يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير بالخلايا الحية لتقييم ديناميات توقيت الطور ومصير الخلية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك

8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60255

⸱

سبتمبر 20, 2019

 ,  , 
1Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا نقدم بروتوكول لتقييم ديناميات تشكيل المغزل والتقدم الميتومي. لدينا تطبيق التصوير الفاصل الزمني تمكن المستخدم من تحديد الخلايا في مراحل مختلفة من المنوّد، وتتبع وتحديد العيوب الميتوتيكية، وتحليل ديناميات المغزل ومصير الخلية الميتومية عند التعرض للأدوية المضادة للميثوتيك.

الملخص

التصوير الحي بالفاصل الزمني للخلايا هو أداة هامة في بيولوجيا الخلايا التي توفر نظرة ثاقبة في العمليات الخلوية التي قد يتم تجاهلها أو إساءة فهمها أو إساءة تفسيرها من خلال تحليل الخلايا الثابتة. في حين أن التصوير والتحليل في الخلايا الثابتة قويويكفي لمراقبة الحالة الخلوية الثابتة، إلا أنه يمكن أن يكون محدوداً في تحديد ترتيب زمني للأحداث على المستوى الخلوي وغير مجهز لتقييم الطبيعة العابرة للعمليات الديناميكية بما في ذلك التقدم الميتومي. وعلى النقيض من ذلك، فإن التصوير بالخلايا الحية هو أداة بليغة يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الخلوية على مستوى الخلية الواحدة مع مرور الوقت، ولديه القدرة على التقاط ديناميات العمليات التي لولا ذلك لكانت ممثلة تمثيلاً ضعيفاً في تصوير الخلايا الثابتة. هنا نقوم بوصف نهج لتوليد الخلايا التي تحمل علامات الفلورسنت المسمى من الكروماتين والأنابيب الدقيقة واستخدامها في نهج التصوير بالخلايا الحية لرصد محاذاة الكروموسوم المرحلة الفوقية والخروج الميتوتيك. نحن نصف التقنيات القائمة على التصوير لتقييم ديناميات تشكيل المغزل والتقدم الميتومي، بما في ذلك تحديد الخلايا في مراحل مختلفة في المنوّج، وتحديد وتتبع العيوب الليتوتيكية، وتحليل ديناميات المغزل و مصير الخلية المصوّلة بعد العلاج مع مثبطات ميتوتيك.

المقدمة

ويشيع استخدام التحليل القائم على الصورة للخلايا الثابتة لتقييم التغيرات في مستوى سكان الخلايا استجابة لمختلف الاضطرابات. عند دمجها مع مزامنة الخلايا، متبوعة بجمع وتصوير نقاط الوقت التسلسلية، يمكن استخدام هذه الأساليب لاقتراح تسلسل خلوي للأحداث. ومع ذلك، فإن التصوير بالخلايا الثابتة محدود من حيث أن العلاقات الزمنية ضمنية للسكان ولا تظهر على مستوى الخلايا الفردية. وبهذه الطريقة، في حين أن تصوير الخلايا الثابتة وتحليلها يكفيان لمراقبة الأنماط الظاهرية القوية والتغيرات في الحالة الثابتة، فإن القدرة على الكشف عن التغيرات العابرة مع مرور الوقت والتغيرات التي تؤثر فقط على مجموعة فرعية من الخلايا غير كاملة. وعلى النقيض من ذلك، فإن التصوير بالخلايا الحية هو أداة بليغة يمكن استخدامها لمراقبة العمليات الخلوية ودون الخلوية داخل خلية واحدة، أو السكان الخلويين، مع مرور الوقت ودون مساعدة من نهج التزامن التي قد تؤثر في حد ذاتها على السلوك الخلوي 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6.

