مقالة منهجية

التصوير من ATP داخل الخلايا في شرائح الانسجه العضوية من الدماغ الماوس باستخدام الاستشعار القائم علي التاكل ATeam 1.03يمك

11.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60294

⸱

ديسمبر 19, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neurobiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, 2Department of Neurology, Düsseldorf University Hospital

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نحن وصف بروتوكول للتعبير عن نوع الخلية محدده من المستشعر القائم علي التاكل المرمزة وراثيا ATeam 1.03يمك في الثقافات شريحة النمط العضوي من الدماغ الامامي الماوس. علاوة علي ذلك ، نعرض كيفيه استخدام هذا المستشعر للتصوير الديناميكي لمستويات ATP الخلوية في الخلايا العصبية و astrocytes.

الملخص

النشاط العصبي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) يستدعي ارتفاع الطلب علي الطاقة الخلوية التي يوفرها انهيار الفوسفات الثلاثي (ATP). هناك حاجه إلى حصة كبيره من ATP لأعاده تثبيت التدرجات أيون عبر اغشيه البلازما المتدهورة بواسطة الإشارات الكهربائية من الخلايا العصبية. هناك أدله علي ان استروسيتيس-في حين لا توليد الإشارات الكهربائية السريعة أنفسهم-الخضوع لزيادة إنتاج ATP استجابه للنشاط العصبي ودعم الخلايا العصبية النشطة من خلال توفير نواتج الأيض الطاقة لهم. التطور الأخير لأجهزه الاستشعار المشفرة وراثيا لنواتج الأيض مختلفه تمكن الآن دراسة مثل هذه التفاعلات الايضيه بين الخلايا العصبية و astrocytes. هنا ، ونحن وصف بروتوكول للتعبير عن نوع الخلية محدده من ATP الحساسة الفلورية الرنين نقل الطاقة-(الحنق-) الاستشعار ATeam 1.03يمك في الانسجه العضوية شريحة الثقافات من الحصين الماوس والقشرة باستخدام النواقل الفيروسية المرتبطة ADENO (aav). وعلاوة علي ذلك ، فاننا نثبت كيف يمكن استخدام هذا المستشعر للقياس الديناميكي للتغيرات في مستويات ATP الخلوية في الخلايا العصبية والأسطرلابات عند الزيادات في البوتاسيوم خارج الخلية والحث التالي لنقص التروية الكيميائية (اي تثبيط استقلاب الطاقة الخلوية).

المقدمة

النشاط الكهربائي المثير من الخلايا العصبية يستند إلى حد كبير علي تدفق الشحنات مثل الصوديوم (Na +) والبوتاسيوم (K +) عبر اغشيه البلازما الخاصة بهم. التالي فان صيانة التدرجات الكهروكيميائية لهذين الأيونين مطلوبه للاشاره. ويتحقق هذا من قبل Na الخلوية +/ك +-atpase (nka) ، وأعرب بشكل مطلق مضخة الغشاء الكهربائي ، التي البثق 3Na + من الخلية في مقابل 2K + من الفضاء خارج الخلية ، والتي تتطلب استهلاك جزيء واحد من ATP لكل دوره النقل1. بالاضافه إلى NKA ، وهناك العديد من الناقلات الأيونات الأخرى المستهلكة ATP بما في ذلك غشاء البلازما Ca2 +-atpase ، وهو أمر حيوي لل ca داخل الخلايا2 + التوازن وتصديرها بعد النشاط الناجم عن تدفق2. في الحويصلات بريسينابتيك ، فاكولار-نوعH +-atpase (v-atpase) يخلق التدرج البروتون اللازمة لامتصاص النواقل العصبية في هذا المقصورة3.

في حين ان نشاط الخلايا العصبية التالي يتطلب كميه كبيره من ATP4, انها لا تظهر قدره كبيره لتخزين الطاقة. بدلا من, يبدو انها تعتمد علي التفاعلات الايضيه مع astrocytes المجاورة, مخازن الجليكوجين الرئيسية في الدماغ5. وقد اقترح ان الجليكوجين والنجميه يلعب في الواقع دورا هاما في دعم احتياجات الطاقة العصبية; وظاهره رئيسيه في هذا الاقتراح اقتران العصبية الايضيه بين نوعي الخلية هو قدره استروسيتيس لزيادة إنتاجها ATP استجابه للنشاط العصبية6,7,8. هذه الفرضية, المعروفة باسم المكوك اللاكتات العصبية astrocyte (anls), لا يزال قيد المناقشة, لان العمل الأخرى قدمت أدله علي ان الخلايا العصبية قد أيضا زيادة معدل الخاصة بهم من تحلل الجلوكوز استجابه لتحفيز9,10, تعكس ضرورة المزيد من الطرق والنهج لدراسة التفاعل العصبية-

التحقيق في التمثيل الغذائي للطاقة الخلوية ومستويات ATP في الخلايا العصبية و استروسيتيس لتوضيح التفاعلات الايضيه العصبية الدبقيه قد أعيقت منذ فتره طويلة بسبب عدم وجود تحقيقات مناسبه للكشف عن التغيرات في تركيزات المستقلب في الخلايا الحية في انسجه المخ. ومع ذلك ، فقد وفر العقد الأخير طفرة في تطوير أدوات جديده وتحقيقات فلورية جديده مرمزه وراثيا لنواتج الأيض المختلفة ، بما في ذلك أجهزه الاستشعار لل ATP ، اللاكتات ، بيروفات وغيرها11،12. باستخدام هذه الاداات ، أصبح من الممكن الآن مباشره معالجه الاسئله المتعلقة باستهلاك ATP الخلوي والتغيرات في مستويات الطاقة الخلوية علي مستوي الخلية الواحدة وبطريقه محدده من نوع الخلية في انسجه المخ السليمة13.

في العمل الحالي ، ونحن وصف اجراء لتصور ديناميات ATP عصاري خلوي علي الخلايا العصبية و استروسيتيس من شرائح الدماغ المجسم المثقف. نعرض كيفيه استخدام النواقل الفيروسية المرتبطة بالموجات العالية (aav) للتعبير المحدد من نوع الخلية عن الترميز الوراثي ATP-نانوسيتور ateam 1.03يمك (14) في الخلايا العصبية و استروسيتيس من شرائح الدماغ الماوس التي يمكن الاحتفاظ بها في ثقافة الخلية لعده أسابيع15. يتم وصف اجراء لكيفيه أزاله الندبة الداليه التي تغطي شرائح الانسجه المستزرعة ، مما يحسن امكانيه الوصول البصري وتصوير الخلايا في طبقات النسيج العضوي تحت. وأخيرا ، ونحن نظهر كيف ATeam 1.03يمك يمكن استخدامها لأداء التصوير القائم علي الحنق من التغييرات في مستويات ATP الخلوية في هذا الاعداد. هذا الأسلوب يستضيف المزايا الرئيسية التي لا تتطلب إجراءات الدماغ الجراحية ، ويوفر مستويات عاليه من التعبير عن الاستشعار ونوعيه الخلية في شرائح الدماغ مثقف ، والحد من غزو أو الإجهاد في الخلايا بالمقارنة مع غيرها من الطرق ، مثل التحويل عن طريق الكهرباء أو نقل مع ناقلات الفيروسيةالأخرى10،16، بالاضافه إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذا البروتوكول علي الأخرى التي تستند إلى التاكل النانويه ، من بينها المتغيرات من 1.03 ATeam التي توفر تقارب ربط اقل ل ATP14.

البروتوكول

وقد أجريت هذه الدراسة بما يتفق تماما مع المبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعه هاينريش هين في دوسلدورف ، فضلا عن التوجيه الصادر عن مجلس الجماعة الاوروبيه (2010/63/EU). وقد أبلغت جميع التجارب التي تستخدم الثقافات شريحة الدماغ العضوية ووافق عليها مكتب رعاية الماشية في مرفق الرعاية والاستخدام الحيوانية من جامعه هاينريش هين دوسلدورف (القانون المؤسسي رقم: O50/05). ووفقا لتوصيات اللجنة الاوروبيه18، قتلت الماشية حتى 10 أيام من العمر بقطع الراس.

