مقالة منهجية

تحديد سمات تعبير الجينات الخاص بنوع الخلية في كبد الماوس

DOI:

10.3791/60242

⸱

سبتمبر 17, 2019

 ,  , 
1Department of Genetics, University of Pennsylvania, 2Department of Medicine, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ترجمة تنقية التقارب الريبوسوم (TRAP) تمكن العزل السريع والفعال للخلية نوع محدد ترجمة mRNA. هنا، نقوم بشرح طريقة تجمع بين حقن الوريد الخلفي الهيدروديناميكي في نموذج الماوس لإعادة السكان الكبد وTRAP لدراسة ملف تعريف التعبير عن إعادة ملء خلايا الكبد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعادة سكان الكبد بعد الإصابة هي سمة حاسمة من سمات الثدييات التي تمنع الفشل الفوري للأعضاء والوفاة بعد التعرض للسموم البيئية. ويمكن أن يساعد الفهم الأعمق للتغيرات في التعبير الجيني التي تحدث أثناء إعادة التجمعات السكانية في تحديد الأهداف العلاجية لتعزيز استعادة وظيفة الكبد في تحديد الإصابات. ومع ذلك، فإن أساليب عزل خلايا الكبد المعاد إسكانها على وجه التحديد تمنعها عدم وجود علامات الخلايا، وأرقام الخلايا المحدودة، وهشاشة هذه الخلايا. تطوير ترجمة تكنولوجيا تنقية التقارب الريبوسوسوم (TRAP) جنبا إلى جنب مع نموذج فاه-/- الماوس لتلخيص إعادة السكان في وضع إصابة الكبد يسمح بتوصيف التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد. مع TRAP، يتم عزل mRNA ترجمة نوع الخلية بسرعة وكفاءة. قمنا بتطوير طريقة تستخدم TRAP مع العزلة القائمة على التقارب من ترجمة mRNA من خلايا الكبد التي تعبر بشكل انتقائي عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) الموسومة بروتين ريبوسومال (RP)، GFP:RPL10A. TRAP يتحايل على الفترة الزمنية الطويلة المطلوبة لفرز الخلايا المنشطة الفلورية التي يمكن أن تغير ملف تعريف التعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، منذ فقط إعادة ملء خلايا الكبد التعبير عن GFP: RPL10A بروتين الانصهار، وmRNA معزولة خالية من التلوث من خلايا الكبد المصابة المحيطة بها وأنواع الخلايا الأخرى في الكبد. وmRNA تنقية التقارب هي ذات جودة عالية ويسمح المصب PCR- أو عالية الإنتاجية تحليل التسلسل القائم على التعبير الجيني.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كما الجهاز الأيضي الرئيسي في الفقاريات، والكبد هو المسؤول عن التوازن الجلوكوز، تخليق بروتين المصل، إفراز حمض الصفراء، والتمثيل الغذائي xenobiotic وإزالة السموم. الكبد يملك قدرة غير عادية لتجديد parenchyma المصابة عند التعرض للسموم لمنع فشل الكبد الفوري1. ومع ذلك، يمكن أن يحدث فشل التجديد في إعداد الأسيتامينوفين أو الكحول الإفراط في الاستهلاك، والتي يمكن أن تؤدي إلى فشل الكبد الحاد2. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تسبب إصابة الكبد المزمنة الناجمة عن عدوى التهاب الكبد الفيروسي، وأمراض الكبد الدهنية، والتهاب الكبد الدهني تليف الكبد، وتليف الكبد، وسرطان الكبد الخلوي3. العلاج العلاجي الوحيد المتاح لمرض الكبد في المرحلة النهائية هو زرع ولكن محدودة بسبب نقص الأعضاء، ومنع العلاج الفعال لجميع المرضى4. وبالتالي فإن التوصل إلى فهم أفضل لعملية التعافي بعد إصابة الكبد السامة أمر بالغ الأهمية لتطوير العلاجات لتحفيز التجدد الكافي لإنقاذ وظيفة في الجهاز المريض.

نظام النموذج الأكثر تطبيقا على نطاق واسع لدراسة تجديد الكبد هو استئصال الكبد الجزئي في القوارض ، حيث يتم استئصال نسبة كبيرة من الكبد لتحفيز التوسع السريع في خلايا الكبد5. ومع ذلك، استئصال الكبد الجزئي لا يلخص توسع خلايا الكبد بعد إصابة الكبد السامة بسبب عدم وجود تسلل الخلايا المناعية ونخر الخلايا الكبدية غالبا ما لوحظ في وضع إصابة الكبد الحادفي البشر6. وهناك نظام أكثر ملاءمة لنمذجة هذا الشكل من تجديد الأعضاء هو فاه-/- الماوس، الذي يفتقر إلى fumarylacetoacetate الهيدرولاز الوظيفية (FAH) المطلوبة لعملية التمثيل الغذائي التيروزين السليم ويتطور تلف الكبد الشديد مما يؤدي إلى الموت7. ويمكن الحفاظ على هذه الفئران في حالة صحية إلى أجل غير مسمى عن طريق العلاج مع نيتيزينون المخدرات في مياه الشرب. بدلا من ذلك، يمكن استعادة التعبير FAH عن طريق تسليم transgene إلى مجموعة فرعية من خلايا الكبد، والتي سوف تتوسع لإعادة ملء الكبد عند إزالة نيتيسينون8.