تشكيل المغزل الميتومي ثنائي القطب ضروري للفصل الكروموسومي السليم أثناء انقسام الخلايا، مما أدى إلى خليتين ابنة متطابقة وراثيا. العيوب في بنية المغزل الميتومية التي تؤدي إلى تلف التقدم الميتومي واختراق دقة فصل الكروموسوم يمكن أن تؤدي إلى انقسامات الخلايا الكارثية وانخفاض قدرة الخلايا على البقاء. لهذا السبب، السموم الميتوتيكية التي تغير تشكيل المغزل هي العلاجات الواعدة للحد من الانتشار السريع للخلايا السرطانية7،8،9. ومع ذلك، فإن تحليل الخلايا الثابتة لهيكل المغزل بعد إضافة السموم الميتوتيكية محدود في قدرته على تقييم العملية الديناميكية لتكوين المغزل وقد لا يشير إلى ما إذا كانت التغيرات الملاحظة في بنية المغزل دائمة أو هي بدلا من ذلك عابرة ويمكن التغلب عليها للسماح تقسيم الخلايا الناجحة.

في هذا البروتوكول، نقوم بوصف نهج لتقييم ديناميات الميثوس بعد اضطرابات المغزل عن طريق التصوير بالخلايا الحية. باستخدام خط الخلية RPE-1 الخالدة hTERT هندستها للتعبير عن الهستون 2B ذات العلامات RFP لتصور الكروماتين، جنبا إلى جنب مع EGFP الموسومة α-tubulin لتصور microtubules، وتوقيت محاذاة الكروموسوم metaphase، بداية الطور، وفي نهاية المطاف يتم تقييم مصير الخلية المصوّلة باستخدام الإشارات البصرية لحركة الكروموسوم، والضغط، والمورفولوجيا النووية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. توليد خلايا hTERT-RPE-1 تعبر بشكل ملحوظ RFP-Histone 2B (RFP-H2B) وα-tubulin-EGFP (الحوض-EGFP)

ملاحظة: تتبع جميع الخطوات تقنيات العقيم وتجري في خزانة أمان من المستوى الثاني+ (BSL2+).