1. اعداد الثقافات شريحة الدماغ العضوية الوراثية (OTCs)

  1. اليوم قبل أو علي الأقل 30 دقيقه قبل الاجراء
    1. اعداد طبق بيتري (في ظل ظروف معقمه). أزاله غطاء من 6 لوحه جيدا ومكان 800-850 μL من المتوسطة OTC في كل بئر. الحفاظ علي لوحه في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2/95 ٪ O2) حتى المطلوب.
    2. اعداد غسل الاطباق بيتري (في ظل ظروف معقمه). أضافه 3 مل من HBSS إلى كل طبق بيتري 30 ملم. مطلوب ما مجموعه 5 اطباق لكل اجراء. وضعها في الحاضنة (37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2/95 ٪ O2) لمده 30 دقيقه علي الأقل-بين عشيه وضحيها حتى المطلوب.
    3. اعداد ACSF (الجدول 1). الحفاظ علي المالحة دون الجلوكوز في 4 درجه مئوية حتى اليوم التالي.
الsalines ووسائل الاعلام-صياغة
اسماختصارتكوينالتركيز [مم]تعليقات
محلول السائل النخاعي الاصطناعيACSFكلوريد125بوبليد مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2، pH 7.4
بوكل2.5دائما أضافه الجلوكوز الحق قبل الاستخدام.
CaCl2 2لا تخزن لأكثر من يوم واحد مع الجلوكوز
MgCl2 1~ 310 mOsm/L
الجناح2بو4 1.25
شركه النهدي3 26
الجلوكوز20
التجريبية ACSFE-ACSFكلوريد136بوبليد مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2، pH 7.4
بوكل3دائما أضافه الجلوكوز الحق قبل الاستخدام.
CaCl2 2لا تخزن لأكثر من يوم واحد مع الجلوكوز
MgCl2 1~ 320 mOsm/L
الجناح2بو4 1.25
شركه النهدي3 24
الجلوكوز5
اللاكتات1
محلول نقص التروية الكيميائيةرابطه الدول المستقلهكلوريد136بوبليد مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2، pH 7.4
بوكل3~ 318 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
الجناح2بو4 1.25
شركه النهدي3 24
2 ، 2-ديوكسيكوز2
نان3 5
8 ملم البوتاسيوم ACSF8 ملمK + acsfكلوريد128بوبليد مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2، pH 7.4
بوكل8~ 320 mOsm/L
CaCl2 2
MgCl2 1
الجناح2بو4 1.25
شركه النهدي3 24
الجلوكوز5
اللاكتات1
Hepes-مخزنه ACSFH-ACSFكلوريد125تعديل لدرجه الحموضة 7.4 مع NaOH
بوكل3دائما أضافه الجلوكوز الحق قبل الاستخدام
CaCl2 2لا تخزن لأكثر من يوم واحد مع الجلوكوز
MgSO4 2~ 310 mOsm/L (تعديل مع السكروز)
الجناح2بو4 125
حبيس25
الجلوكوز10
الحل المتوازن للملح من هانكسحبسسيغما (كتالوج رقم H9394).
المحلول الملحي المخزن بالفوسفات من دولبيكوDPBSجيبكو (الفهرس رقم 14287-080)
الثقافة العضوية المتوسطةالمتوسطة OTCالحرارة المعطلة المصل الحصان2034 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2، pH 7.4 ، تحت حاله الذبح
Mem79 في المائة~ 320 mOsm/L
L-الجلوتامين1
الانسولين0.01 ملغ/مل
كلوريد14.5
MgSO4 2
CaCl2 1.44
حمض الاسكوربيك0.00125 في المائة
د-الجلوكوز13

الجدول 1: تكوين الحل.

  1. في يوم الاعداد ، أضافه الجلوكوز إلى ACSF ، وضعه علي الجليد وبدء محتدما مع 95 ٪ س2/5 ٪ CO2 لمده 30 دقيقه علي الأقل ليؤدي إلى الحموضة من 7.4.
  2. تشريح وتشريح
    1. التضحية بالماوس (BalbC ، كلا الجنسين) في أيام ما بعد الولادة من 6 إلى 8 من قبل قطع الراس السريع ووضع رئيس في صحن بيتري الزجاج الذي يحتوي علي ACSF الجليد الباردة.
    2. فضح الجمجمة عن طريق قطع الجلد من الخلف حتى الطرف الخلفي من عظم الأنف. ثم ، بعناية قطع الجمجمة من ماغنوم الفرن باستخدام مقص الجراحية وفضح الدماغ.
      ملاحظه: التحقق من ان الاجراء متوافق مع المبادئ التوجيهية للمؤسسة.
    3. أزاله الدماغ ووضعه علي غشاء فلتر في طبق بيتري الجليد الباردة مليئه ACSF.
    4. افصل نصفي الكره وقم بقطع التطفل بزاوية 45 درجه. إصلاح نصف الكره الارضيه في مرحله الانسجه الذبذبات مع الغراء الفائق. نقل كتله الانسجه علي الفور إلى حمام الذبذبات التي تحتوي علي الجليد البارد ACSF (فقاعات مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2). وأخيرا محاذاة الانسجه. الحفاظ علي نصف الكره الثاني في الجليد الباردة ACSF حتى تقطيع.
    5. ضبط الذبذبات لقطع شرائح في 250-400 μm. التشريح في 250 μm سوف تسفر عن حوالي 12 شرائح لكل الحيوانية (400 μm: ~ 7 شرائح).
    6. بعد قطع الشريحة (الشكل 1ا) ، حدد تشكيل هيبوكامبال استنادا إلى مظهره المورفولوجية النموذجي (الشكل 1) وعزله باستخدام ابر الحقن الناقص (23 مقياس ، 1 ") ، والحفاظ علي جزء من القشرة الدماغية المتاخمة لحصين.
      ملاحظه: الحفاظ علي النيوكورتكس في حين ان الخياطة يساعد علي الحفاظ علي سلامه الحصين. ومع ذلك ، يمكن عزل الحصين ومثقف دون قشره إذا لزم الأمر.
    7. ضع الشريحة علي شبكه في تحسن ، ACSF (34 درجه مئوية ، فقاعات مع 5 ٪ CO2/95 ٪ O2) حتى يتم جمع جميع الشرائح.
    8. انقل الشرائح إلى خزانه التدفق الرقائقي للاستمرار تحت ظروف معقمه.

figure-protocol-1
الشكل 1: صور الإرسال التمثيلي لتحضيرات شريحة المخ الحاده والعضوية. مقارنه شريحة المخ الطفيلية المعزولة بشكل حاد (ا) وشريحة الدماغ المجسم الذي يتم الاحتفاظبهفي الثقافة لمده 12 يوما (ب) باستخدام المجهر الضوئي الواسع النطاق. المديرية الروسية = الجيروسكوبات المسننة ؛ CA1/3 = CA1/CA3-منطقه الحصين. E-CTX = القشرة Entorhinal; CTX = (نيو-) القشرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

2. خياطه الشرائح

  1. انقل الشرائح برفق من ACSF إلى واحده من اطباق بيتري التي تم تسخينها مسبقا والمليءه بمحلول الملح المعقم من هانك باستخدام ماصه الزجاج المعقم المقلوب.
    ملاحظه: ويتحقق تعقيم الانسجه عن طريق التخفيف (الخطوة 3.2). نقل اقل قدر ممكن من ACSF إلى طبق بيتري.
  2. تغيير الماصة ونقل الشرائح إلى طبق بيتري الثاني. كرر العملية 5 مرات بشكل عام. نقل القليل من HBSS ممكن إلى اطباق بيتري التالية.
  3. ضع شريحة واحده برفق في كل مره في الأعلى من ادراج الثقافة. كرر العملية لكل شريحة. تجنب الاضطرابات في الماصة وانتظر حتى تقطع الشريحة إلى طرف ماصه باستور. يمكن للمرء ان يضع ما يصل إلى 4 شرائح علي غشاء واحد.
  4. بعناية أزاله اي الزائدة الحل هانك من اعلي الادراج باستخدام تلميح غرامه.
  5. الحفاظ علي الثقافات (الشكل 2) في حاضنه في الواجهة بين الغاز (كربوجين ، 95 ٪ O2 /5 ٪ CO2) والسائل عند 37 درجه مئوية حتى يوم التجربة. استبدل الوسيط كل 2-3 يوم.