لتوصيف التغيرات في التعبير الجيني لإعادة ملء خلايا الكبد، هناك حاجة إلى أداة لعزل خلايا الكبد المتماثلة على وجه التحديد في فاه-/- الماوس دون تلوث من خلايا الكبد المصابة المجاورة وأنواع الخلايا الأخرى. لسوء الحظ، فرز الخلايا بمساعدة الفلورة (FACS) من خلايا الكبد من الصعب منذ (1) هشاشة إعادة ملء خلايا الكبد يؤدي إلى الانتعاش الفقراء بعد التسريب الكبد، (2) تكرار خلايا الكبد هي متغيرة للغاية في الحجم، مما يجعل العزلة من السكان نقية من قبل FACS صعبة، و (3) وقت الإجراء من التسريب الكبد لعزل الحمض النووي الريبي هو أكبر من 2 ح، وبالتالي ملامح التعبير الجيني قد تخضع لتغييرات اصطناعية كبيرة قبل الحصول على عينات9.

بدلا من ذلك، فإن التعبير عن ريبوسوسومات ذات علامات النعوت على وجه التحديد في إعادة ملء خلايا الكبد يسمح للعزل السريع من ترجمة بنشاط mRNA ملزمة الريبوسوسوم باستخدام تنقية التقارب مباشرة بعد حصاد الأعضاء، مع الكبد السائبة الأنسجة lysates. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتنفيذ ترجمة الريبوسوم تنقية التقارب (TRAP)10 تليها عالية الإنتاجية RNA-التسلسل (TRAP-seq)، لعزل على وجه التحديد والملف الشخصي mRNA في إعادة ملء خلايا الكبد في Fah-/- الماوس9. التعبير المشترك للبروتين الفلورسنت الأخضر الموسومة ريبوسومال (GFP: RPL10A) مع FAH يسمح تنقية تقارب ترجمة mRNA ملزمة polysomes التي تحتوي على GFP: RPL10A. يتفادى هذا الأسلوب أي خطوات تفكك الخلايا، مثل التسريب الكبد لعزل الخلايا الكبدية الهشة. بدلا من ذلك، فإنه يستخدم lysis من أنسجة الأعضاء كلها والأجسام المضادة لاستخراج بسرعة الحمض النووي الريبي على وجه التحديد من الخلايا المستهدفة. وأخيراً، فإن عزل الميرنا الوفيرة وعالية الجودة عن طريق TRAP-seq يمكّن التطبيقات النهائية مثل تحليل التسلسل من تحديد التغير الديناميكي في التعبير الجيني أثناء عملية إعادة السكان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الطرق التي تنطوي على استخدام الفئران تتفق مع المبادئ التوجيهية التي قدمتها IACUC من مكتب بن لرعاية الحيوان في جامعة بنسلفانيا.

1. إعداد الكاشف

  1. سيكلوهيكسميد
    1. لجعل 500 درجة مئوية من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد، تعليق 50 ملغ من سيكلوهيكسميد في 500 ميكرولتر من الميثانول.
      تحذير: سيكلوهيكسميد سام للغاية للبيئة ويمكن أن يسبب تشوهات خلقية. وينبغي جمع جميع النفايات والمخازن المؤقتة المحتوية على السيكلوهيكساميد من أجل التخلص منها على النحو السليم.
      ملاحظة: يمكن تخزين سيكلوهيكسميد عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يوم واحد. سيكلوهيكسميد يمنع الترجمة.
  2. ديثيوثريتول (DTT)
    1. لجعل 1 مل من 1 M DTT، تعليق 0.15 غرام من مسحوق DTT في المياه الخالية من RNase.
      تحذير: يمكن أن يسبب DTT تهيجًا في الجلد والعين والجهاز التنفسي.
      ملاحظة: DTT هو المنظفات. يمكن تخزين DTT عند -20 درجة مئوية. فمن المستحسن لتخزين 1 M DTT في aliquots استخدام واحد من 50 درجة مئوية.
  3. ديوكسيشولات (DOC)
    1. لجعل 10٪ DOC، تعليق 1 غرام من DOC في أنبوب مخروطي 50 مل وإضافة المياه الخالية من RNase تصل إلى 10 مل. يهز بقوة حتى يذوب المسحوق.
      ملاحظة: حل DOC 10٪ أصفر قليلا ويمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة تصل إلى 1 سنة. يستخدم DOC للإنتليس النووي.
  4. الأجسام المضادة GFP
    1. Aliquot GFP الأجسام المضادة عند استخدام لأول مرة. التقط تجميد aliquots وتخزينها في -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: من المستحسن تخزين 50 ميكروغرام من الأجسام المضادة GFP في aliquots استخدام واحد.
  5. ب بروتين ببيوتينلاتي ل
    1. إعادة تعليق البروتين biotinylated L في 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) لجعل التركيز النهائي 1 ميكروغرام / ميكرولتر.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحل المعلق عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.