  1. توليد الفيروسات الرجعية تحمل الجينات ذات الأهمية (α-tubulin-EGFP و RFP-H2B) عن طريق التغوط من الخلايا 293T مع بلازميدات اللينفيروسي مناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لنظام تسليم التغوط القائم على الدهون.
    1. اليوم 1: استخدام ماصة باستور الزجاج المتاح لاستنشاق السائل ثقافة الخلية من لوحة من الخلايا تحت اللتحقيق ة 293T وغسل قبالة المتوسطة المتبقية مع الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) عن طريق إضافة 5 مل من PBS. دوامة لتوزيع PBS على أسفل لوحة، ثم يستنشق PBS مع ماصة باستور الزجاج المعقمة القابل للتصرف.
    2. إضافة 2 مل من 0.05٪ تريبسين التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجة مئوية وإعادة لوحة إلى حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لمدة 2 إلى 5 دقائق للسماح للخلايا الملتصقة ليتم تحريرها من سطح طبق ثقافة الخلية.
    3. إضافة 8 مل من دولبكو الطازجة تعديل النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقديات إلى لوحة تحتوي على التربسين.
    4. إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي معقمة 15 مل. ضع الأنبوب المخروطي في جهاز طرد مركزي متوازن والدوران في 161 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه بلطف الخلايا.
    5. يستنشق الحل المتوسط / التربسين من الخلايا الكريات وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من DMEM تستكمل مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين / العقديات. استخدام مقياس الهيموجيتومتر لحساب تعليق الخلية 293T ولوحة 2 × 106 293T الخلايا لكل بئر من لوحة بئر 6.
    6. خلايا الثقافة في حجم إجمالي 2 مل من دولبكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / العقديات والحفاظ عليها في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    7. اليوم 2: ماصة 7 ميكرولتر من كاشف تسليم التغوط القائم على الدهون و 100 ميكرولتر من المصل المنخفض المتوسط في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل والسماح لها باحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق (أنبوب #1).
    8. في أنبوب منفصل للطرد المركزي الصغير بقدرة 1.5 مل، ماصة 1 ميكروغرام من ناقلات التعبير RFP-H2B (أو 1 ميكروغرام من متجه التعبير α-tubulin-EGFP)، جنبا إلى جنب مع 5 ميكرولتر محسن كاشف (كما هو مطلوب وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة)، 0.5 ميكروغرام pMD2.G، و 1 ميكروغرام psPAX2 و 100 ميكرولتر من خفض المصل المتوسطة (أنبوب #2).
    9. الجمع بين محتويات الخطوة 1.1.7 والخطوة 1.1.8 عن طريق أنبوب الأنابيب بعناية #2 في أنبوب #1 وحضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن تحجيم رد الفعل حسب الحاجة لتبديل الخلايا في آبار إضافية.
    10. ماصة رد فعل الانفص يُسقط إلى البئر المطلوب الذي يحتوي على خلايا 293T في 2 مل من المتوسط وإرجاع الطبق إلى الحاضنة المرطبة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
      ملاحظة: لإنشاء خلايا تعبر عن كل من RFP-H2B و α-tubulin-EGFP إنشاء فيروس منفصل لكل إنشاء تعبير (الخطوات 1.1.7-1.1.9).
    11. اليوم 3: يستنشق واستبدال المتوسط مع 2 مل من DMEM الطازجة تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقديات. إعادة الطبق إلى حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  2. اليوم 4: جمع المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروس أعرب، مع توخي الحذر عدم تعطيل أو إزالة الخلايا 293T. تصفية المتوسطة التي تحتوي على جزيئات الفيروس عن طريق تمريرها من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر تعلق على حقنة 5 مل. فيروس Aliquot للتخزين على المدى القصير في 4 درجة مئوية، أو تخزين على المدى الطويل في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: الجسيمات الفيروسية التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة ستكون موجودة في مجموعة من ~ 1 × 107 إلى 1 × 108 وحدات Transducing / مل. وبما أن الخلايا والخلايا المنتجة للفيروسات التي ستصاب بالعدوى تُستثَل َّ في نفس الوسط، فإن التركيز الفيروسي لاستبدال المتوسّطة غير مطلوب، ويمكن استخدام الجسيمات الفيروسية المصفاة مباشرة لإصابة الخلايا.
  3. البذور 2 × 105 خلايا hTERT-RPE-1 في بئر من طبق 6 جيدا استعدادا للعدوى الفيروسية. خلايا الثقافة في 2 مل من DMEM تستكمل مع 10٪ FBS و 1٪ البنسلين / العقديات والحفاظ عليها في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  4. اليوم 5: إضافة بروميد سداسي الديمثيرين (على سبيل المثال، البولي بيرين) إلى خلايا hTERT-RPE-1 إلى تركيز نهائي قدره 8 ميكروغرام/مل. تصيب الخلايا بخليط من 500 درجة مئوية من الفيروس المخفف في 500 ميكرولتر من متوسط ثقافة الخلية.
    ملاحظة: يتم إعداد محلول مخزون بروميد سداسي الديمثيرين في الماء المقطر المعقمة، ثم تصفيته من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر.
  5. اليوم 6: باستخدام ماصة باستور الزجاج المتاح، يستنشق المتوسطة من الآبار التي تحتوي على الخلايا المصابة بالفيروس. استبدال وسط ثقافة الخلية مع 2 مل من DMEM تحتوي على 10٪ FBS، 1٪ البنسلين / العقديات، وتركيزات مناسبة من المضادات الحيوية لاختيار لدمج بلازميد والتعبير.
    ملاحظة: يحمل تعبير α-tubulin-EGFP plasmid المستخدم في التجارب الموصوفة جين مقاومة البوروميسيسين ويحمل بلازميد التعبير RFP-H2B جين مقاومة بوبيتشيدين. ولذلك، يتم استخدام 10 ميكروغرام / مل من البوروميسين و 2 ميكروغرام / مل من blasticidin لاختيار α-tubulin-EGFP، RFP-H2B التعبير عن خلايا hTERT RPE-1. قد تختلف تركيزات المضادات الحيوية المستخدمة في الاختيار لخطوط الخلايا المختلفة المستخدمة.
  6. الحفاظ على الخلايا تحت اختيار المضادات الحيوية لمدة 5-7 أيام، واستبدال المتوسطة كل 3 أيام مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على الكواشف الاختيار المناسبة.
    ملاحظة: ينبغي الاحتفاظ بالخلايا عند الالتقاء الفرعي أثناء الاختيار وينبغي توسيعها حسب الحاجة، على النحو المبين في الخطوات 1-1-1 إلى 1-1-4.
  7. استخدام التصوير المناعي لتأكيد التعبير عن المنشآت الموسومة.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، يمكن اشتقاق نسخ خلية واحدة للحصول على مستويات تعبير موحدة داخل مجموعة الخلايا. بمجرد تأكيد الحيوانات المستنسخة المستقرة، يمكن الحفاظ على الخلايا في ظل ظروف الثقافة القياسية في غياب اختيار المضادات الحيوية.

