مقالة منهجية

مقارنة النقيلي واضحة خلية الخلايا الكلوية نموذج سرطان الخلايا المنشأة في الكلى الماوس وعلى غشاء Chorioallantoic الدجاج

8.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60314

⸱

فبراير 8, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Department of Molecular, Cell, and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, 3Department of Bioengineering, Hanyang University, 4Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6School of Life Sciences, Beijing Normal University, 7Department of Urology, West China Hospital, Sichuan University, 8Department of Urology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

سرطان الخلايا الكلوية النقيلي ة الخلايا هو مرض دون نموذج الحيوان شاملة للتحقيق الشامل قبل السريرية. يوضح هذا البروتوكول نموذجين جديدين للحيوانات لهذا المرض: نموذج الماوس المزروع تقويمًا للموضع ونموذج غشاء الدجاج chorioallantoic ، وكلاهما يوضح انبثاث الرئة يشبه الحالات السريرية.

الملخص

سرطان الخلايا الكلوية النقيلية (ccRCC) هو النوع الفرعي الأكثر شيوعًا لسرطان الكلى. ccRCC المترجمة لديها نتيجة جراحية مواتية. ومع ذلك ، فإن ثلث مرضى CCRCC تطوير الانبثاث إلى الرئة ، والتي ترتبط نتيجة سيئة للغاية للمرضى. لسوء الحظ ، لا يتوفر علاج لهذه المرحلة القاتلة ، لأن الآلية الجزيئية للانبثاث لا تزال غير معروفة. ومن المعروف منذ 25 عاما أن فقدان وظيفة فون هيبل لينداو (VHL) ورم الجين مثبط هو pathognomonic ccRCC. ومع ذلك، لم يتم إنشاء أي نموذج الماوس المعدلة وراثيا ذات الصلة سريريا من CCRCC. والغرض من هذا البروتوكول هو إدخال ومقارنة نموذجين للحيوانات المنشأة حديثا لCCRCC النقيلي. الأول هو زرع الكلى في نموذج الماوس. في مختبرنا، تم استخدام نظام تحرير الجينات CRISPR لضرب جين VHL في العديد من خطوط الخلايا RCC. زرع تقويم العظام من مجموعات ccRCC غير متجانسة إلى كبسولة الكلى خلق نماذج CCRCC الرواية التي تطور نقائل الرئة قوية في الفئران الكفؤة المناعية. النموذج الثاني هو نظام غشاء الدجاج chorioallantoic (CAM). بالمقارنة مع نموذج الماوس ، وهذا النموذج هو المزيد من الوقت ، والعمل ، وفعالة من حيث التكلفة. كما دعم هذا النموذج تكوين الورم القوي والتلقيح. نظرًا لفترة الـ 10 أيام القصيرة لنمو الورم في CAM ، لم يلاحظ أي انبثاث ًا منحيث المناعة (IHC) في أنسجة الأجنة التي تم جمعها. ومع ذلك ، عندما تم تمديد نمو الورم لمدة أسبوعين في الدجاج المفقس ، لوحظت آفات ccRCC micrometastatic من قبل IHC في الرئتين. هذان النموذجان قبل السريريان الجديدان سيكونان مفيدين لمزيد من الدراسة للآلية الجزيئية وراء الانبثاث ، وكذلك لإنشاء xenografts الجديدة المشتقة من المريض (PDXs) نحو تطوير علاجات جديدة لCCRCC النقيلي.

المقدمة

سرطان الخلايا الكلوية (RCC) هو السرطان 7الأكثر شيوعا في الولايات المتحدة. سنويا، يقدر أن يتم تشخيص 74،000 الأميركيين حديثا، وهو ما يمثل أكثر من 14،000 حالة وفاة (مسح الخلية النسيجية الفرعية، أو CCRCC، هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا، وهو ما يمثل ما يقرب من 80٪ من حالات RCC. يتم علاج المرضى الذين يعانون من خبيثة موضعية مع استئصال الكلية ولديهم معدل بقاء مناسب لمدة 5 سنوات من 73٪1. ومع ذلك ، فإن 25٪ -30٪ من المرضى يصابون بثًا بعيدًا بالأعضاء الحيوية مثل الرئتين ، مما يؤدي إلى ضعف متوسط البقاء على قيد الحياة لمدة 13 شهرًا ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات فقط 11٪1،2،3. هناك حاجة إلى مزيد من الفهم للآلية النقيلية لتحسين النتيجة القاتلة لCCRCC النقيلي.