2. إعداد العازلة

  1. الزلال المصل البقري (BSA) العازلة
    1. لجعل 50 مل من 3٪ BSA العازلة، إضافة 1.5 غرام من IgG- والبروات خالية من مسحوق BSA في 40 مل من PBS تليها دوامة. بعد حل BSA، إضافة PBS إلى حجم نهائي من 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزن المؤقت BSA عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
  2. المخزن المؤقت للتشريح
    1. لجعل 50 مل من المخزون المخزن الاحتياطي، والجمع بين 5 مل من 10X هانك محلول الملح المتوازن (HBSS)، 125 ميكرولتر من 1 م 4-(2-هيدروكسي إيثيل) -1-piperazineethanesulfonic حمض (HEPES)، 1750 ميكرولتر من 1 M الجلوكوز، و 200 ميكرولتر من 1 M NaHCO3. إضافة المياه الخالية من RNase إلى حجم نهائي قدره 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون المخزن المؤقت للتشريح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. قبل الاستخدام مباشرة، أضف 100 ميكروغرام/مل من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد يُحفظ على الجليد.
  3. العازلة عالية الملح
    1. لجعل 50 مل من المخزون الاحتياطي عالية الملح، إضافة 1 مل من 1 م HEPES، 8.75 مل من 2 مل كيلو كل، 500 ميكرولتر من 1 م كل2،و 500 ميكرولتر من 100٪ nonylphenyl البولي ايثيلين غليكول(جدول المواد)إلى المياه الخالية من RNase.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون الاحتياطي عالي الملح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. قبل الاستخدام مباشرة، يضاف 0.5 ميكرولتر/مل من 1 M DTT و1 ميكرولتر/مل من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد. الحفاظ على العازلة الطازجة عالية الملح على الجليد.
  4. العازلة منخفضة الملح
    1. لجعل 50 مل من المخزون الاحتياطي منخفض الملح، إضافة 1 مل من 1 م HEPES، 3.75 مل من 2 مل كيلو كل، 500 ميكرولتر من 1 م كل2،و 500 ميكرولتر من 100٪ البولي إثيلين البولي الإيثيلين 100٪ إلى 44.25 مل من المياه الخالية من RNase.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون الاحتياطي منخفض الملح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. إضافة 0.5 ميكرولتر/مل من DTT 1 M و1 μL/mL من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد قبل الاستخدام. الحفاظ على العازلة الطازجة منخفضة الملح على الجليد.
  5. العازلة اللليس الأنسجة
    1. لجعل 50 مل من مخزون الأنسجة الاحتياطية، والجمع بين 1 مل من 1 م HEPES، 3.75 مل من 2 مل كيلو كل، و 500 درجة مئوية من 1 م كل2. إضافة المياه الخالية من RNase إلى النهائي من 50 مل.
      ملاحظة: يمكن تخزين المخزون المخزن المؤقت للتشريح عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
    2. إضافة 1 قرص / 10 مل من مثبطات البروتياز خالية من EDTA، 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد، 10 ميكرولتر / مل من مثبطات RNase كل مباشرة قبل الاستخدام. الحفاظ على الأنسجة الطازجة العازلة على الجليد.