2. إعداد الخلايا لتصوير الخلايا الحية بعد اضطرابات المغزل الميتومي

ملاحظة: استخدام تقنيات العقيم وتنفيذ الخطوات في خزانة أمان BSL2.

  1. باستخدام ماصة باستور الزجاجية المعقمة التي يمكن التخلص منها، يستنشق الوسيلة من لوحة الثقافة التي تحتوي على خط الخلية الذي يحمل بنية (ق) التعبير (من الخطوة 1.7). غسل الخلايا لفترة وجيزة مع 10 مل من PBS معقمة. دوامة لتوزيع PBS على أسفل لوحة، ثم يستنشق PBS مع ماصة باستور الزجاج المعقمة القابل للتصرف.
  2. أضف 2 مل من 0.05% تريبسين إلى لوحة 10 سم. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 2-5 دقيقة أو حتى الخلايا قد انفصلت عن سطح اللوحة.
  3. إضافة 8 مل من المتوسطة الطازجة إلى لوحة تحتوي على التربسين. إعادة تعليق الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف ونقل التعليق إلى أنبوب مخروطي معقمة 15 مل. ضع الأنبوب المخروطي في جهاز طرد مركزي متوازن والدوران في 161 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه بلطف الخلايا.
  4. يستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق في 10 مل من PBS عن طريق الأنابيب بلطف مع ماصة المصلية 10 مل. ضع الأنبوب المخروطي في جهاز طرد مركزي متوازن والدوران في 161 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه بلطف الخلايا.
  5. يستنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق في 10 مل من المتوسطة الطازجة عن طريق الأنابيب بلطف مع ماصة المصلية 10 مل.
  6. عد الخلايا، ثم حساب رقم الخلية باستخدام مقياس الهسة وتخفيف إلى تركيز 1-2 × 105 خلايا / مل في وسط ثقافة الخلية. البذور 500 درجة مئوية من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة قاع التصوير المعقمة 12 جيدا. وضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية والسماح للخلايا التمسك سطح اللوحة.
    ملاحظة: يتطلب التصوير بالخلايا الحية أن تكون الخلايا ملتزمة بشكل جيد بحيث تظل مرتبطة بمستوى التصوير أثناء الحصول على الصور. يمكن أن تختلف مدة الوقت اللازم للخلايا للتمسك بالطلاء التالي من خط خلية إلى آخر، وينبغي تحسينها لخط الخلية قيد الدراسة.
  7. ما يصل إلى 30 دقيقة قبل بدء التصوير بالفاصل الزمني، إضافة تركيز ذات الصلة من دواء ميتوتيك إلى واحد أو أكثر من الآبار المصنفة مع الخلايا. لحساب التأثير المحتمل للالمذيب العضوي على السلوك الخلوي، إضافة حجم متساو من مادة مخففة المانع إلى الخلايا كضوابط. على سبيل المثال، تأكد من أن إضافة 100 nM من مثبط معين من الكيناز الشفق A (على سبيل المثال، alisertib) موازية لحجم متساو من DMSO، ومخفف لهذا الدواء، في بئر التحكم في الخلايا.
    ملاحظة: يتطلب التحليل المقارن للتغيرات الدينامية في التطور الميتوتيك إعداد آبار الخلايا في غياب الاضطرابات لتمكين تصوير الميتوس العادي بالتوازي مع الظروف التجريبية.