figure-protocol-2
الشكل 2: مبدا التصوير ATP القائم علي التاكل في شرائح الدماغ العضوية المثقفة باستخدام مستشعر الترميز الوراثي ATeam 1.03يمك. التمثيل التخطيطي للبروتوكول المقدم في هذا العمل. لفتره وجيزة ، يتم توصيل شرائح التنميط العضوي ، مثقف لأيام 1-3 ، مع ناقل الفيروسية adeno المرتبطة التي تحتوي علي اما ، hGFAP الخاصة astrocyte-أو العصبية الخاصة hSyn-المروج وتسلسل للتعبير عن ATeam 1.03يمك. ويتم تطبيق الارصفه المخففة لهذه النواقل (1:2-1:4) مباشره علي اعلي شريحة ، والتي يتم الاحتفاظ بها تحت ظروف الذبح لمده 6 أيام علي الأقل. ويمكن بعد ذلك تصور التغييرات في مستويات ATP داخل الخلايا في الخلية التعبير عن الاستشعار عن طريق مثيره في 434 nm والحصول علي الانبعاثات مضان في وقت واحد في 527 (متقبل) و 475 (المانحة) نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

3. التعبير عن أجهزه الاستشعار ATP مع ناقلات الفيروسية المرتبطة عدينو (الشكل 2)

ملاحظه: تاكد من تلبيه جميع متطلبات التعامل مع الكائنات المحورة وراثيا!

  1. للتعامل مع ناقلات الفيروسية ، قسامه adeno-المرتبطة ناقلات الفيروسية (AAV2/5) في 1-2 μl لتجنب التجميد المتكررة وذوبان الجليد. تخزين الارصفه في-80 درجه مئوية.
  2. وضع قارورة تحتوي علي 10 ٪ التبييض علي مقاعد البدلاء معقمه للتخلص من جميع المواد المتبقية المستخدمة التي كانت علي اتصال مع ناقل.
  3. للحصول علي المحول ، أعد تخفيف 1 μL من المتجه مع 2-3 μL من DPBS. الأسهم الحلول عاده ما يحمل عيار المادية في حجم 1012 الجينوم الفيروسية لكل مل (vg/مل).
  4. انقل الادراج التي تحتوي علي شريحة مثقفه في غطاء المحرك المعقم.
  5. دون لمس الانسجه ، وتطبيق 0.5 μL من المتجه المخفف مباشره إلى الأعلى من كل شريحة.
    ملاحظه: يتم الحصول علي تعبير أفضل في طبقات أعمق من الانسجه عن طريق توصيل شرائح مثقف في 1-3 أيام في المختبر (DIV). قد يؤدي توصيل الثقافات القديمة إلى التعبير السائد عن الخلايا في الندبة الددميه المحيطة أو التعبير المنخفض في العصبونات ، علي التوالي.
  6. وأخيرا ، وضع الشرائح مره أخرى في الحاضنة والحفاظ عليها لمده 6 أيام أخرى علي الأقل. لا تقم بتغيير الوسيطة في يوم التوصيل.

4. أزاله الندبة جليال (الشكل 3)

  1. فقط قبل البدء في تجربه ، قم بنقل ادراج تحتوي علي شرائح مستزرعه في غطاء المحرك المعقم ووضعه في طبق 30 ملم ، يحتوي علي 1 مل من متوسط OCT أو الذاكرة.
  2. ضع الطبق تحت المنظار الفراغي وركز علي سطح الشريحة.
  3. استخدم اثنين من ابر الحقن المعقمة (23 غ ، 1 ") لجعل اليمين عبر قطع قصيرة علي الحواف الضيقة لشريحة مختاره (الشكل 3). سيؤدي هذا الاجراء إلى الإفراج عن التوتر في السطح الذي أوجدته الندبة الداليه التي تسبب لها التراجع ، مما يعرض الطبقات الاساسيه (انظر الشكل 5).
    ملاحظه: تتكون الطبقة النسيجية الاولي (الندبة الدصيه) أساسا من قبل استروسيتس التفاعلية. في التصوير الميداني الواسع ، ستؤدي طبقه الانسجه الكثيفة هذه إلى تشتت إضافي للضوء ، مما يؤدي إلى صور ضبابية. التالي فان أزاله الندبة مفيده للحصول علي رؤية أفضل للطبقات الأعمق ، التي تحتوي علي النسيج العضوي السليم. التالي ، كن حذرا لأداء هذا قطع حصرا علي حافه وفي الطبقة العليا من اعداد شريحة فقط وليس للاضرار الانسجه تحت. لم نلاحظ الاختلافات بين البيانات التي تم الحصول عليها في OTCs مع ندبه انحدر مع تلك التي من OTCs خاليه من الندبات (البيانات لا تظهر).
  4. قم بازاله الشريحة المعدة من الادراج. لهذه الغاية ، استخدم مشرط معقم والمكوس من خلال اجراء تخفيضات موازيه علي التوالي إلى الغشاء ، وتشكيل مربع أو مثلث مع شريحة في المركز ، في حين عقد حواف الغشاء مع ملاقط. إذا كان الادراج يستضيف شرائح اضافيه ، نقلها مره أخرى إلى لوحه الأصلي والي الحاضنة. فان التوتر السطحي من المتوسطة منع تسربها علي سطح الغشاء.

figure-protocol-3
الشكل 3: توضيح تخطيطي للازاله الميكانيكية للندبة الداليه. ويظهر هذا الرقم ثقافة شريحة هيبوكامبال التي تغطيها ندبه الدالي (الأرجواني الاهليلجي). في وقت واحد القص نصائح اثنين من الابر حقنه في أصغر قطب من الثقافة وعلي حافه الندبة الدالي (خط متقطع الأزرق) ، فان ندبه الوجه جانبا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

5. القائم علي التاكل ATP التصوير (الشكل 4)

  1. قبل التجربة ، واعداد E-ACSF وفقاعة مع 95 ٪ O2/5 ٪ CO2 لمده 30 دقيقه علي الأقل للحصول علي درجه الحموضة من 7.4. التبديل علي مصدر ضوء الفلورسنت (مصباح زينون) من أحاديه الأحادي (الشكل 4). بدء الانصهار فقط قبل إخراج شريحة من الحاضنة.
    ملاحظه: الحفاظ علي المالحة فقاعات مع 95 ٪ O2 و 5 ٪ CO2 خلال التجربة بأكملها.
  2. انقل الشريحة إلى غرفه تجريبية باستمرار باستخدام مضخة التمعجيه (الشكل 4) مع الطراز الكتروني الخاص بالكربوجين الطازج. ثم قم بإصلاح الشريحة باستخدام شبكه. وضع الغرفة علي مرحله المجهر وربط النظام ترويه. ويوصي الغاز واقيه من الأنابيب المختبرية لperfusion.
    ملاحظه: يمكن اجراء التجارب في درجه حرارة الغرفة أو بالقرب من درجه الحرارة الفسيولوجية ، اعتمادا علي التصميم التجريبي. تحقق من استقرار وموثوقيه تدفق التروية لتجنب التغيرات في التركيز الناجم عن حركه الانسجه و/أو التغيرات في الإجهاد القص. سرعات ترويه القياسية لعمل شريحة ، وتستخدم من قبلنا والعديد من المختبرات الأخرى ، هي 1.5-2.5 mL/min.

figure-protocol-4
الشكل 4: تكوين اعداد التصوير الحنق. (ا) توضيح تخطيطي للمكونات المختلفة وترتيبها المكاني المطلوب لاعداد التصوير الخاص بالتاكل. ويتكون الترتيب من أحاديه الأحادي مع مصباح زينون كمصدر للضوء ، وتستقيم المجهر مرحله ثابته (1) ، ونظام صوره الخائن (2) ، كاميرا CCD أو CMOS الرقمية لتسجيل الفاصل الزمني (3) ، وحمام تجريبية تكييفها لمستقره ترويه ثابت (4). يتم تحقيق الحمام بواسطة مضخة التمعجيه مع معدل تدفق قابل للضبط. (ب) صوره لمساحة العمل التجريبية. يتم تركيب الاعداد التصوير الحنق علي طاوله الاهتزاز التي تحمل المرحلة x/y-الانتقالية ، التي جزءا لا يتجزا من حمام التجريبية. الأرقام: انظر (ا). (ج) العرض التخطيطي للمسار الخفيف من الاحاديه إلى الكاميرا الرقمية. وأشار هو موقف المرشحات المختلفة والمراه العاكسة. الأرقام: انظر (ا). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