3. اقتران الأجسام المضادة للحبات المغناطيسية

  1. الاجسام المضاده
    1. حساب كمية الأجسام المضادة GFP المطلوبة لجميع العينات والاستعداد لعينة إضافية واحدة.
      ملاحظة: لكل عينة، مطلوب 50 ميكروغرام من كل جسم مضاد GFP.
    2. ذوبان الأجسام المضادة GFP على الجليد وتدور في أقصى سرعة (> 13،000 × ز)لمدة 10 دقائق في 4 درجة مئوية ونقل supernatants إلى أنبوب جديد microcentrifuge.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ خطوة إعداد الأجسام المضادة قبل إعداد حبة ويمكن الاحتفاظ الأجسام المضادة المذابة على الجليد. بدلا من ذلك، يمكن تنفيذ هذا الجزء أثناء حضانة حبة المغناطيسي والبروتين biotinylated L.
  2. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي
    1. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي(جدول المواد)عن طريق الأنابيب لطيف.
    2. لكل عينة، واستخدام 150 درجة مئوية من حبة المغناطيسي. حساب حجم حبة المغناطيسي المطلوبة لجميع العينات وإعداد واحد إضافي. نقل الخرز المغناطيسي المعلق إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل أو 2 مل. إذا كان أكثر من 1 مل مطلوب لتجربة، قم بتقسيم المبلغ الإجمالي إلى أحجام متساوية.
    3. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. إزالة أنبوب microcentrifuge من موقف المغناطيسي وإضافة 1 مل من PBS تليها الأنابيب صعودا وهبوطا لغسل الخرز. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة PBS.
  3. إعداد حبات البروتين المغلفة L
    1. لكل عينة، استخدم 60 ميكرولتر من البروتين الحي النيدي L. إذا تم إعادة تعليق البروتين L سابقا وتخزينها في -20 درجة مئوية، ذوبان البروتين L على الجليد. إذا تم إعادة تعليق البروتين L قبل الاستخدام، خذ الكمية المطلوبة لجميع العينات وإعداد واحد إضافي.
    2. إضافة الحجم المحسوب من البروتين biotinylated L إلى الخرز المغناطيسي المعاد تعليقها وغسلها. إضافة 1X PBS لجعل المجلد النهائي 1 مل إذا كان استخدام أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل، أو 1.5 مل إذا كان استخدام أنبوب الطرد المركزي الصغير 2 مل. حضانة الخرز المغناطيسي مع البروتين biotinylated L لمدة 35 دقيقة في RT على مدور أنبوب.
      ملاحظة: يمكن إعداد الأجسام المضادة في هذه الخطوة في حين أن الخرز وحضانة مع البروتين biotinylated L.
    3. جمع الخرز البروتين L المغلفة على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. إزالة أنبوب الطاردة الدقيقة من الحامل المغناطيسي وإضافة 1 مل من 3٪ BSA العازلة تليها الأنابيب لطيف لمدة 5 مرات على الأقل لغسل الخرز البروتين L المغلفة.
    4. جمع الخرز المغلفة على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. كرر خطوات الغسيل مع BSA 3٪ لمدة 4 مرات أخرى (ما مجموعه 5 مرات).
  4. ربط الأجسام المضادة
    1. إضافة الكمية المحسوبة من الأجسام المضادة GFP في حبات البروتين L المغلفة وحضانة لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية على مدور أنبوب.
      ملاحظة: بعد حضانة الأجسام المضادة، والحرص الخاص على عدم دوامة مصفوفة التقارب.
    2. أثناء الحضانة، قم بإعداد المخزن المؤقت منخفض الملح عن طريق حساب الحجم الإجمالي المطلوب لجميع العينات وإضافة 0.5 ميكرولتر/مل من 1 MTT و1 ميكرولتر/مل من 0.1 غرام/مل سيكلوهيكسميد إلى المخزون الاحتياطي منخفض الملح قبل الاستخدام.
      ملاحظة: مطلوب 3 مل من العازلة منخفضة الملح لغسل كل أنبوب من الخرز GFP المترافق و 200 درجة مئوية / عينة لإعادة تعليق الخرز GFP المترافق. يمكن الاحتفاظ بحاجز الملح المنخفض الطازج على الجليد لبضع ساعات.
    3. جمع مصفوفة التقارب على موقف المغناطيسي ل >1 دقيقة وإزالة supernatant. أضف 1 مل من المخزن المؤقت قليل الملح وسعر الماصة برفق صعودا وهبوطا لغسل مصفوفة التقارب. جمع مصفوفة التقارب على موقف المغناطيسي ل >1 دقيقة وإزالة العازلة منخفضة الملح. كرر خطوات الغسيل مع العازلة منخفضة الملح لمدة 2 مرة أخرى (ما مجموعه 3 مرات).
    4. إعادة تعليق الخرز في العازلة منخفضة الملح بحيث يكون كل عينة 200 ميكرولتر من مصفوفة التقارب.
      ملاحظة: يمكن تخزين مصفوفة التقارب في 0.02٪ NaN3 عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. وينبغي غسل مصفوفة التقارب بسرعة في المخزن المؤقت منخفض الملح 3 مرات وإعادة تعليقها بلطف على مدور أنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على الأقل إذا تم إعداد مصفوفة التقارب في غضون أسبوع واحد أو بين عشية وضحاها إذا تم تخزين مصفوفة التقارب لأكثر من 1 أسبوع. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
      تحذير: أزيد الصوديوم هو سام للغاية للبيئة. الاتصال مع الأحماض تنتج الغاز السام. وينبغي جمع جميع النفايات من أجل التخلص منها على النحو السليم.