3. المجهر إعداد لتصوير الفاصل الزمني من RFP-H2B، α-tubulin-GFP التعبير عن الخلايا(الشكل 1، الشكل 2)

  1. ضع لوحة ثقافة الخلية التي تحتوي على RFP-H2B، α-tubulin-GFP تعبر عن خلايا hTERT RPE-1 ليتم تصويرها في إدراج مرحلة مناسبة على مجهر إبيفلوورسينم المقلوب الذي تم تجهيزه بكاميرا عالية الدقة (حجم بكسل من 0.67 ميكرومتر في 20x)، وهو عبارة عن غرفة البيئية تسخينها إلى 37 درجة مئوية، ونظام التسليم لترطيب 5٪ CO2.
    ملاحظة: إما أن تكون الغرف البيئية المغلقة أو إدراج اتّصال يُالتحكم في درجة الحرارة مناسباً شريطةأن يتم تسليم درجة حرارة 2 رطبة بنسبة 5% والحصول على درجة حرارة مستقرة.
  2. استخدم هدف هواء 20 x مع فتحة عددية تبلغ 0.5 ومجهزة للتباين العالي التباين وتباين المرحلة أو التصوير بالحقول الساطعة. عرض الخلايا مع تباين المرحلة أو brightfield وضبط المسار والتركيز الدقيق على المجهر لجعل الخلايا في التركيز.
  3. تحديد وتحديد أوقات التعرض المثلى لاقتناء صورة brightfield وGFP وRFP عن طريق اختيار مكعب الفلتر المعني مع الإثارة والانبعاثات المناسبة للفلوروفور التي سيتم تصويرها. بدلاً من ذلك، انقر فوق زر التعرض التلقائي لإدخال وقت تعرض محدد مسبقًا. إذا لم تكن الإشارة مكثفة بما فيه الكفاية، حدد التوفير بكسل لتمكين أوقات التعرض أقصر عن طريق النقر على علامة التبويب binning واختيار 2 × 2 بكسل من القائمة المنسدلة.
    ملاحظة: السمية الضوئية يمكن أن تعوق تطور الميثوتيك وجدوى الخلية. قد يكون فشل الخلايا المصوّلة في مجموعات التحكم في إكمال الميتوس العادي مؤشراً على أن أوقات التعرض و/أو مدة التصوير تحتاج إلى مزيد من التحسين.
  4. استخدم برنامج الاكتساب والتحليل الذي يمكّن من الحصول على التصوير متعدد الإحداثيات والآبار في وقت واحد وتحديد المعلمات الخاصة بالحصول على الصورة.
    1. حدد ومعايرة مرحلة المجهر إلى طبق متعدد الآبار، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدم برنامج الحصول على الصور لتمييز الآبار التي سيتم تصويرها أو تحديدها بالنقر على الآبار ذات الصلة في الرسم التخطيطي لتنسيق اللوحة المستخدمة.
    2. ضمن لوحة التحكم GeneratedPoints (الشكل 2)،حدد الإحداثيات داخل كل بئر سيتم تصويرها بالنقر فوق علامة التبويب موضع النقطة وتحديد موضع إحداثيات محدد مسبقًا أو عشوائي من القائمة المنسدلة. حدد علامة التبويب منطقة العمل وحدد مقيد من القائمة المنسدلة لتقييد منطقة تحديد الإحداثيات لاستبعاد حدود البئر. انقر فوق علامتي التبويب Count والتوزيع لتحديد عدد النقاط وتوزيعها ليتم التقاطها لكل بئر على التوالي.
      ملاحظة: سيتم تحديد عدد الإحداثيات التي يمكن تصويرها لكل بئر ضمن زيادة النقطة الزمنية 5 دقيقة بعدد الآبار التي سيتم تصويرها، بالإضافة إلى وقت التعرض لكل قناة. عادة، إحداثيات 5-8 لكل بئر كافية لمراقبة ما لا يقل عن 50 خلية في كل حالة تقدم من خلال mitosis في غضون 4 ح.
    3. حدد إدخال الفاصل الزمني والمدة لجمع الصور عن طريق النقر على القيم وإدخالها في لوحة تحكم TimeSequence.
      ملاحظة: الحصول على الصور كل 1 إلى 5 دقائق هو مناسب لرصد ديناميات التقدم الميتومي. يجب أن تعكس المدة الإجمالية للتصوير نقطة النهاية المطلوبة ومعدل انتشار خط الخلية. على سبيل المثال، 4 ساعات كافية لرؤية العديد من الخلايا التقدم من خلال mitosis، 16 ساعة كافية لرؤية معظم الخلايا RPE-1 في تقدم السكان غير متزامن من خلال ميتوسي.