فقدان الجين مثبط الورم VHL هو آفة وراثية مميزة لوحظت في غالبية الحالات CCRCC الإنسان4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن آلية oncogenic الدقيقة لفقدان VHL في CCRCC غير معروفة. أيضا، حالة التعبير VHL ليست تنبؤية من النتيجة في ccRCC8. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من المحاولات العديدة في الكلى الظهارية المستهدفة VHL بالضربة القاضية ، فشل العلماء في توليد شذوذ كلوي يتجاوز الآفات الكيسية preneoplastic التي لوحظت في الفئران9، حتى عندما يقترن حذف مثبطات الورم الأخرى مثل PTEN و P5310. تدعم هذه النتائج فكرة أن فقدان VHL وحده غير كافٍ لتكوين الورم أو الانبثاث التلقائي اللاحق.

في الآونة الأخيرة ، أنشأ مختبرنا خط ًا خلية VHL خروجًا المغلوب جديدًا (VHL-KO) باستخدام CRISPR/Cas9 بوساطة حذف جين VHL في خط خلية Min VHL + ccRCC (RENCA ، أو VHL-WT)11،12. أظهرنا أن VHL-KO ليس فقط mesenchymal ، ولكن أيضا يعزز الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) من خلايا VHL -WT12. ومن المعروف EMT للعب دور مهم في عملية النقيلي13. كما أظهر عملنا أن انبثاث الرئة البعيدة لا يحدث إلا مع الزرع المشترك لخلايا VHL-KO وVHL-WT في الكلى ، مما يدعم آلية تعاونية للانبثاث. الأهم من ذلك، لدينا زرع تقويم العظام VHL-KO وVHL-WT نموذج يؤدي إلى نقائل الرئة قوية، تلخيص الحالات ccCcCC السريرية. هذا النموذج التلقائي ccRCC النقيلي يعوض عن عدم وجود نموذج الماوس النقيلي المعدلة وراثيا، وخاصة في تطوير الأدوية الجديدة المضادة للانبثاث. يوضح هذا البروتوكول زرع الكبسولة الكلوية لتجمعات الخلايا غير المتجانسة لخلايا RENCA المعدلة وراثياً.

نماذج كام الدجاج لها تاريخ طويل في مجال البحث عن تولد الأوعية وبيولوجيا الورم بسبب مزاياها العديدة ، كما هو ملخص في الجدول 111،15،16،17،18. باختصار ، فإن النافذة الزمنية لنمو الورم CAM قصيرة ، مما يسمح بحد أقصى 11 يومًا حتى يتم تدمير CAM عند تفقيس الدجاج16. على الرغم من وقت النمو القصير ، فإن إمدادات التغذية الغنية وحالة نقص المناعة لجنين الدجاج تمكن من تطعيم الورم بشكل فعال للغاية16،19،20،21. وأخيرا ، فإن تكلفة كل البويضة المخصبة هو ~ 1 دولار ، مقارنة مع أكثر من 100 دولار لفأر SCID. معا ، يمكن لنموذج كام بمثابة نموذج الحيوان البديلة القيمة في إنشاء PDXs جديدة في توفير كبير في الوقت والتكلفة بالمقارنة مع الماوس. في هذا البروتوكول، قمنا بتقييم ما إذا كان النموذج قادرًا على تلخيص بيولوجيا CCRCC النقيلية التي لوحظت في نموذج تقويم العظام للفأرة.

(SCID) الماوسكامملاحظه
تكلفه> 100 دولار لكل منهما~ 1 دولار لكل منهماقابلية البقاء تتراوح بين 50-75٪
الحاجة إلى السكن الحاجزنعملايقلل من التكلفة ويبسط المراقبة التسلسلية للأورام
الورم مرئية مباشرةلانعمالشكل 3أ
الوقت لتطعيم أول (RENCA)أسبوعان2-4 أيامالمرجع 14، 15
نقطة نهاية النمو (RENCA)3-6 أسابيع10 أيامالمرجع 14، 15
الانبثاث (RENCA) لوحظنعمنعم في الكتاكيتالشكل 3D
مقاطع متسلسلةنعمنعمالمرجع 16-18
المرور إلى الفئران (RENCA)نعمنعمهو، ج.، وآخرون قيد المراجعة (2019)
الحفاظ على تغايرية الورمنعمنعمهو، ج.، وآخرون قيد المراجعة (2019)