4. أنسجة الكبد اللمعة

  1. إعداد المخزن المؤقت وإعداد المعدات
    1. حساب عدد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المطلوبة، والتسمية والبرد على الجليد.
      ملاحظة: وعادة ما تكون هناك حاجة إلى سبعة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل لكل عينة: 1 للكبد تشريح المتبقية، 4 ل 4 مل من lysate الكبد المتجانسة، و 2 لنقل supernatants.
    2. إعداد المخزن المؤقت تشريح جديدة عن طريق حساب الحجم الإجمالي المطلوب لجميع العينات وإضافة 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد. ضع المخزن الاحتياطي تشريح جديدة على الجليد للحفاظ على البرد طوال التجربة.
      ملاحظة: لكل عينة، مطلوب 10 مل من المخزن المؤقت تشريح.
    3. إعداد العازلة lysis جديدة عن طريق حساب الحجم الإجمالي المطلوب لجميع العينات وإضافة 1 قرص / 10 مل من مثبطات البروتياز EDTA خالية، 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد، و 10 ميكرولتر / مل من مثبطات RNase لكل منهما. الحفاظ على العازلة lysis على الجليد طوال التجربة.
      ملاحظة: لكل عينة، 4 مل من المخزن المؤقت lysis مطلوب.
    4. إعداد طاحونة الأنسجة(جدول المواد)بحيث يمكن وضع أنابيب الزجاج متعدد تترافلوروإيثيلين (PTFE) على الجليد أثناء تجانس قطع الكبد. وضع 4 مل من العازلة lysis الباردة في أنابيب PTFE الزجاج.
  2. إعادة ملء الكبد التجانس
    1. قتلفأر يبلغ من العمر 8-12 أسبوعًايتم حقنه بناقل TRAP وأعيد إسكانه لمدة أسبوع أو أربعة أسابيع بالتخدير وخلع عنق الرحم وفقًا للمبادئ التوجيهية التجريبية الحيوانية المعتمدة.
    2. وضع الماوس على لوحة تشريح ورذاذ البطن مع الإيثانول 70٪. خيمة الجلد وperitoneum منخفضة في البطن باستخدام ملقط واستخدام مقص لجعل شق عرضية. الاستمرار في قطع مع مقص لجعل واسعة على شكل U رفرف الهيوم، مع الحرص على عدم قطع الحشوة. قلب رفرف العضد على القص لفضح الكبد.
    3. إزالة الكبد بعناية باستخدام مقص غرامة وملقط ووضع الأنسجة بسرعة في المخزن البارد العازلة لشطف. لتجانس الأنسجة المجمدة، بسرعة نقل الكمية المطلوبة من أنسجة الكبد في أنابيب زجاجية PTFE مع العازلة lysis الباردة دون ذوبان الأنسجة.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الأنسجة تشريح فلاش المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية بعد غسلها مع المخزن المؤقت. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
    4. وزن الكبد على طبق بيتري وعزل 200-500 ملغ من قطع الكبد والانتقال إلى أنابيب زجاج PTFE. ضع أنسجة الكبد المتبقية في أنبوب مجهري مُبرّد مسبقًا وتجمد فلاش.
    5. تجانس العينات في المجانسة التي يحركها المحرك بدءا من 300 دورة في الدقيقة لفصل خلايا الكبد من بنية الكبد لمدة 5 السكتات الدماغية على الأقل. خفض أنبوب الزجاج في كل مرة ولكن الحرص على عدم السماح للآفات ترتفع فوق الحل لمنع التأليه التي يمكن أن تسبب إزالة النُثّة البروتين.
    6. رفع السرعة إلى 900 دورة في الدقيقة لتجانس أنسجة الكبد تماما لمدة 12 السكتات الدماغية الكاملة على الأقل.
    7. نقل lysate في أنابيب وصفت وقبل المبردة، مع ما لا يزيد عن 1 مل من lysate لكل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل. إذا تم استخدام 4 مل من العازلة lysis، والحفاظ على 1 أنبوب وفلاش تجميد الأنابيب المتبقية 3.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالليسات على الجليد لمدة تصل إلى 1 ساعة أثناء تشريح الحيوان التالي وإعداد lysates الطازجة. يمكن أن يكون فلاش الكبد المتجانس ة مجمدة بعد خطوة الانتهاليس وتخزينها عند -80 درجة مئوية. يمكن أن يكون هناك انخفاض بنسبة 50٪ في الحمض النووي الريبي المعزول إذا تم استخدام lysates المجمدة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
  3. اللّيلة النووية
    1. طرد مركزي في الكبد lysate في 2000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونقل supernatant إلى أنبوب جديد، prechilled microcentrifuge على الجليد.
    2. إضافة 1/9 من حجم supernatant من 10٪ nonylphenyl البولي ايثيلين غليكول لجعل التركيز النهائي 1٪ nonylphenyl البولي ايثيلين غليكول ومزيج عن طريق عكس بلطف أنابيب الطرد المركزي الصغير.
    3. تدور بسرعة أسفل أنابيب الطرد المركزي الصغير وإضافة 1/9 من حجم العينة من 10٪ DOC لجعل التركيز النهائي 1٪ DOC ومزيج عن طريق عكس بلطف أنابيب الطرد المركزي الصغير. تدور بسرعة أسفل أنابيب الطرد المركزي الصغير وحضانة على الجليد لمدة 5 دقائق.
    4. طرد مركزي الليسات النووية في 20،000 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونقل supernatant إلى أنبوب جديد، prechilled microcentrifuge على الجليد.
      ملاحظة: ويمكن وضع الميتوكوندريا المنضبة على الجليد لبضع ساعات في حين يتم جمع العينات المتبقية.