4. تحليل صورة الفاصل الزمني لتحديد توقيت المرحلة الفوقية ومصير الخلية الميتوتيكية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك

ملاحظة: إجراء تحليل الصورة باستخدام برنامج الحصول على صورة(جدول المواد)أو ImageJ أو برنامج تحليل الصور القابلة للمقارنة.

  1. تصور RFP-H2B المسمى كروماتين عن طريق تحديد الصور التي تم التقاطها مع مكعب فلتر RFP في مكانها. تحديد خلية تدخل الميطوس كما هو مبين في ضغط الكروماتين الأولي(الشكل 2C،رأس السهم الأزرق) والمغلف النووي تنهار (عندما α-tubulin-EGFP لم يعد مستبعدا من قبل الحدود النووية).
  2. تحديد التوقيت الميتوتيك لمحاذاة المرحلة الفوقية وبداية الطور في الخلايا الفردية: تعقب الخلية من خلال نقاط زمنية متتالية في الفيلم المكتسب لتحديد عدد النقاط الزمنية/الدقائق من الإدخال الميتوتيك حتى الكروماتين الذي يحمل علامة RFP-H2B يكمل محاذاة في خط الاستواء الخلية أثناء المرحلة الفوقية(الشكل 2C،رأس السهم الأصفر).
  3. لمراقبة التوقيت المصوّر، والإخلاص المصوّر، ومصير الخلية، استمرّ في تعقب الخلية من خلال نقاط زمنية متتالية لتحديد إحداثيات الوقت التي يكون فيها فصل كروموسوم الطور الظاهر(الشكل 2C،رأس السهم الأبيض) و/أو حيث تم إزالة ضغط الكروماتين وإصلاح المغلف النووي (كما هو مبين من قبل استبعاد توبولين من النواة) قد حدث.
    ملاحظة: يمكن تقييم الاضطرابات في تجميع المغزل أو التقدم الميتومي كدالة للوقت اللازم للحصول على المغزل الميتومي ثنائي القطب وتحقيق محاذاة كروموسوم كاملة، أو لإكمال فصل كروموسوم الطور.
  4. تصور RFP-H2B لتحديد الخلايا في كل السكان التي تظهر عيوب ميتوتيك بما في ذلك الكروموسومات المتخلفة والجسور الكروماتين أثناء فصل كروموسوم الطور.
    ملاحظة: قد يؤدي الإخلاص المصوّر إلى خلايا ابنة متعددة النوى أو micronucleated ويمكن تصورها في الخلايا بعد الخروج المنطي، كما هو الحال في الشكل 3.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقييم التقدم الميتومي في وجود اضطرابات المغزل
تنظيم تركيز القطب المغزل هو خطوة أساسية في تشكيل المغزل ثنائي القطب السليم. تعطيل في هذه العملية من خلال استنفاد البروتين، وتثبيط المخدرات، أو التعديلات في عدد سنتروسوم تلف هيكل المغزل وتأخير أو وقف التقدم الميتومي10،11،12،13. ومع ذلك، فإن بعض الاضطرابات فقط تأخير عابر تشكيل المغزل مع الخلايا في ن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يسمح الدقة الزمنية التي يوفرها التصوير بالفاصل الزمني بتصور وتقييم الأحداث الخلوية المتسلسلة داخل الخلايا المفردة. والنهج التي تستخدم التزامن الخلوي متبوعاً بجمع الخلايا وتثبيتها في نقاط زمنية متسلسلة محدودة من حيث أن المقارنات تتم في نهاية المطاف بين مجموعات الخلايا. في السياقات التي قد تكون فيها الاستجابة الخلوية للاضطرابات غير موحدة، أو حيث تكون العملية التي يتم تصورها ديناميكية، يكون التصوير الحي بالفاصل الزمني للخلايا مجهزًا بشكل أفضل لمتابعة وتحليل كل من ديناميات الخلايا المفردة، فضلاً عن عدم التجانس ضمن السكان الخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