  1. جلب شريحة مثقف في التركيز باستخدام ضوء الإرسال. تحديد المنطقة التي تجري فيها التجارب (مثال: منطقه CA1 من الحصين). قبل بدء تجارب التصوير ، انتظر 15 دقيقه علي الأقل للسماح للشرائح بالتكيف مع الظروف المالحة. لتكوين الاعداد التجريبي ، راجع الشكل 4.
  2. قم بالتبديل علي الكاميرا وبرنامج التصوير. ثم حدد مكعب التصفية المناسب.
  3. تثير بروتين الفلورسنت المتبرع (eCFP) في 435/17 nm (~ 435 nm). تعيين وقت التعرض بين 40 إلى 90 مللي ثانيه.
    ملاحظه: قد يؤدي التعرض القوي للشرائح إلى ضوء الفلورسنت إلى تاثيرات السمية الضوئية.
  4. الاثاره في 435 nm النتائج في الانبعاثات في كل من 475 nm (eCFP; المانحة) و 527 nm (فينوس; متقبل). تقسيم الانبعاثات مضان في 500 nm مع الخائن صوره البث وتوظيف مرشحات تمرير الفرقة في 483/32 و 542/27 لمزيد من عزل المانحة والفلورية متقبل. وقد يؤدي التعبير القوي إلى تشبع الكاشفات. في هذه الحالة ، قد تستخدم فلتر كثافة محايد لتقليل شده الاثاره.
  5. حدد منطقه الاهتمام (ROI) التي يبدو انها خاليه من الفلورية الخلوية لطرح الخلفية. ثم ، إنشاء ROIs ترسيم الهيئات الخلية.
  6. تعيين تكرار الحصول علي الصور ووقت التسجيل الكلي. لمده طويلة (> 30 دقيقه) التجارب ، ويوصي تردد الاستحواذ من 0.2-0.5 هرتز لمنع السمية الضوئية.
  7. بدء التسجيل. فمن المستحسن لتسجيل ما لا يقل عن 5 دقيقه تحت شروط خط الأساس لضمان استقرار الاعداد.
    ملاحظه: اضبط تركيز الخلية اثناء التسجيل إذا لزم الأمر.
  8. للحث علي التغييرات في ATP داخل الخلايا, نقل أنبوب ترويه من acsf القياسية إلى المالحة التي تحتوي علي مثبطات الأيض (مثل CIS, انظر الجدول 1 وأدناه). بدلا من ذلك ، استخدام محلول ملحي مع تركيز البوتاسيوم مرتفعه لتقليد الإفراج عن البوتاسيوم من الخلايا العصبية النشطة.
    ملاحظه: التطبيق عن طريق الاستحمام ترويه هو عمليه بطيئه نسبيا ، والتي تعمل علي الصعيد العالمي علي الاعداد بأكمله. تحيط علما الوقت الذي الحل الجديد بدات فعلا لدخول حمام التجريبية. اعتمادا علي المسافة بين الغرفة وخزان المحلول الملحي ، وكذلك علي سرعه التروية ، يجب النظر في وقت التاخير.

6. وثائق عاليه الدقة من الخلوية ATeam الفلورية

  1. مباشره بعد التسجيلات ، نقل غرفه التسجيل التي تحتوي علي الثقافة شريحة إلى مجهر المسح الضوئي بالليزر البؤري.
    ملاحظه: خذي عناية خاصه وبسبب التصوير الضوئي المحتمل ، قم بتنفيذ هذه الخطوة فقط بعد التجارب. ولأغراض التوثيق ، يجوز للمرء ان يتبادل البريد مع الشركة الكترونيه للضمان الخاص. ولذلك ، لا يلزم بالضرورة وجود نظام ترويه.
  2. خذ المكدسات z في اعلي دقه z ممكن في التكوين البصري المعطي.
  3. تطبيق خوارزميه تفكيك لزيادة دقه الصورة.

النتائج

ناقلات AAV هي أداه موثوق بها للتعبير بشكل انتقائي عن الجينات الاجنبيه في الخلايا داخل الانسجه الحية16. التطبيق المباشر لطائرات بالطائرات التي تحتوي علي الكاسيت التسلسلي ل ATeam 1.03يمك ومروج محدد ينتج عنه تعبير عالي عن المستشعر في نوع الخلية المختارة. في DIV 14 (~ 10 أيام بعد محول) ، والخلايا العصبية التعبير عن ATeam تحت المروج المشبك الإنسان وجدت في كثافة عاليه في النيوكورتكس من شرائح الانسجه المثقفة في أعماق تصل إلى 50 ميكرومتر تحت سطح الشريحة (الشكل 5ا). ويمكن تحقيق نتائج مماثله في الحصين (الشكل 5ب).

figure-results-1
الشكل 5: تصور الخلايا العصبية التي تعبر عن ATeam 1.03يمك في شرائح الدماغ المجسمة العضوية المثقفة. الصور علي اليسار تتوافق مع توقعات التركيز الموسعة من 43 المقاطع البصرية (1.05 μm كل) من الانسجه القشرية (ا) و (ب) من 70 المقاطع البصرية (0.6 μm كل) من الانسجه هيبوكامبال. تمثل الصور التي علي اليمين عرض وحده التخزين لنفس الإسقاط. الخلايا مرمزه وفقا لعمقها بالنسبة لسطح الشريحة كما هو مبين بمقياس اللون علي اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

لقياس مستويات ATP في astrocytes ، يتم التعبير عن ATeam 1.03يمك تحت سيطرة المروج البشري الحمضي الليفي (gfap). وهذا يؤدي إلى الكفاءة في توصيل الخلايا في كل من نيوكورتكس والحصين من شرائح الانسجه المثقفة (الشكل 6). وعلي وجه الخصوص ، يمكن تمييز النمطين الظاهريين المورفولوجية المختلفة ، اعتمادا علي عمق نسبه إلى سطح الاستعدادات شريحة. في الطبقة السطحية الاولي ، تتميز الخلايا بالعمليات الاوليه السميكة التي يتم ترتيبها في الغالب بالتوازي مع السطح. هذه الخلايا تظهر المجالات متداخلة بشده ، وخلق العمل المكثف من استروسيتيس علي ما يبدو رد الفعل (الشكل 6). في طبقات أعمق (30-60 μm من السطح) ، والخلايا الفلكية المحولة تظهر العمليات الخلوية الجميلة التي تشكل مجالات كرويه إلى حد كبير وشكلها يشبه ان من استروسيتيس في الموقع كما ذكر في وقت سابق19،20،21 (الشكل 6). للحصول علي أفضل محوله من الطبقة الفلكية الأعمق ، فضلا عن تحسين الوصول البصري إلى هذه الطبقات الأعمق ، يمكن أزاله الانسجه الندبة الدصيه كما هو موضح في الخطوة 4.

figure-results-2
الشكل 6: تصور الأسطرلابات التي تعبر عن ATeam 1.03يمك في شرائح الدماغ المجسمة العضوية المستزرعة. الصورة علي اليسار يتوافق مع الإسقاط التركيز الموسعة من 191 المقاطع البصرية (0.45 μm لكل منهما). ولأغراض التوضيح ، استبعدت الندبة الدصيه من إسقاط الأسطرلاب. وتمثل الصور التي علي اليمين عرض الحجم لنفس الإسقاط قبل وبعد أزاله الندبة الددالي. الخلايا مرمزه بألوان وفقا لعمقها بالنسبة لسطح الشريحة كما هو مبين بمقاييس اللون علي اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