الجدول 1: مزايا وقيود نماذج الماوس وCAM. يقارن هذا الجدول بين النموذجين لمزاياها وقيودها من حيث الوقت المطلوب والتكلفة والعمالة ، فضلا عن علم الأحياء. نموذج CAM له مزايا في الكفاءة، ولكن لديه أيضا قيود فريدة خاصة به بسبب مورفولوجيا مختلفة بين الطيور والثدييات. لذلك ، من المهم التأكيد على أن النموذج يمكن أن يحتفظ ببيولوجيا xenografts.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) ، التي تم تعيينها كلجنة أبحاث الحيوانات التابعة لمستشار جامعة كاليفورنيا (ARC) (ARC 2002-049-53 و ARC 2017-102-01A). تم تحسين بروتوكول 2002-049-53 لزرع خلايا الورم CCRCC في كبسولة الكلى من الفئران عارية أو BALB / ج. لا تتطلب تجارب زرع الورم في بيض الدجاج المخصب قبل الفقس موافقة IACUC. لتمديد الوقت لإنشاء الانبثاث الرئة، ويسمح للأجنة مع ورم كام يفقس وتنمو لتصبح الدجاج. يغطي بروتوكول 2017-102-01A هذه التجارب على الحيوانات.

1. دراسات ورم تقويم العظام في الفئران

ملاحظة: يظهر الجدول الزمني لهذه التجربة في الشكل 1A. وقد تم تكييف هذه الإجراءات من المنشورات السابقة11،12.

  1. إعداد تعليق خلية واحدة للتطعيم
    1. فصل خلايا RENCA VHL-WT و VHL-KO من أطباق الثقافة باستخدام التربسين / EDTA.
    2. عد الخلايا مع مقياس الهيوسيد وإعادة تعليق في خليط مسبق التبريد 1:1 من PBS ومصفوفة خارج الخلية الحل بتركيز 1 × 105 خلايا / ميكرولتر.
      ملاحظة: استخدم نسبة 1:4 من خلايا VHL-WT:VHL-KO للغرسات غير المتجانسة وVHL-WT وحدها للغرسات المتجانسة.
    3. نقل الخلايا التي أعيد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل والحفاظ على الجليد حتى زرع.
  2. زرع إلى كبسولة كلوية
    1. التخدير: سخني وسادة دافئة إلى 37 درجة مئوية وغطيها بقطعة من الستائر المعقمة السميكة. تحقن الفأر إما عن طريق استنشاق الايسوفلوران عن طريق غرفة التعريفي أو حقن داخل البلعاق (IP) من 1٪ pentobarbital الصوديوم في جرعة من 10 مل / كجم.
    2. حلاقة الشعر من موقع الجراحة. يمكن تخطي هذه الخطوة للفئران العارية.
    3. التطهير واللف الجراحي: تطهير الجزء الخلفي من الماوس تماما مع اليود povidone 3x تليها 70٪ الإيثانول 1x ومسحه الجافة مع مسحات القطن المعقمة. ثم تطبيق ثلاث ضمادات طبية معقمة بالتسلسل، وتغطي الظهر كله من أجل خلق حقل الجراحية، فضلا عن شل حركة الماوس.
    4. شق والكلى الخارجية: قبل العملية، تطهير أصابع المشغل مع اليود povidone أو استخدام زوج من القفازات المعقمة. وضع الماوس في موقف عرضة واستخدام الأصابع لتحديد موقع الكلى اليسرى الحق تحت الجناح الأيسر. استخدام زوج من ملقط حادة ومقص لقطع الجلد مفتوحة وطبقة العضلات تحت الموقع المحدد. استخدام مسحات القطن المعقم وملقط لإخراج الكلى اليسرى جزئيا من البطن.
    5. زرع الخلايا السرطانية: تحميل تعليق الخلية المعدة في الخطوة 1.1 في حقن الأنسولين أو المحاقن هاملتون مخصصة (انظر جدول المواد للمواصفات). حقن 20 ميكرولتر من الخلايا التي أعيد تعليقها تحت كبسولة الكلى.
      ملاحظة: يتم تحديد الحقن الناجح عن طريق تشكيل انتفاخ شفاف على سطح الكلى. يؤدي الحقن العرضي في الـ parenchyma الكلوي إلى نزيف ومعدل وفيات بعد الجراحة يصل إلى 90٪ بسبب النزيف القاتل في موقع الحقن.
    6. سحب ببطء من الإبرة من أجل السماح للمحلول مصفوفة خارج الخلية لترسيخ ومنع نزيف أو تسرب الخلايا السرطانية. ثم، باستخدام مسحة القطن المعقم، ودفع الكلى مرة أخرى إلى البطن.
    7. خياطة الجرح: استخدم غرزة VICTRYL المغلفة 5-0 لخياطة طبقة العضلات. تطهير الجلد مع اليود povidone مرة واحدة وإغلاق الجلد مع autoclips الجرح.
    8. الانتعاش : وضع الماوس على لوحة دافئة حتى يستيقظ. إذا تم تم تم ّ تأهاض الفأر عن طريق الاستنشاق، اسحب الإيزوفلوران وأبقي الفأر على الوسادة الدافئة حتى يكون مستيقظاً.
  3. التصوير الحيوي (BLI) وجمع الأنسجة
    1. بعد ستة أسابيع من زرع الورم، خذ صور BLI المستندة إلى اليفلاف. ثم قتل الفئران مع استنشاق الايفورلوران تليها خلع عنق الرحم.
    2. جمع الدم للكشف عن الخلايا السرطانية (CTC) المتداولة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    3. حصاد الورم والأعضاء ذات الأهمية (الكلى والرئتين والكبد والأمعاء والطحال) باستخدام تقنية حصاد الأنسجة المعقمة22. إصلاحها في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها لتضمين البارافين الشمع.