ويدعم DLM من قبل GRFP NSF. يتم دعم ALM بتمويل من جائزة عائلة سميث للتميز في البحوث الطبية الحيوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ TrypsinGibo-Life Sciences25-510بروتياز سيرين يستخدم لإطلاق الخلايا الملتصقة من أطباق الثقافة
15 مل أنابيب الطرد المركزيأوليمبوس بلاستيك28-101
20x CFI Plan Fluor Objective نيكونللاستخدام في تصوير الخلايا الحية لتصور كل من المجال الساطع والفلورة
293T CellsATCCCRL-3216للاستخدام في تعدي الفيروسات القهقرية ؛ تستخدم في الخطوة 1.1
a-tubulin-EGFP & nbsp ؛Addgeneأرقام مختلفةمتجه التعبير عن ألفا توبولين مدمج في علامة بروتين الفلورسنت الخضراء ؛ للاستخدام في تصور التوبولين في تصوير الخلايا الحية: متاح تجاريا من خلال addgene والبائعين الآخرين
AlisertibSelleckchemS1133مثبط جزيء صغير من كيناز الانقسامي Aurora A. يتم تحضير تركيز المخزون عند 10 ملي مولار في DMSO ، ويستخدم بتركيز نهائي يبلغ 100 نانومتر.
عامل اختيار المضادات الحيوية BlasticidinInvitrogenA11139-03؛ يستخدم لاختيار الخلايا التي تعبر عن a-tub-EGFP
C02Airgasللاستخدام في زراعة الخلايا وتصوير الخلايا الحية
Chroma ET-DS Red (TRITC / Cy3)Chroma49005مجموعة مرشحات أحادية النطاق ؛ الطول الموجي للإثارة 545 نانومتر مع عرض النطاق الترددي 25 نانومتر وانبعاث عند الطول الموجي 605 نانومتر مع عرض النطاق الترددي 70 نانومتر ؛ لتصور H2B-RFP
Chroma ET-EGFP (FITC / Cy2)Chroma49002مجموعة مرشحات أحادية النطاق ؛ الطول الموجي للإثارة 470 نانومتر مع عرض النطاق الترددي 40 نانومتر وانبعاث بطول موجي 525 نانومتر مع عرض النطاق الترددي 50 نانومتر ؛ لتصور ماصات GFP-tubulin
الزجاجية القابل للتصرف Pastuer ، معقمة & nbsp ؛فيشر العلمي13-678-6Aللاستخدام في الخلايا الشفاطة   ؛
دولبيكو s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibo-Life Sciences11965-084وسط زراعة الخلايا لنمو خلايا RPE-1 و 293T
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Gibo-Life Sciences10438-026مكمل متوسط لزراعة الخلايا
Lipofectamine 3000 و p3000InvitrogenL3000-015كاشف تعدي قائم على الدهون لتعداء البلازميدات ؛ تستخدم في 1.1.4
أطباق زراعة الأنسجة المتعددة الآبارCorningمختلفةللاستخدام في زراعة الخلايا ، التعدي / العدوى ، وتصوير الخلايا الحية
مجهر نيكون Ti-Eنيكونالمقلوب لاستخدام في تصوير الخلايا
الحية NIS Elements HC & nbsp ؛نيكونالإصدار 4.51برنامج الحصول على الصور وتحليلها؛ يستخدم في القسمين 3 و4
OPTI-MEMGibo-Life Sciences31985-070وسط مصل منخفض لتعداء الخلايا؛ يستخدم في الخطوة 1.1.3
البنسلين/الستربتومايسين Gibo-Life Sciences15140-122مضاد حيوي يستخدم في زراعة الخلايا
ملحي متوسط الفوسفات (PBS)مختبرات CaissonPBP06-10X1LTمحلول ملحي معقم للاستخدام مع زراعة الخلايا
pMD2.GAddgene12259Lentiviral VSV-G تعبير التعبير عن المغلف ؛ تستخدم في الخطوة 1.1.4
PolybreneSigma-AldrichH9268البوليمر الكاتيوني المستخدم لتعزيز كفاءة العدوى الفيروسية. تستخدم في الخطوة 1.1.10
psPAXAddgene12260الجيل الثاني من البلازميد لتغليف العدسات الفيروسية ؛ تستخدم في الخطوة 1.1.4
PuromycinInvitrogenant-pr-1عامل اختيار المضادات الحيوية ؛ تستخدم لاختيار RFP-H2B للخلايا التي تعبر
عن RFP- Histone 2B (H2B)Addgeneمختلفةناقل التعبير عن هيستون 2B ببروتين الفلورسنت الأحمر ؛ للاستخدام في تصور الكروماتين في تصوير الخلايا الحية: متاح تجاريا من خلال Addgene والبائعين الآخرين
RNAi MaxInvitrogen13778-150كاشف التعداء القائم على الدهون لتعداء siRNA يبني
خلايا RPE-1ATCCCRL-4000الخلية الظهارية الصباغ الشبكي البشري
طبق زراعة الأنسجة 100x20mmCorning   ؛353003للاستخدام في زراعة الخلايا الملتصقة
Zyla sCMOS camera نيكونمتصلة بالميكروسكوب ، وتستخدم لالتقاط صور للخلايا
مجهر محلول أرقام خط كاميرا