يسمح التعبير الناجح ل ATeam 1.03يمك بالقياس الديناميكي للتغيرات في مستويات ATP في الخلايا العصبية أو astrocytes ، اعتمادا علي المروج المستخدم (انظر أعلاه). أجريت التجارب في حمام تجريبي باستمرار perfused مع E-ACSF (فقاعات مع 95 ٪ O2/5 ٪ CO2). في الشرائح العضوية التي تعبر عن ATeam 1.03يمك في الخلايا العصبية الهيبوكامباله ، تم اختيار مناطق الاهتمام (rois) قبل البدء في التسجيل ، والتي تمثل somata من الخلايا الهرمية (الشكل 7ا). وعلاوة علي ذلك ، اختيرت منطقه لطرح المعلومات الاساسيه (الشكل 7(ا)). ثم تم جمع انبعاثات الزهرة وكذلك الفلورية eCFP لكل من هذه ROIs بشكل منفصل ووصفها بأنها مستوي الانبعاثات مضان مع مرور الوقت (الشكل 7ب). بعد تسجيل الفلوري تحت ظروف السيطرة لعده دقائق لضمان خط أساس مستقر ، وتحولت الأيض الخلوية من خلال تعريض اعداد شريحة لمحلول ملحي خاليه من الجلوكوز ، والتي تم أضافه 5 مم الصوديوم أزيد (نان3) لمده دقيقه واحده (الشكل 7ب). هذا التلاعب الناجم عن التغييرات المعاكسة في كثافة الانبعاثات من زوج الحنق (الشكل 7ب، لوحات اليسار) ، مع انخفاض الزهرة (527 نانومتر) وزيادة ecfp (475 nm) الانبعاثات. حساب نسبه الحنق عن طريق تقسيم الانبعاثات الفلورية فينوس من قبل eCFP (Fفينوس/Fecfp) أسفرت عن الإشارات التي تعكس التغيرات النسبية في مستويات ATP داخل الخلايا ، ما يسمي "نسبه الحنق Ateam" (الشكل 7ب، اللوحة اليمني). في جميع الخلايا العصبية المسجلة (ن = 70 خليه في N = 5 شرائح) ، نان3 تسبب انخفاض عكسها في نسبه ATEAM الحنق ، مما يدل علي انخفاض عكسها في مستويات ATP داخل الخلايا عند تثبيط الأيض الخلوية.

figure-results-3
الشكل 7: بيان الفترة الزمنيه الفاصلة بين الصور والتصوير. (ا) اعلي اليسار: صوره فلورية واسعه النطاق للطبقة الهرمية والطبقة الشعاعية لمنطقه CA1 من شريحة هيبوكامباله من الطراز العضوي المثقف تعبر عن ateam 1.03يمك في الخلايا العصبية. اعلي اليمين: عرض الموسع للقسم محاصر كما هو مبين علي اليسار. خطوط بيضاء تحدد مناطق الاهتمام (ROIs) 1-3 تمثل الأجسام الخلية من الخلايا العصبية CA1 هرمي المختارة للتحليل في (ب). BG يمثل العائد علي الاستثمار الذي تم اختياره لتصحيح الخلفية. أسفل: الصور الزائفة الملونة التي تمثل الانبعاثات فلوري من الزهرة (الأخضر) ، eCFP (الأرجواني) ونسبه فينوس/eCFP. (ب) تسجيل الفاصل الزمني في rois 1-3 ، الذي يمثل أجسام الخلايا العصبية (انظر A). اثار علي اليسار عرض تطبيع الانبعاثات فلوري من الزهرة (الأخضر) و eCFP (أرجواني). تظهر الآثار علي اليمين نسبه ATeam الحنق المقابلة. لاحظ ان ترويه مع 5 مم نان3 في غياب الجلوكوز خارج الخلية لمده 1 دقيقه (شريط رمادي) يدفع انخفاض عكسها في نسبه ateam الحنق ، مما يدل علي انخفاض في تركيز ATP داخل الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

لضمان استقرار الاعداد والاستشعار تحت ظروف التجربة علي المدى الطويل ، والشرائح التعبير عن ateam في الخلايا العصبية أو استروسيتيس باستمرار perfused مع acsf لفترات طويلة (> 50 دقيقه ؛ ن = 12 خليه لكل منهما ، n = 3 otcs من 3 أدمغه). في ظل هذه الظروف ، لم تتغير نسبه ATeam الحنق (الشكل 8). تعريض الاستعدادات إلى رابطه الدول المستقلة التي تحتوي علي مثبطات الأيض ("نقص التروية الكيميائية" ، انظر الجدول 1) ، في المقابل ، ادي مره أخرى في انخفاض المتوقع في نسبه ATEAM الحنق كما لوحظ أعلاه.

figure-results-4
الشكل 8: التجارب الاساسيه التي تستخدم ATeam. علي المدى الطويل ateam التاكل نسبه التصوير في 14 خلايا مختلفه تحت ظروف خط الأساس في الخلايا العصبية (اعلي) و استروسيتيس (أسفل). وقد أخذت البيانات في ظروف مماثله بوصفها بيانات تجريبية أخرى. وفي نهاية كل قياس ، تم استخلاص الاسكيميه الكيميائية عن طريق الانصهار مع رابطه الدول المستقلة كما هو مبين في السهم. ملاحظه: نسب الاساسيه ATeam التاكل مستقره مع مرور الوقت ضمن شروط الأساس. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

بعد ذلك ، حللنا ردود الخلايا العصبية و استروسيتيس التعبير عن ateam 1.03يمك إلى زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية. بعد إنشاء خط أساس مستقر ، كانت الخلايا العصبية perfused مع المالحة التي تم فيها زيادة تركيز البوتاسيوم من 3 إلى 8 ملم لمده 3 دقائق (الشكل 9ا). لم يؤدي هذا التلاعب ، ومع ذلك ، إلى تغيير قابل للكشف في نسبه ATeam الحنق (ن = 56 الخلايا في N = 5 شرائح). ولضمان استجابه جهاز الاستشعار للتغير في مستويات ATP ، تعرضت الشرائح مره أخرى لفتره مستديمه من نقص التروية الكيميائية التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال رابطه الدول المستقلة بالاجهزه الكترونيه. وادي نقص التروية الكيميائية إلى انخفاض سريع في نسبه ATeam الحنق إلى مستوي جديد ومستقر ، مما يشير إلى نضوب الاسمية ATP بعد 2-3 دقيقه (الشكل 9ا).

figure-results-5
الشكل 9: التجارب التمثيلية التي توضح التغيرات في مستويات ATP في الخلايا العصبية و astrocytes. (A،B): الصور علي اليسار المعرض ateam الفلورية من الخلايا العصبية والفلكية الموجودة في منطقه هيبوكامبال CA1 من شرائح الشكل العضوي. تمثل الآثار علي اليمين تسجيلات الفاصل الزمني لنسبه ATeam الحنق التي تم الحصول عليها من عائد الاستثمار المتمركز علي جسم خليه واحده. في كلا التجربتين ، تعرضت الشرائح أولا لزيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية لمده 3 دقائق (انظر الشريط) ، تليها التعرض النهائي لنقص التروية الكيميائية. لاحظ انه في حين ان الخلايا العصبية لا تستجيب لارتفاع البوتاسيوم خارج الخلية (A) ، فان استروسيتيس تتفاعل مع زيادة في ATP (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

تم تنفيذ نفس البروتوكول التجريبي مع شرائح ، والتي تم التعبير عنها ATeam 1.03يمك في astrocytes. علي النقيض من ما لوحظ في الخلايا العصبية ، ورد فعل استروسيتيس للزيادة في البوتاسيوم خارج الخلية من خلال زيادة عكسها في نسبه ateam الحنق ، مما يدل علي زيادة في مستويات ATP داخل الخلايا (ن = 70 الخلايا في n = 5 شرائح) (الشكل 9ب). وأسفر التعرض اللاحق لنقص التروية الكيميائية ، كما هو متوقع ، في انخفاض كبير في نسبه ATeam الحنق ، مما يدل علي استنفاد الاسمية ATP داخل الخلايا (الشكل 9ب).

