تكييف البروتوكول التالي من الأساليب المنشورة، والذي يتبع الإجراء الأصلي الذي وضعه مكارثي وديفيليس13،14،15. يتم إعداد ثقافات الخلايا المختلطة من الخلايا النجمية McCarthy/deVellis (MD) من القشريات الماوس بعد الولادة 2−4 (P2−P4)، وتعامل مع عامل مضاد للميثوتيك، ويتم تنقيتها لتسفر عن ثقافة الخلايا النجمية الغنية النهائية. أربعة القشريات من الجرو الماوس من أي من الجنسين كافية لتوليد ثقافة واحدة T75 ثقافة الأنسجة قارورة.
- معطف الجزء السفلي من قوارير T75 (100٪ الوصول إلى الرقبة الزاوية، 0.22 ميكرومتر غطاء مرشح تنفيس للماء) مع بولي-D-يسين (1 ملغ / مل في 0.1 M تريس العازلة، درجة الحموضة 8.5) وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل بدء تشريح.
- قبل البدء في إجراء التشريح، دافئ 30 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية (دولبيكو تعديل النسر المتوسطة [DMEM] الجلوكوز عالية، 10٪ الحرارة المعطلة مصل البقر الجنيني، 1٪ البنسلين / العقديات) في 37 درجة مئوية وذوبان aliquot 5 مل من 2.5٪ تريبسين على الجليد. إعداد اثنين من أطباق تشريح (60 ملم قطرها) على الجليد مليئة 6 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) دون Ca2+ أو ملغ2 +.
- تطهير جميع الأدوات الجراحية (ملاقط طرف غرامة، مقص تشريح، مقص Vannas على التوالي، ملقط Graefe مع نصائح منحنية) في 70٪ الإيثانول قبل وبين كل تشريح.
- رش رأس ورقبة الجراء الماوس P2−P4 مع الإيثانول 70٪ قبل قتلها بسرعة عن طريق قطع الرأس مع مقص الجراحية. إجراء شق خلفي إلى خط الوسط الأمامي على طول فروة الرأس لفضح الجمجمة. قطع الجمجمة بعناية من الرقبة إلى الأنف.
- قم بإجراء شقين جانبيين إضافيين متفوقين على العينين. باستخدام ملاقط طرف غرامة الوجه بلطف اللوحات الجمجمة إلى الجانب. إزالة الدماغ ووضعها في أول طبق تشريح مليئة HBSS الجليد الباردة دون كاليفورنيا2 + أو ملغ2 +. الحفاظ على الطبق على الجليد ومواصلة حصاد بقية العقول.
ملاحظة: تنفيذ باقي إجراء تشريح ضمن نطاق تشريح. - إزالة المصابيح الشمباستخدام مقص Vannas أو ملاقط غرامة (الشكل1منظمة المؤتمرالدولي). مع ملقط طرف منحني عند تقاطع الشقوق العرضية وداخل الغلاف الغربي، أدخل بلطف زوج ثان من ملقط طرف منحني بين القشرة وثنائي الدماغ، وفتح ببطء ملقط لفصل نصف الكرة الدماغية عن بقية الدماغ (الشكل1AII، Aiii). إزالة الأنسجة غير المرغوب فيها (الشكل1Aiv).
- لكل نصف الكرة القشرية، وإزالة بعناية السحايا مع ملاقط طرف غرامة. اختياريا، إزالة الحصين من القشرية. نقل القشرية الماوس تشريح في طبق ثان مليئة HBSS الجليد الباردة دون كاليفورنيا2 + أو ملغ2 + والحفاظ عليه على الجليد أثناء تشريح العقول المتبقية.
ملاحظة: إجراء الخطوات التالية في ظل ظروف العقيم في غطاء محرك السيارة تدفق laminar. - قطع القشرية المعقمة إلى قطع صغيرة (حوالي 2-4 مم) باستخدام مقص جراحي حاد معقم أو مشرط. نقل الأنسجة تشريح إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على محلول إنزيم (22.5 مل HBSS دون كاليفورنيا2 + أو ملغ2 +، 2.5 مل 2.5٪ تريبسين). الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع انعكاس لطيف كل 10 دقيقة.
- جمع الأنسجة المهضومة عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة محلول الإنزيم عن طريق decantation (لا تستخدم الأسبرين فراغ). أضف 10 مل من وسائط زراعة الخلايا النجمية وفصل الأنسجة إلى خلايا مفردة عن طريق توجيه محلول 20-30x باستخدام ماصة مصلية تبلغ 10 مل.
- قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة خلايا بـ 70 ميكرومتر لتقليل كتل الخلايا والأنسجة غير المهضومة. جمع filtrate في أنبوب مخروطي 50 مل نظيفة وضبط حجم إجمالي إلى 20 مل مع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية. عند هذه النقطة، تقييم كفاءة التفكك القشري عن طريق خلط 10 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 10 ميكرولتر من الأزرق التربان وخلايا العد مع مقياس الهيموكيتومي.
ملاحظة: ينتج عن إعداد واحد من أربعة من القشريات الماوس P2−P4 10−15 × 106 خلايا مفردة. - قم بإستنشق محلول طلاء البولي د-ليسين من قوارير الثقافة T75 واغسلمرتين بالماء المعقم. لوحة تعليق الخلية 20 مل وحضانة في 37 درجةمئوية و 5٪ CO 2.
2- تنقية الثقافات النجمية والحفاظ عليها
ملاحظة: إجراء جميع التغييرات وسائل الإعلام في ظل ظروف العقيم في غطاء محرك السيارة تدفق laminar باستخدام معقمة تصفية (0.22 ميكرومتر غشاء فلتر) وسائل الإعلام astrocyte ارتفعت درجة حرارة إلى 37 درجة مئوية.
- استبدال وسائل الإعلام الخلية 48 ساعة بعد الطلاء (يوم في المختبر 2، DIV2).
- في DIV5، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية الطازجة تكملها 10 μm السيتوسين أرابينوسيد (AraC).
ملاحظة: تسهل هذه الخطوة إزالة الخلايا الملوثة، بما في ذلك الخلايا الليفية وغيرها من الخلايا الدبقية. من المهم التعامل مع الثقافات مع AraC لا يزيد عن 48 ساعة كما أطول أوقات الحضانة سوف تقلل من قابلية الخلاياالنجمية. - في DIV7، تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية دون AraC والبدء في التحقق من الملاءمة الثقافة يوميا. مرة واحدة وقد وصلت الخلايا 80٪ التقاء، معطف اثنين-T75 قارورة لكل قارورة ثقافة الخلايا النجمية غير المنقية مع بولي د-يسين وحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعة على الأقل إلى بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، تبدأ تنقية الخلايا النجمية عن طريق هز قوارير الثقافة في 180 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في حاضنة الهز المداري37 درجة مئوية. إزالة وسائل الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية جديدة. هز الخلايا في 240 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعة في حاضنة اهتزاز مدارية 37 درجة مئوية. قبل الدفء 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS)، وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية، و 0.25٪ تريبسين-EDTA إلى 37 درجة مئوية 20-30 دقيقة قبل نهاية فترة الهز.
ملاحظة: الحضانة CO2غير مطلوب أثناءخطوات الاهتزاز. إذا رغبت في ذلك، يمكن استخدام وسائل الإعلام التي تم جمعها بعد خطوات الهز 30 دقيقة و 6-ح لثقافة microglia وoligodendrocytes، على التوالي. ومع ذلك، فإن معالجة AraC للثقافة المختلطة سوف تقلل من وفرة الخلايا الغليفية الأخرى. - إزالة قوارير الثقافة من شاكر واستبدال وسائل الإعلام على الفور مع 10 مل من PBS 1X الدافئة لكل قارورة. إزالة PBS وإضافة 3 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA لكل قارورة. حضانة في 37 درجة مئوية و5٪ CO 2، والتحقق من كل 5 دقائق للمفرزة.
- مرة واحدة وقد فصلت الخلايا من قارورة، ووقف trypsinization عن طريق إضافة 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية. نقل الخلايا النجمية منفصلة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وخلايا بيليه عن طريق الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق.
- اغسل القوارير T75 المغلفة بالبولي-د-ليسين مرتين بالماء المعقم واللوحة 20 مل من تعليق الخلايا النجمية النقية. العودة إلى حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تغيير وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية كل يومين لمدة 10 أيام إضافية حتى تنضج الخلايا النجمية.
ملاحظة: يجب أن تكون كل قارورة T75 من الخلايا النجمية النقية كافية لإنتاج 2 قوارير T75 جديدة مع 3 × 105 خلايا لكل منها في الطلاء. - كرر الخطوات 2.5−2.7 للتمريرات اللاحقة أو للخلايا النجمية لللوحة للتنظير المجهري.