المراجع

  1. Szuts, D., Krude, T. Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage. Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).
  2. Gayek, A. S., Ohi, R. CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis. PLoS One. 11, e0157491(2016).
  3. Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint. The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).
  4. Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells. Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).
  5. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).
  6. Khodjakov, A., Rieder, C. L. Imaging the division process in living tissue culture cells. Methods. 38, 2-16 (2006).
  7. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. How do anti-mitotic drugs kill cancer cells? Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).
  8. van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. Antimitotic drugs in the treatment of cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).
  9. Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand. Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).
  10. Martin, M., Akhmanova, A. Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization. Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).
  11. Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).
  12. Vitre, B. D., Cleveland, D. W. Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy. Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).
  13. Godinho, S. A., Pellman, D. Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).
  14. Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes. Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).
  15. Conte, N., et al. TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer. Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).
  16. Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 125, 4391-4402 (1998).
  17. Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces. Molecular Cancer. 10, 131(2011).
  18. Chan, J. Y. A clinical overview of centrosome amplification in human cancers. International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).
  19. Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death. Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).
  20. Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
  21. Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells. PLoS One. 4, e6564(2009).
  22. Nigg, E. A. Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression? Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).
  23. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).
  24. Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering. Science. 307, 127-129 (2005).
  25. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير بالخلايا الحية لتقييم ديناميات توقيت الطور ومصير الخلية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.