5. الترسيب المناعي

  1. لكل أنبوب، تأخذ 1٪ من الحجم الإجمالي للsupernatant كمراقبة ما قبل المناعةه لمقارنة التخصيب المستهدف بعد الحضانة مع مصفوفة التقارب. وضع ضوابط الترسيب قبل المناعة على مدور أنبوب في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها، بنفس الطريقة التي تتم بها معالجة العينات المناعية.
  2. إضافة 200 ميكرو لتر من مصفوفة التقارب إلى كل عينة. خذ عناية إضافية لإعادة تعليق الخرز عن طريق الأنابيب لطيف قبل إضافة مصفوفة تقارب لكل عينة. احتضان lysates مع مصفوفة تقارب في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع خلط لطيف على مدور أنبوب.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً لمدة تصل إلى يوم واحد بعد هذه الخطوة.

6. عزل الحمض النووي الريبي

  1. إعداد المخزن المؤقت وإعداد المعدات
    1. ضع الحامل المغناطيسي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للتبريد والحفاظ على الرف على الجليد طوال التجربة.
    2. حساب عدد أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المطلوبة وقبل البرد على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: عادة، كل عينة يتطلب 1 أنبوب الطرد المركزي الدقيق لRNA تنقية النهائي.
    3. تدور بسرعة أسفل الأنابيب من الخطوة 5.2 وجمع الخرز عن طريق وضع على الرف المغناطيسي لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن أن يكون supernatant التي تم جمعها التي تحتوي على كسر غير منضم فلاش المجمدة وتخزينها في -80 درجة مئوية للمقارنة مع كسر ملزمة لإثراء النص بعد تنقية. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.
    4. إعداد العازلة عالية الملح عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر / مل من 1 M DTT و 1 ميكرولتر / مل من 0.1 غرام / مل سيكلوهيكسميد إلى المخزون الاحتياطي عالية الملح.
      ملاحظة: لكل عينة، مطلوب 5 مل من العازلة عالية الملح.
  2. عزل الجيش الملكي النيبالي
    1. أضف 1 مل من العازل الطازج عالي الملح إلى كل أنبوب متبوعاً بأنابيب لطيفة لمدة 5 مرات على الأقل دون إدخال فقاعات.
      ملاحظة: عدم كفاية الغسيل يمكن أن يقدم خلفيات من النصوص غير المنضمة في حين أن إدخال فقاعات يمكن أن يسرع تدهور الحمض النووي الريبي.
    2. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وإزالة supernatant. كرر خطوات الغسيل مع العازلة عالية الملح لمدة 4 مرات أخرى (ما مجموعه 5 مرات).
    3. إزالة العازلة المتبقية عالية الملح وإزالة أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من موقف المغناطيسي ومكان في RT لمدة 5 دقائق للاحماء.
    4. إعادة تعليق الخرز في 100 درجة مئوية من العازلة lysis (المقدمة في عدة العزلRNA) مع β-mercaptoethanol.
      ملاحظة: يمكن استخدام أي مجموعة عزل وتنقية الحمض النووي الريبي التي تحتوي على ثيوسيانات غوانيدين denaturant كمخزن مؤقت للتحلل لإطلاق RNA ملزمة من مصفوفة التقارب. وينبغي معالجة استخراج الحمض النووي الريبي في RT منذ guanidine ثيوسيانات يمكن أن تتبلور في درجات حرارة منخفضة.
    5. دوامة الخرز والعازلة لمدة 5 s على الأقل في أعلى سرعة، تدور بسرعة إلى أسفل لجمع العازلة على جانب أنبوب الطرد المركزي الصغير واحتضان الخرز مع العازلة في RT لمدة 10 دقيقة لإطلاق سراح RNA حبة ملزمة في العازلة lysis.
    6. جمع الخرز على موقف المغناطيسي ل > 1 دقيقة وجمع supernatant للمضي قدما على الفور لتنظيف الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول تنقية RNA كما هو محدد في مجموعة(جدول المواد).
      ملاحظة: كما يمكن تخزين الـ supernatant الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي في مخزن الليسافي عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد قبل التنظيف عن طريق الإحتراث إلى RT عند الذوبان.
    7. لتحقيق أقصى جودة من الحمض النووي الريبي المعزول، قم بتنفيذ جميع الخطوات الاختيارية بما في ذلك الهضم DNase وجميع خطوات elution RNA. قم بتسخين حاجز الإلتواء الذي توفره مجموعة عزل RNA أو المياه الخالية من RNase إلى 60 درجة مئوية لتحقيق أقصى قدر من استرداد الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي المعزول عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد أو -80 درجة مئوية لعدة سنوات. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً بعد هذه الخطوة.