ملاحظة: يمكن تقييم نقاء الثقافات النجمية بعد إضافة AraC وتنقية التالية نوعيا من خلال الفحص المجهري brightfield، أو على وجه التحديد عن طريق تحديد النسبة المئوية للبروتين حمض الرجفان الغليفي (GFAP) إيجابية الخلايا لكل مجال من مجالات الرؤية في الصور الفلورية (الشكل1B,C).
3. Transfection من بلازميدات ذات علامات فلورية
- في اليوم السابق للانقبة أو وضع العلامات، تُعد الخلايا النجمية للبذور بالكثافة المطلوبة للتصوير 24-48 ساعة بعد الانعطاف. الكثافة الموصى بها للوحات 24 جيدا أو 14 ملم الآبار الزجاجية أسفل هو 2 × 104 خلايا / جيدا.
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لتبديل الخلايا النجمية مطلية على الأغطية الزجاجية 12 مم على لوحات 24 جيدا أو 14 ملم الآبار الزجاجية القاع باستخدام طريقة المستندة إلى lipofection. وينبغي قياس الكواشف اعتمادا على حجم طبق الثقافة التي تنمو فيها الخلايا النجمية. - تخفيف كاشف lipofection(جدولالمواد) في وسائل الإعلام ذات المصل المنخفض (جدولالمواد). لتحسين نسبة كاشف lipofection إلى الحمض النووي، اختبار مجموعة من التخفيفات كافية. على سبيل المثال، إذا كان استخدامالكاشف المستخدم في هذا البروتوكول (جدول المواد)، تمييع 2، 3، 4، و 5 ميكرولتر من كاشف lipofection في 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام ذات المصل المنخفض.
- تمييع 5 ميكروغرام من الحمض النووي عالي النقاء في 250 درجة مئوية من وسائل الإعلام ذات المصل المنخفض. إضافة 5 ميكرولتر من كاشف محسن lipofection (جدولالمواد). الجمع بين الأنبوب الذي يحتوي على كاشف lipofection مع حجم متساو من مزيج محسن الحمض النووي lipofection. يُمزج المزيج بواسطة الأنابيب والحضانة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
- إزالة وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية وإضافة مزيج التغوط (الخطوة 3.3) إلى الخلايا إسقاط. بعد حضانة 6-h في 37 درجة مئويةو 5٪ CO 2، استبدال مجمع التغوط مع حجم مناسب من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية (2 مل ل14 ملم الأطباق الزجاجية القاع). احتضان لمدة 24-72 ساعة إضافية قبل الشروع في الحصول على الصورة. مراقبة عن كثب مدة خطوة الحضانة لتحقيق أفضل توازن بين التعبير البروتين وبقاء الخلية.
4. وضع العلامات من بطانة في وقت متأخر / lysosomes باستخدام تحقيقات الفلورسنت
ملاحظة: يمكن تسمية بعض الشحنات باستخدام الأصباغ الفلورية مع تقارب عالية للبروتينات الخاصة بالبضائع. يسمح المثال التالي بوضع العلامات على البطانة/الليسوسوم المتأخرة مع مسبار حمضي فلورسنت.
- تمييع مسبار وضع العلامات الليسوسومال (جدولالمواد)في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلايا النجمية إلى تركيز عمل قدره 1 ميكرومتر وتنطبق على الخلايا النجمية من الخطوة 3.1 في كثافة 2 × 104 خلايا / جيدا. حضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا مرة واحدة مع وسائل الإعلام ثقافة الخلاياالنجمية الدافئة واستبدالها مع وسائل الإعلام التصوير (جدول المواد). انتقل إلى التصوير الحي على الفور.
5. الحصول على الصور باستخدام نظام التصوير الفاصل الزمني
ملاحظة: يجب أن يتم التصوير الحي بفاصل زمني باستخدام مجهر الفلورة المجهز بكاميرا عالية السرعة، وتركيز محدد، وغرفة حضانة، وهدف زيت 40x مع فتحة رقمية عالية (على سبيل المثال، Plan-Apochromat 1.4NA). تتوفر مجموعة متنوعة من برامج الاقتناء للتصوير بالفاصل الزمني. وينبغي أن يستند اختيار نظام الفحص المجهري وبرامجيات الاقتناء إلى توافرها وملاءمتها لأهداف الدراسة المعنية. وترد أدناه بعض المبادئ التوجيهية العامة.