المناقشة

هنا ، ونحن نظهر اجراء للتعبير الخلية من نوع محدد من ateam 1.03يمك، والقائم علي الحنق ، والمشفرة وراثيا النانويه14، لقياس التغيرات في مستويات ATP في استروسيتيس أو الخلايا العصبية في الثقافات شريحة النسيج العضوي من الدماغ الماوس15. في التسجيلات النموذجية ، ونحن نظهر ان زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية لا يؤدي إلى تغيير في تركيزات atp في الخلايا العصبية ، في حين ترتفع مستويات atp والنجميه استجابه لهذا التلاعب. وعلاوة علي ذلك ، تظهر نتائجنا انه عند تثبيط الأيض الخلوي ، فان نسبه التاكل من ATeam 1.03يمك تنخفض بسرعة في كل من أنواع الخلايا ، مما يشير إلى انخفاض سريع في ATP داخل الخلايا.

التعبير عن ATeam 1.03يمك في الثقافات شريحة الشكل العضوي يتطلب الحفاظ علي الانسجه في الثقافة في ظل ظروف خاضعه للرقابة لمده لا تقل عن 7-10 يوما. وبدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام ateam 1.03يمك لقياس ATP في شرائح انسجه المخ المعزولة بشكل حاد وفي الأعصاب البصرية للفئران13،15. ومع ذلك ، فان القياسات في الانسجه المعزولة بشكل حاد تستلزم توليد الكائنات المحورة وراثيا أو التطبيق المجسم لنواقل فيروسية في المخ ، بما في ذلك التجارب الحيوانية والبروتوكولات الصارمة لرعاية الماشية. وفي هذا الصدد ، تمثلالتعبيرات المتعلقة بشريحة الانسجه العضوية في النسيج العضوي ، البديل المفيد والقيم22،23. لسنوات عديده الآن ، والنسيج العضوي شريحة الثقافات بمثابه نظام نموذجي الثابتة لدراسة الخصائص العصبية ، والاتصال والتنمية24،25،26. انها ليست فقط الحفاظ علي الهندسة المعمارية الانسجه العامة والتصفيح (الشكل 1) ، ولكن أيضا استضافه الخصائص التفضيلية للثقافات الخلية مثل الوصول المتفوق والتحكم المباشر في الظروف التجريبية. كما تستخدم الثقافات شريحة النسيج العضوي بشكل روتيني للتعبير عن الجينات الاجنبيه باستخدام ناقلات الفيروسية27. تم الإبلاغ عن عده أنواع من النواقل الفيروسية لتوصيل الجينات المتحولة إلى انسجه المخ16,28. النواقل الفيروسية للحث علي التعبير العالي في الخلايا الددميه ، ولكن ليس هيبوكامبال العصبية16، ويمكن ان تولد التفاعل الدالي17. النواقل الفيروسية المرتبطة ب adeno كما هي مستخدمه هنا تظهر كبديل جيد15، وقد أظهرت فعاليتها أيضا في الجسم المجري29.

في حين تستخدم أساسا لدراسة خصائص الخلايا العصبية, وقد وضعت الدراسات الاخيره ان الانسجه النسيجية شريحة الثقافات يمكن أيضا ان تستخدم لتحليل astrocytes. وعاده ما تغطي شرائح مثقف من قبل طبقه من استروسيتيس رد الفعل19،30 (الشكل 5) ، ولكن استروسيتيس يحمل أكثر الأصلي ، والمورفولوجية غير التفاعلية والعمارة الخلوية في طبقات أعمق19،30 (الشكل 5). في هذه الدراسة ، ونحن وصف اجراء للازاله الميكانيكية للندبة الداليه الخارجي ، والذي يؤدي إلى الحصول علي أفضل التجريبية والبصرية من استروسيتيس الاصليه داخل طبقات النسيج العضوي السليم. وعلاوة علي ذلك ، فان ازالته يحسن فعاليه التعبير في طبقات أعمق من شرائح الشكل العضوي ؛ إذا لم تتم أزاله الندبة الطائرة ، فقد تميل المحولات بدون طيار إلى الاقتصار علي طبقات الخلايا السطحية.

هناك العديد من العوامل الميكانيكية الخارجية التي يجب مراعاتها عند اجراء التجارب في شرائح الانسجه. ويمكن للتغير في سرعه الاستحمام بالانصهار ان يحفز حركات الاعداد بأكمله و/أو يحفز التغييرات في التركيز ، مما يؤدي إلى تغييرات عابره اصطناعية لاشاره المستشعر. وعلاوة علي ذلك ، تم الإبلاغ عن كل من استروسيتيس والخلايا العصبية للرد علي تشوه الميكانيكية مثل التي فرضتها معدلات ترويه عاليه32،33. في ايدينا ، وذلك باستخدام مضخة التمعجيه موثوق بها ، مع الحفاظ علي كميات صغيره ومستقره من المحلول الملحي بين الانسجه والهدف (الغضروف المفصلي) نتائج في مستقره الحنق اشاره تحت ظروف خط الأساس في سرعه ترويه المستخدمة هنا (1.5-2.5 mL/min; الشكل 8).

في هذه الدراسة ، ونحن أيضا إثبات ان التصوير القائم علي الحنق مع ATeam 1.03يمك يمكن استخدامها لرصد مستويات ATP في الخلايا العصبية والفلكية. وسيله بديله أدخلت في وقت سابق لقياس ATP الخلوية هو ما يسمي luciferin-luciferin مقايسة34،35،36،37. ومع ذلك ، فان هذا النهج يقوم علي تصوير التلالؤ الإحيائي ولا يوفر سوي دقه منخفضه زمنيا ومكانيا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى ارتفاع مستويات الضجيج في الخلفية. طريقه أخرى تستخدم بشكل روتيني في السنوات الاخيره كان التصوير من التغيرات في تركيز المغنيسيوم داخل الخلايا باستخدام الأيونات الحساسة الفلوروكوفيري المغنيسيوم الأخضر38،39،40. ويتصل هذا النهج بالملاحظة التي مفادها ان استهلاك ATP يؤدي إلى الإفراج عن المغنيسيوم في العامل المشترك. التصوير مع المغنيسيوم الأخضر التالي يوفر فقط تقديرا ثانويا للتغيرات في مستويات ATP. وعلاوة علي ذلك ، المغنيسيوم الأخضر هو أيضا حساسة للتغيرات في الكالسيوم داخل الخلايا ، وإدخال صعوبة أخرى عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الطريقة.

التالي ، فان التطور الأخير لل نانوسينسيرس المرمزة وراثيا للتصويرالمباشر لنواتج الأيض الخلوية ، يمثل خطوه كبيره إلىالامام 11 ،12. تم إنشاء العديد من أجهزه الاستشعار المختلفة التي يمكن استخدامها لقياس ATP داخل الخلايا36،41،42،43. ومن بين تلك المؤشرات الفلورسنت الفلورية "كوين"41 وكذلك بيركيفالهر ، الذي يستشعر ATP: ADP نسبه42. في حين ان المسبار الأخير هو أداه قيمه لدراسة حاله الطاقة من الخلايا ، فانه يتطلب قياس متزامن للتغيرات فيال42الهيدروجيني.

ATeam هو نانوناناو العديد من المتغيرات الموجودة ، والتي-من بين أمور أخرى-تختلف في تقارب ملزمه ل ATP14. في المختبر, ATeam 1.03يمك يسلك كد من 1.2 mM في 37 °c, الذي هو علي مقربه من مستويات ATP الخلوية المحددة في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية, تتراوح بين المهاد والمخيخ34 إلى الحصين37,44,45. في قياسات كوفيت ، ادي خفض درجه الحرارة بنسبه 10 درجه مئوية إلى انخفاض كبير في التقارب الملزم من ateam 1.03يمك إلى ATP ، مما يوحي بأنه قد لا يكون مثاليا للتصوير الخلوي في درجه حرارة الغرفة14. لدينا دراسة سابقه15، ومع ذلك ، أظهرت ان السلوك والاستجابة من ateam 1.03يمك المعرب عنها في الخلايا العصبية و استروسيتيس للتلاعب مختلفه مماثله في الفسيولوجية القريبة ودرجه حرارة الغرفة ، مما يدل علي ان الاستشعار يسمح تحديد موثوق بها مستويات ATP داخل الخلايا في كلا الحالتين. الاضافه إلى ذلك ، تناولت تجاربنا السابقة حساسية الأس الهيدروجيني من ATeam 1.03يمك المعرب عنها داخل الخلايا15، والتي تبين انه غير حساس للتغيرات في الأس الهيدروجيني في الخلايا من قبل حوالي 0.1-0.2 وحدات الحموضة. إذا كان كد في نطاق منخفض مم هو مصدر قلق ، يمكن استخدام المتغيرات ateam البديل14، من بينها المتغيرات الحمراء تحولت من ATEAM ("الذهاب ateam")43.