7. اختياري تحليل جودة الحمض النووي الريبي (مستحسن)

  1. تقييم نوعية الحمض النووي الريبي باستخدام محلل حيوي11 وكمية مع مقياس الطيف12 لتحديد ما إذا كان تكرار عملية هطول الأمطار المناعية مطلوب للحصول على الحمض النووي الريبي وافرة وعالية الجودة.
    ملاحظة: يجب أن تتبع جودة RNA المثلى لتسلسل الإنتاجية العالية البروتوكولات المحددة بواسطة مجموعات إعداد المكتبة ومنصات التسلسل.

8. تطبيقات المصب

ملاحظة: يمكن استخدام إجمالي RNA المعزول بواسطة بروتوكول TRAP في عدد من التطبيقات القياسية في المصب، بما في ذلك RNA-seq (TRAP-seq). كما يمكن استخدام النسخ العكسي القياسي وبروتوكولات PCR الكمية بعد الملائمة.

  1. لTRAP-seq، قم بإجراء إعداد مكتبة RNA-seq وفقًا للأساليب القياسية13.
  2. بالنسبة لـ RNA-seq، قم بإعداد مكتبات تسلسل cDNA باستخدام مجموعات RNA-seq التجارية مع التخصيب القائم على القلة d(T) لنصوص بولي (A) متعددة السنوات. بدلاً من ذلك، إذا كانت جودة الحمض النووي الريبي الإجمالي أقل من الموصى بها لإثراء بولي(A)، استخدم وحدات استنفاد rRNA. ومع ذلك، نتوقع أن نرى المزيد من محاذاة rRNA بعد التسلسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوصيف التعبير الجيني في إعادة ملء خلايا الكبد من Fah-/- الماوس، Gfp:Rpl10a الانصهار وFah transgenes يتم تسليمها بشكل مشترك داخل transposon التي تحتوي على بلازميد8 (ناقلات TRAP) إلى الكبد من قبل حقن الهيدروديناميك(الشكل 1ألف). إزالة النيتيزينون يسبب إصابة الكبد السامة التي تخلق ضغط اختيار لخلايا الكبد يعبّر بشكل ملحوظ FAH لإعادة ملء parenchyma المصاب9. تلطيخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TRAP-seq هو تقنية لعزل نوع الخلية محددة من ترجمة mRNA عن طريق ريبوسوسومات ذات علامات النعت، ويقدم بديلا لنهج FACS، كما أنه يتحايل على القيود مثل متطلبات الوقت من FACS9. بدلا ً من ذلك، يسمح TRAP بعزل الحمض النووي الريبي بسرعة وكفاءة مباشرة من الأنسجة السائبة، مما يساعد على تجنب أي تغييرات في التعبير الجيني. TRAP-seq هو مناسب بشكل خاص للاستخدام في إعادة ملء كبد فاه-/- الماوس، كما توسيع خلايا الكبد بعد إزالة النيتسيون هو الخلية المستقلة وتمكن من تحديد ملامح التعبير الجيني للمجموع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية: F31-DK113666 (AWW)، K01-DK102868 (AMZ)، K08-DK106478 (KJW)، و P30-DK050306 (منحة تجريبية إلى KJW).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مطحنة مناديل سعة 10 مل ، Potter-Elv ، علومالحياة DWK المطلية (Wheaton)358007
مجموعة Absolutely RNA MiniprepKit Agilent400800
الأجسام المضادة المضادة ل GFPالأجسام المضادة Memorial Sloan-Kettering & Bioresource CoreGFP Ab #19C8 و GFP Ab #19F7
ألبومين مصل الأبقار ، خالي من IgG ، خالي من البروتيازJackson ImmunoResearch001-000-162
cOmplete ، Mini ، خال من EDTA مثبط البروتياز كوكتيلRoche11836170001
CycloheximideMillipore SigmaC7698
حمض Deoxycholic ، DOCMillipore SigmaD2510
D-Glucose ، سكر العنبفيشر ScientificD16
DL-DithiothreitolMillipore SigmaD9779
Dynabeads MyOne Streptavidin T1Thermo Fisher Scientific65602
أطباق فيشر بتري بغطاء شفاففيشر ScientificFB0875712
HBSS (10x) ، كالسيوم ، مغنيسيوم ، بدون فينول أحمرThermo Fisher Scientific14065-056
HEPES ، محلول 1 م ، درجة الحموضة 7.3 ، درجة البيولوجيا الجزيئية ، فائقة النقاء ، الحرارية العلميةالحرارية فيشرالعلمية AAJ16924AE
كلوريد المغنيسيوم ، MgCl 2< / sub>  ؛Millipore SigmaM8266
MethanolFisher ScientificA452
NanoDrop 2000 / 2000c مقياس الطيف الضوئيThermo Fisher ScientificVV-83061-00
NEBNext Poly (A) mRNA وحدة العزل المغناطيسينيو إنجلاند BioLabsE7490S
NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit ل IlluminaNew England BioLabsE7530S
نونيلفينيل بولي إيثيلين جلايكول ، NP-40. IGEPAL CA-630Millipore SigmaI8896
ماء خال من النوكلياز ، وليس معالجب DEPC AmbionAM9932
النمام العلويDWK Life Sciences (ويتون)903475
PBS Buffer (10x) ، درجة الحموضة 7.4AmbionAM9625
بيرس بروتين مؤتلف L ، بيوتينيلثيرمو فيشر Scientific29997
كلوريد البوتاسيوم ، KClMillipore SigmaP4504
RNA 6000 Pico Kit & الكواشفAgilent5067-1513
RNaseZap RNase محلول إزالة التلوثInvitrogenAM9780
RNasin ريبونوكلاز مثبطاتPromegaN2515
أزيد الصوديوم ، NaN3< / sub>Millipore SigmaS2002
بيكربونات الصوديوم ، NaHCO3< / sub>Millipore SigmaS6297
SUPERase & middot ؛ في مثبط RNaseInvitrogenAM2694