- وضع غرفة الثقافة أو طبق في محول السليم على مرحلة المجهر. باستخدام ضوء الظهارة، حدد الخلية (الخلايا) التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت أو التحقيق لتسجيلها. اضبط إضاءة عينة الفلورسنت لتصور الخلية (الخلايا) المحددة باستخدام الكاميرا الرقمية. تجنب استخدام الإضاءة العالية التي قد تسبب تبييض الصور والسمية الضوئية. ضبط التركيز والتكبير/ التصغير.
- الحصول على واحد Z-كومة سلسلة الفاصل الزمني في تردد 1 الإطار كل 2 s لفترات زمنية تتراوح بين 300 s و 500 s باستخدام التكبير ووظائف التركيز محددة.
ملاحظة: تختلف ديناميات الاتجار (السرعة، وتواتر الحركة، وما إلى ذلك) تبعاً لبروتين الفائدة، وبالتالي، فإن مسار الاكتساب الزمني قد يتطلب تعديلاً. على سبيل المثال، الميتوكوندريا هي أقل motile من lysosomes وتظهر توقفات متكررة. في هذه الحالة، يكون من الأنسب ضبط معلمات الاكتساب إلى إطار واحد كل 5 ثوان لـ 800 s. - حفظ الصور الفاصل الزمني وتصديرها كملفات مكدس AVI أو TIFF.
6. تحليل الصور
ملاحظة: تم إجراء تحليل الصورة باستخدام البرنامج المساعد KymoToolBox لImageJ / فيجي16. تعليمات مكتوبة مفصلة خطوة بخطوة متاحة على الانترنت17. وينبغي أن تكون الخطوات المختصرة التالية كافية لإنشاء kymographs واستخراج معلمات نقل الجسيمات.
- فتح تسلسل صورة الفاصل الزمني في برنامج ImageJ/Fiji. استيراد الصور من القائمة ملف كملفات مكدس AVI أو TIFF. تحويل الصور إلى 8 بت أو 16 بت عن طريق تحديد أحد أنواع الصور هذه باستخدام أداة الكتابة من القائمة صورة. في حالة العمل مع ملفات RGB، قم بتقسيم القنوات باستخدام أداة تقسيم القناة المتوفرة ضمن ميزة اللون في قائمة الصور.
- لتوليد kymograph (تمثيل في موقف ووقت مسارات الجسيمات)، رسم كل مسار الذي تتحرك الجسيمات عن طريق تتبع خط على طول مسارات الجسيمات باستخدام أداة خط مجزأة. لتعيين اتجاه الحركة بشكل صحيح، ارسم الخط المتعدد باستخدام نفس الاتفاقية الاتجاهية المطلوبة لجميع الأفلام بحيث تكون القطبية متناسقة داخل جميع الخلايا التي يتم دراستها وعبرها. على سبيل المثال، رسم خط متعدد من وسط الخلية نحو محيط أو العكس بالعكس. اضبط عرض الخط لمطابقة سمك المسار بالنقر المزدوج فوق أداة الخط.
- تشغيل الماكرو رسم كيمو من البرنامج المساعد KymoToolBox باستخدام عرض خط من 10. ستظهر مطالبة تطلب معايرة الصورة في الوقت المناسب (عدد الإطارات ومعدل الإطارات) والمساحة (x,y الدقة). بمجرد معايرة، يتم إنشاء kymographs ويمكن حفظها كملفات TIFF لعرض البيانات أو مزيد من تحليل الجسيمات.
- تعيين مسارات الجسيمات عن طريق تتبع يدويا كل الجسيمات في kymograph باستخدام أداة خط مجزأة لمدة كاملة من الاقتناء. سجل كل مسار للجسيمات كمنطقة اهتمام (ROI) باستخدام أداة مدير عائد الاستثمار الموجودة في القائمة تحليل/أدوات. حفظ جميع الـ ROIs لكل فيديو بفاصل زمني لمزيد من التحليل.