تجاربنا باستخدام ateam 1.03يمك تثبت ان زيادة في تركيز البوتاسيوم خارج الخلية من قبل بضعة ملم فقط (من 3 إلى 8 ملم) يؤدي إلى زيادة عابره في نسبهاليمني 1.03 يمك في استروسيتيس في ثقافة شريحة الشكل العضوي. هذه الملاحظة تؤكد الدراسات السابقة15,46 ويشير بوضوح إلى ان استروسيتيس الاستجابة للإفراج عن البوتاسيوم من قبل الخلايا العصبية النشطة مع زيادة في إنتاج ATP, في الغالب علي الأرجح نتيجة لتحفيزna +/K +-atpase وna +/hco3- cotransporter, علي التوالي47,48. وعلي النقيض من ذلك ، لم تظهر الخلايا العصبية استجابه ، وهو ما يتماشى مع العمل السابق وكذلك15. كلا أنواع الخلايا ، ومع ذلك ، بسرعة وبقوة رد فعل لتثبيط تحلل الخلوية والتنفس الميتوكوندريا كما هو مبين قبل15. في ظل ظروف نقص التروية الكيميائية ، انخفضت نسب ATeam الحنق إلى مستوي مستقر جديد ، مما يدل علي استنزاف الاسمية ATP الخلوية. وتشير النتيجة الاخيره إلى ان كلا من الخلايا العصبية وكذلك استروسيتيس يحمل الاستهلاك ذات الصلة من ATP أيضا تحت ظروف ثابته الدولة دون تحفيز إضافي من قبل تنشيط متشابك أو تطبيق الناقلات العصبية. معا ، نستنتج ان التصوير القائم علي التاكل مع النانو المشفرة وراثيا ، من بينها ATeam 1.03يمك، سيوفر نهجا قيما لتوضيح العمليات الخلوية التي هي المسؤولة عن التغييرات في مستويات atp داخل الخلايا واستهلاك atp الخلوية في ظل ظروف مختلفه.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح. وتلقي المؤلفون دعما ماليا يتيح نشر الوصول المفتوح من قبل نيكون المجهر حلول, دوسلدورف, ألمانيا, التي تنتج الاداات المستخدمة في المادة الفيديو. ولم تشارك الشركة في تصميم التجارب المعروضة هنا ، ولا في تنفيذها ، ولا في معالجه البيانات ، ولا في كتابه المخطوطة.

شكر وتقدير

ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا كلوديا رودرغو وسيمون دورري علي المساعدة التقنية الخبيرة. نشكر الدكتور Niklas j. Gerkau والM.Sc جويل نيلسون للحصول علي المساعدة في اعداد الثقافات شريحة الشكل العضوي. ومولت البحوث التي أجريت في مختبر صاحبه البلاغ رابطه البحوث المانيه (DFG ؛ ل 2795: Ro 2327/13-1 و SPP 1757: Ro 2327/8-2 إلى CRR; و SPP 1757: الشباب الناشئة التمويل البدء إلى RL).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-ديوكسي جلوكوزألفا إيسارL07338الجلوكوز غير القابلة للتمثيل
الغذائي 36-IMA-410-019 ليزر الأرجونميليس جريوت488 نانومتر الطول الموجي الأرجون
حمض الأسكوربيككارل روث3525.1مرشحات تمرير نطاق فيتامين سي المضادة للأكسدة
483/32AHF Analyzentechnik AGSplitter مرشحات تمرير نطاق مرشح الترشيح المتوافق مع الترشيح
542/27AHF Analyzentechnik AGالفاصل متوافق مع مرشح الترشيح
Beamsplitter T 455 LPAHF Analyzentechnik AGمرآة ثنائية اللون الإثارة
Beamsplitter T 505 LPXRAHF Analyzentechnik AGالفاصل ثنائي اللون
الليزر متحد البؤر مجهر C1حلولنيكون نظام مجهر متحد البؤر المعياري C1
معالجة البيانات Origin Pro 9.0.0 (64 بت)مؤسسةبرنامج الرسوم البيانية وتحليل البيانات
العلمي D-glucose monohydrateCaelo2580-1kg
DPBSGIBCO / Life14190250Dulbecco المجهر الملحي المخزن بالفوسفات
Eclipse E 600FN منحلول
نيكون Eclipse FN1 في وضع مستقيم مجهرنيكون حلول
غرفة تجريبيةمخصصةبناء غرفة التروية لتصوير الخلايا الحية
EZ-C1 الفضي الإصدار 3.91مجهربرنامج التصوير للمجهر متحد البؤر
محلول الملح المتوازن من هانكسSigma-AldrichH9394مع الفينول الأحمر لمراقبة الأس الهيدروجيني
HERAcell 150Thermo ScientificCO2< / sub> HERAcell & reg; 150 مع روتين إزالة التلوث
HERAsafe KS / KSPخزانة السلامة العلمية
مصل الحصانGIBCO / Life26050088تعطيل الحرارة
Huygens ProfessionalSVI ImagingDeconvolution
Software Image J 1.52iWayne Rasban المعهد الوطني للصحةبرامج معالجة الصور المتاحة في المجال العام
الأنسولينSigma-AldrichI6634الأنسولين من البنكرياس
IP سيري مضخة التمعجIsmatecعالية الدقة متعددة القنوات
مضخة تخطيط البرمجيات, Illustrator CS6AdobeVector محرر الرسومات
L-glutamineGIBCO / Life25030024
ميكروم HM 650 فولتميكروتوم الاهتزاز العلميالحراري. أوقفت شركة Thermo Scientific إنتاج الجهاز في هذه الأثناء. أي قطاعة أخرى أو مفرمة مناديل قابلة لتقطيع الأنسجة الحية جيدة أيضا.
مرحلة المجهربناء
Microsoft Excel 16برنامج جداول بيانات Microsoft
إدراج ثقافة MillicellMerck MilliporePICM0RG50PTFE المجفف بالماء ، حجم المسام 0.4 & m
الحد الأدنى من النسر المتوسطالأساسي Sigma-AldrichM7278وسائط زراعة الخلايا الاصطناعية
أحادي اللون متعدد الألوان VThermo Scientific / FEIأحادي اللون التبديل
للغاية NaN3< / sub> (أزيد الصوديوم)سيجما ألدريتشS-8032مثبط الميتوكوندريا (مثبط وريدي معقد). تنبيه: أزيد سام. احرص على عدم ابتلاعه أو استنشاقه عن طريق الخطأ ، ومنع الهروب من خلال الجلد.
نيكون فلور 40x / 0.80 واط DIC M & infin ؛ / 0 WD 2.0حلول مجهرمغمر المياه المجهر الهدف
NIS 4.50 متقدمة أبحاثنيكون حلولبرامج التصوير. نسخة مطورة لتصوير FRET
ORCA-Flash4.0Hamamatsu Photonicsكاميرا CMOS الرقمية
أنابيب الترويةPro Liquid GmbHTygon ، 1.52 × 322 مم (الوزن: 0.85)
Photoshop CS 6 الإصدار 13.0برنامج معالجةالصور
الصوديوم L-lactateSigma-Aldrich71718-10G
ssAAV-2 / 2- hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)ETH Zü غنيv244ناقل AAV أحادي الشريطة يحفز التعبير عن ATeam1.03YEMK< / sup> تحت سيطرة جزء المحفز البشري المشبك 1 hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)ETH Zü غنيv307ناقل AAV أحادي الشريطة يحفز التعبير عن ATeam1.03YEMK< / sup> تحت سيطرة جزء محفز البروتين الحمضي الليفي الدبقي البشري ABC1D.
WVIEW الجوزاء النظام البصريHamamatsu Photonicsانبعاث صورة الفاصل
تناظرية مجهر مجهر OriginLab المؤسسة Dulbecco مجهر مستقيم ميكروسكوب المجهر حلول نيكون حاضنة الحرارية البقري مخصص لمعالجة البيانات الأساسية السريع نيكون عناصر المجهر Adobe