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
  2. Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
  3. Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R. The etiology of hepatocellular carcinoma and consequences for treatment. The Oncologist. 15 Suppl 4, 14-22 (2010).
  4. Jadlowiec, C. C., Taner, T. Liver transplantation: Current status and challenges. World Journal of Gastroenterology. 22 (18), 4438-4445 (2016).
  5. Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. Liver regeneration. Science. 276 (5309), 60-66 (1997).
  6. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. The American Journal of Pathology. 176 (1), 2-13 (2010).
  7. Grompe, M., et al. Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice. Genes & Development. 7 (12A), 2298-2307 (1993).
  8. Wangensteen, K. J., et al. A facile method for somatic, lifelong manipulation of multiple genes in the mouse liver. Hepatology. 47 (5), 1714-1724 (2008).
  9. Wang, A. W., et al. TRAP-seq identifies cystine/glutamate antiporter as a driver of recovery from liver injury. The Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2297-2309 (2018).
  10. Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
  11. Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Pico: User Manual. , Retrieved from https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90046_RNA600Pico_KG_EN.pdf (2016).
  12. NEBNext. NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina: User Manual. , Retrieved from https://international.neb.com/-/media/nebus/files/manuals/manuale7530.pdf (2018).
  13. NanoDrop. 2000/2000c Spectrophotomerter: User Manual. , Retrieved from https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CAD/manuals/NanoDrop-2000-User-Manual-EN.pdf (2009).
  14. Liu, J., et al. Cell-specific translational profiling in acute kidney injury. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1242-1254 (2014).
  15. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis. Molecular Aspects of Medicine. 30 (1-2), 42-59 (2009).
  16. Wang, A. W., et al. The dynamic chromatin architecture of the regenerating liver. bioRxiv. , (2019).
  17. Zahm, A. M., et al. A high-content in vivo screen to identify microRNA epistasis in the repopulating mouse liver. bioRxiv. , (2019).
  18. Stork, C., Zheng, S. Genome-Wide Profiling of RNA-Protein Interactions Using CLIP-Seq. Methods in Molecular Biology. 1421, 137-151 (2016).
  19. Zhao, X., et al. Glutathione antioxidant pathway activity and reserve determine toxicity and specificity of the biliary toxin biliatresone in zebrafish. Hepatology. 64 (3), 894-907 (2016).
  20. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 542 (7641), 352-356 (2017).
  21. Camp, J. G., et al. Multilineage communication regulates human liver bud development from pluripotency. Nature. 546 (7659), 533-538 (2017).
  22. Wang, Y. J., Kaestner, K. H. Single-Cell RNA-Seq of the Pancreatic Islets--a Promise Not yet Fulfilled? Cell Metabolism. 29 (3), 539-544 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Translating Ribosome Affinity PurificationTRAP seqGene Expression ProfilingHepatocyte IsolationLiver RepopulationGFP L10A Fusion ProteinMagnetic Bead IsolationNuclear Lysate PreparationRNA Cleanup ProtocolHigh throughput Sequencing

مقالات ذات صلة