ملاحظة: من الأهمية بمكان تعيين المسار الصحيح للجسيمات الفردية على kymograph لتحقيق الحساب الأكثر دقة لمعلمات النقل.- تشغيل الماكرو تحليل كيمو من البرنامج المساعد KymoToolBox. ستفتح نافذة تطلب تعريف الاتجاه "الخارجي" لحركة الجسيمات (من اليسار إلى اليمين أو العكس بالعكس) من القائمة المنسدلة. يعتمد هذا الاختيار على موضع الشحنات الفلورية المصورة بالنسبة للنواة أو محيط الخلية، كما هو ثابت في الخطوة 6.2. فعلى سبيل المثال، إذا تم وضع النواة على يسار الشحنات، وتم سحب الخط المتعدد الخط في الخطوة 6-2 بعيداً عن النواة، فعرّف حركة الجسيمات الخارجية بأنها "من اليسار إلى اليمين".
- حدد الحد الأقصى للسرعة (الحد الأدنى للسرعة التي تعتبر بها البضائع موتيلي) في نافذة تحليل كيمو. بالنسبة للشحنات التي تتحرك بسرعة النقل داخل الخلايا، 0.1 ميكرومتر / ثانية هو الخيار المناسب. تعديل هذه القيمة لضبط حساسية البرنامج لكل شحنة من الفائدة. ضبط عرض الخط لمطابقة سمك كل مسار الجسيمات.
- حدد خيارات تسجيل كافة البيانات وإحداثيات Log استقراء في إطار تحليل kymo. وهذا سوف يحسب مختلف بارامترات نقل البضائع، بما في ذلك متوسط السرعة، والسرعة الداخلية، والسرعة إلى الخارج، والمسافة التراكمية التي تقطعها، والمسافة التي تقطع إما في الاتجاه الداخلي أو الخارجي، وعدد المفاتيح لكل جسيم، والنسبة المئوية للوقت تتحرك في كل اتجاه أو توقف، الخ. ثم يتم تجميع البيانات المحسوبة للمسارات الفردية لكل kymograph وحفظها في ملفات نصية خاصة بكل صورة.
ملاحظة: الخيار إظهار Kymo الملونة من تحليل ماكرو Kymo بإنشاء تراكب مرمزة ملونة من المسار عبر kymograph الأصلي. الجسيمات التي تسافر إلى الخارج ملونة باللون الأخضر، والداخل باللون الأحمر، والجسيمات الثابتة باللون الأزرق. ينشئ الخيار إحداثيات التقرير على المكدس الأصلي للماكرو "تحليل كيمو" تراكب مرمز بالألوان من موضع الكائن الاستقراء على الفيديو الأصلي الفاصل الزمني وkymograph.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بروتوكول لإنشاء الماوس الأولية MD astrocytes المبينة أعلاه ينبغي أن تسفر عن استنساخ، والثقافات ذات جودة عالية. على الرغم من أن الثقافات تحتوي في البداية على مزيج من الخلايا النجمية، والخلايا الليفية، وغيرها من الخلايا الغلية، بما في ذلك microglia وoligodendrocytes (الشكل1ثنائية، بيف؛ رؤوس الأسهم الحمراء)، فإن إضافة AraC إلى الثقافة المختلطة بين DIV5-DIV7 يقلل انتشار هذه الخلايا الملوثة. إن استراتيجية المعالجة المشتركة لـ AraC والاهتزاز تثري نقاء الثقافات النجمية (الشكل
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، ونحن نصف نهج تجريبي للتعبير عن، تصور، وتتبع الفلورسنت الموسومة العضيات والبروتينات غشاء ذات أهمية باستخدام مجهريالفيديو الفاصل الزمني في عالية النقاء الأولية الماوس القشرية MD astrocytes. كما نحدد منهجية لقياس ديناميات الجسيمات. التصور المباشر للبروتين وديناميات الجهاز ية في الخلايا النجمية الأولية يوفر أداة قوية لدراسة تنظيم النقل داخل الخلايا في هذه الخلايا في المختبر.