المراجع

  1. Sweadner, K. J. Isozymes of the Na+/K+-ATPase. Biochimica et Biophysica Acta. 988, 185-220 (1989).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131, 1047-1058 (2007).
  3. Cotter, K., Stransky, L., McGuire, C., Forgac, M. Recent Insights into the Structure, Regulation, and Function of the V-ATPases. Trends in Biochemical Sciences. 40, 611-622 (2015).
  4. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75, 762-777 (2012).
  5. Brown, A. M., Ransom, B. R. Astrocyte glycogen and brain energy metabolism. Glia. 55, 1263-1271 (2007).
  6. Hertz, L., et al. Roles of astrocytic Na+,K+-ATPase and glycogenolysis for K+ homeostasis in mammalian brain. Journal of Neuroscience Research. 93, 1019-1030 (2015).
  7. Allaman, I., Belanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: For better and for worse. Trends in Neurosciences. 34, 76-87 (2011).
  8. Barros, L. F., Deitmer, J. W. Glucose and lactate supply to the synapse. Brain Research Reviews. 63, 149-159 (2010).
  9. Diaz-Garcia, C. M., et al. Neuronal Stimulation Triggers Neuronal Glycolysis and Not Lactate Uptake. Cell Metabolism. 26, 361-374 (2017).
  10. Diaz-Garcia, C. M., et al. Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor. Journal of Neuroscience Research. 97, 946-960 (2019).
  11. Barros, L. F., et al. Current technical approaches to brain energy metabolism. Glia. 66, 1138-1159 (2018).
  12. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Optogenetic reporters: Fluorescent protein-based genetically encoded indicators of signaling and metabolism in the brain. Progress in Brain Research. 196, 235-263 (2012).
  13. Trevisiol, A., et al. Monitoring ATP dynamics in electrically active white matter tracts. eLife. 6, e24241(2017).
  14. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15651-15656 (2009).
  15. Lerchundi, R., et al. FRET-based imaging of intracellular ATP in organotypic brain slices. Journal of Neuroscience Research. , 1-13 (2018).
  16. Ehrengruber, M. U., et al. Gene transfer into neurons from hippocampal slices: comparison of recombinant Semliki Forest Virus, adenovirus, adeno-associated virus, lentivirus, and measles virus. Molecular and Cellular Neurosciences. 17, 855-871 (2001).
  17. Woo, J., et al. Functional Characterization of Resting and Adenovirus-Induced Reactive Astrocytes in Three-Dimensional Culture. Experimental Neurobiology. 26, 158-167 (2017).
  18. Close, B., et al. Recommendations for euthanasia of experimental animals: Part 2. DGXT of the European Commission. Laboratory Animals. 31, 1-32 (1997).
  19. Benediktsson, A. M., Schachtele, S. J., Green, S. H., Dailey, M. E. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141, 41-53 (2005).
  20. Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9, 1623(2018).
  21. Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. The Journal of Comparative Neurology. 462, 241-251 (2003).
  22. Frotscher, M., Zafirov, S., Heimrich, B. Development of identified neuronal types and of specific synaptic connections in slice cultures of rat hippocampus. Progress in Neurobiology. 45, vii-xxviii (1995).
  23. Galimberti, I., et al. Long-term rearrangements of hippocampal mossy fiber terminal connectivity in the adult regulated by experience. Neuron. 50, 749-763 (2006).
  24. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37, 173-182 (1991).
  25. Forster, E., Zhao, S., Frotscher, M. Laminating the hippocampus. Nature Reviews. Neuroscience. 7, 259-267 (2006).
  26. Holopainen, I. E. Organotypic Hippocampal Slice Cultures: A Model System to Study Basic Cellular and Molecular Mechanisms of Neuronal Cell Death, Neuroprotection, and Synaptic Plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
  27. Teschemacher, A. G., et al. Targeting specific neuronal populations using adeno- and lentiviral vectors: applications for imaging and studies of cell function. Experimental Physiology. 90, 61-69 (2005).
  28. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  29. Mächler, P., et al. In Vivo Evidence for a Lactate Gradient from Astrocytes to Neurons. Cell Metabolism. 23, 94-102 (2016).
  30. Schreiner, A. E., Berlinger, E., Langer, J., Kafitz, K. W., Rose, C. R. Lesion-Induced Alterations in Astrocyte Glutamate Transporter Expression and Function in the Hippocampus. ISRN Neurology. 2013, 893605(2013).
  31. Haber, M., Zhou, L., Murai, K. K. Cooperative astrocyte and dendritic spine dynamics at hippocampal excitatory synapses. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 8881-8891 (2006).
  32. Neary, J. T., Kang, Y., Tran, M., Feld, J. Traumatic injury activates protein kinase B/Akt in cultured astrocytes: role of extracellular ATP and P2 purinergic receptors. Journal of Neurotrauma. 22, 491-500 (2005).
  33. Xia, J., et al. Neurons respond directly to mechanical deformation with pannexin-mediated ATP release and autostimulation of P2X7 receptors. The Journal of Physiology. 590, 2285-2304 (2012).
  34. Ainscow, E. K., Mirshamsi, S., Tang, T., Ashford, M. L., Rutter, G. A. Dynamic imaging of free cytosolic ATP concentration during fuel sensing by rat hypothalamic neurones: evidence for ATP-independent control of ATP-sensitive K+ channels. The Journal of Physiology. 544, 429-445 (2002).
  35. Arcuino, G., et al. Intercellular calcium signaling mediated by point-source burst release of ATP. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 9840-9845 (2002).
  36. Rajendran, M., Dane, E., Conley, J., Tantama, M. Imaging Adenosine Triphosphate (ATP). The Biological Bulletin. 231, 73-84 (2016).
  37. Rangaraju, V., Calloway, N., Ryan, T. A. Activity-driven local ATP synthesis is required for synaptic function. Cell. 156, 825-835 (2014).
  38. Chatton, J. Y., Pellerin, L., Magistretti, P. J. GABA uptake into astrocytes is not associated with significant metabolic cost: implications for brain imaging of inhibitory transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12456-12461 (2003).
  39. Magistretti, P. J., Chatton, J. Y. Relationship between L-glutamate-regulated intracellular Na+ dynamics and ATP hydrolysis in astrocytes. Journal of Neural Transmission (Vienna). 112, 77-85 (2005).
  40. Langer, J., et al. Rapid sodium signaling couples glutamate uptake to breakdown of ATP in perivascular astrocyte endfeet. Glia. 65, 293-308 (2017).
  41. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522(2014).
  42. Tantama, M., Martinez-Francois, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nature Communications. 4, 2550(2013).
  43. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ Regulation of Mitochondrial ATP Synthesis Visualized at the Single Cell Level. ACS Chemical Biology. 6, 709-715 (2011).
  44. Mollajew, R., Toloe, J., Mironov, S. L. Single KATP channel opening in response to stimulation of AMPA/kainate receptors is mediated by Na+ accumulation and submembrane ATP and ADP changes. The Journal of Physiology. 591, 2593-2609 (2013).
  45. Pathak, D., et al. The Role of Mitochondrially Derived ATP in Synaptic Vesicle Recycling. The Journal of Biological Chemistry. 290, 22325-22336 (2015).
  46. Karus, C., Mondragao, M. A., Ziemens, D., Rose, C. R. Astrocytes restrict discharge duration and neuronal sodium loads during recurrent network activity. Glia. 63, 936-957 (2015).
  47. Larsen, B. R., Stoica, A., MacAulay, N. Managing Brain Extracellular K+ during Neuronal Activity: The Physiological Role of the Na+/K+-ATPase Subunit Isoforms. Frontiers in Physiology. 7, 141(2016).
  48. Ruminot, I., et al. NBCe1 mediates the acute stimulation of astrocytic glycolysis by extracellular K+. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14264-14271 (2011).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ATP FRET AAV

مقالات ذات صلة