منهجية إنشاء الماوس MD الثقافات النجمية المذكورة أعلاه يجمع بين خطوات من البروتوكولات الأخرى المنشورة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
[دينل] كان ساندت بالجامعة [نورث كرولينا] في كنيسة صغيرة تل ([أونك]) مدرسة الطبّ كسيمونز طالبة. وحظيت هذه الاستجابة بدعم من المنحة المقدمة من لجنة الأمم المتحدة للاستجابة إلى البيئة R25 GM089569. تم دعم العمل باستخدام المرفق الأساسي للميكروسكوب مركز علم الأعصاب التابع لقيادة الأمم المتحدة، جزئياً، بتمويل من منحة دعم مركز العلوم العصبية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية - NINDS P30 NS045892، ومنحة دعم مركز أبحاث الإعاقة الفكرية والتنموية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية التابع للمعهد الوطني للصحة الوطنية HD079124.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 2.5٪ تربسين (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| جهاز طرد مركزي منضدة | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 |
| لثقافة الخلايا الصف استنساخ المياه | 25-511 | ||
| مجهر ثقافة الخلية | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 نطاق مقلوب ، مجهر ثقافة الأنسجة المقلوب مع قدرات |
| الفلورسنتالسيتوزين أرابينوزيد | سيجما | C1768-100MG | (AraC) قم بإذابة المسحوق المجفف بالتجميد في ماء معقم لزراعة الخلايا لعمل مخزون 10 ملي مولار ، وتخزينه وتجميده للتخزين طويل الأمد |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | قم بإذابة المسحوق المجفف بالتجميد في الماء منزوع الأيونات بتركيز أقصى يبلغ 20 مجم / مل ، أو الحرارة أو الصوتنة حسب الضرورة. استخدم عند 300 نانومتر لمواجهة التلوين. |
| تشريح المجهر | Zeiss | Stemi 305 | |
| مقص تشريح | FST | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| مصل الأبقار الجنيني | الجوزاء | 100-106 | المعطلة بالحرارة |
| (فيجي هي مجرد صورة J) | NIH | الإصدار 1.52i | |
| ملاقط ذات طرف ناعم | FST | 11254-20 | نمط # 5 |
| مصدر ضوء مضان | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP إشارة خلية الأجسام المضادة | 3670S | GFAP (GA5) الماوس أحادي النسيلة | |
| أطباق زجاجية القاع | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | طبق 35 مم | رقم 1.5 غطاء | قطر الزجاج 14 مم | ملقط Graefe غير المطلي |
| FST | 11054-10 | ملقط Graefe Iris بأطراف منحنية | |
| صبغة فلورية خضراء تلطخ المقصورات الحمضية (الجسيمات الداخلية المتأخرة والليزوسومات) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. مذابة مسبقا في DMSOS إلى محلول مخزون 1 ملم. خفف إلى تركيز العمل النهائي في وسط النمو أو المخزن المؤقت المفضل |
| محلول الملح المتوازن من هانك (10x) | Gibco | 14065-056 | تقنيات التصوير الخالية من المغنيسيوم والكالسيوم |
| وسائل الإعلام A14291DJ | حل تصوير الخلايا الحية المجهر | ||
| متحد البؤر المقلوب | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| كاشف محسن الدهون | Life Technologies | 11514015 | Plus كاشف |
| كاشف الدهون | Life Technologies | 15338100 | كاشف Lipofectamine LTX |
| حاضنة اهتزاز مدارية | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 ، حاضنة اهتزاز مداري مع التحكم في درجة الحرارة والسرعة |
| محلول البنسلين / الستريبوميسين (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | يذوب في مخزن ثلاثي المؤقت ، درجة الحموضة 8.5 ، عند 1 مجم / مل. تجميد للتخزين طويل الأجل. تجنب دورات التجميد والذوبان |
| متوسط مصل منخفض | Gibco | 31985-062 | قوارير زراعة الأنسجة OPTI-MEM |
| أوليمبوس بلاستيك | 25-209 | 75 سم ^ 2. وصول الرقبة بزاوية 100٪ ، غطاء مرشح موفر للماء 0.22 ميكرومتر | |
| حاضنة زراعة الأنسجة | 51030285 | HERAcell VIOS 160i ، حاضنة لزراعة الأنسجة مع التحكم | |
| في درجة الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربونTris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 جم مذاب إلى لتر واحد في الماء مع 4.829 جم Tris HCl لعمل 0.1 M Tris Buffer ، درجة الحموضة 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 جم مذاب إلى لتر واحد في الماء مع 8.402 جم Tris Base لعمل 0.1 M Tris Buffer ، درجة الحموضة 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25٪) ، الفينول الأحمر | Gibco | 25200072 | |
| أنظمة الترشيح التي تعمل بالفراغ | Olympus Plastics | 25-227 | 500 مل ، غشاء PES ، 0.22 وميكرو ؛ م |
| مقص فاناس مستقيم | Roboz | RS-5620 |
المراجع
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370(2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217(2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079(2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- Cordelières, F. P. IJ KymoToolBox. , Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