2. CAM نموذج xenograft الورم

ملاحظة: تم تكييف هذه الإجراءات وتعديلها من البروتوكولات المنشورةسابقا23،24. يظهر الجدول الزمني لهذا الإجراء في الشكل 1B. تقدم هذه المقالة فقط البروتوكول المبسط. للحصول على بروتوكولات مفصلة، يرجى الرجوع إلى مقال آخر JoVE التي نشرتها مجموعتنا25.

  1. قبل الاحتضان: احتضان الطازجة، وبيض الدجاج المخصبة في حاضنة البيض الدورية في 37 درجة مئوية و الرطوبة 55-65٪ لمدة 7 أيام.
  2. إسقاط CAM وفتح نافذة (يوم التنمية 7):
    1. تحديد موقع ووضع علامة على كيس الهواء والأوردة.
      ملاحظة: عادة ما تتم إزالة 10-15٪ من البويضات لأنها إما غير مخصبة أو تموت في غضون 7 أيام من الإخصاب.
    2. إنشاء كيس الهواء الجديد على رأس الوريد ملحوظ.
    3. حدد كيس الهواء الجديد، وتطبيق شريط التعبئة، ووضع البيض مرة أخرى إلى الحاضنة.
      ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء مؤقتاً هنا. من المستحسن استئناف الإجراءات في نفس اليوم لأن كيس الهواء قد يتحرك.
    4. فتح نافذة: باستخدام زوج من مقص microتشريح المنحني وزوج من ملقط إبرة الأنف، وقطع نافذة دائرية 1.5 × 1.5 سم في قذيفة.
      ملاحظة: يشار إلى تعطيل CAM من خلال الدم وقطعة من CAM موجودة على قطعة قذيفة قطع.
    5. ختم الثقب مع خلع الملابس الطبية الشفافة ووضع البيض في حاضنة ثابتة في 37 درجة مئوية والرطوبة 55٪-65٪.
      ملاحظة: استخدم نفس حاضنة البيض كما هو الحال في الخطوة 2.1. إيقاف الدوار لجعله ثابت.
  3. الفحص الصحي (يوم النمو 9): قم بإزالة البيض الميت ثم قم بتجميع بقية البويضات عشوائيًا لزرع الخلايا السرطانية.
    ملاحظة: من الناحية المثالية، معدل البقاء على قيد الحياة في هذه المرحلة هو ما يقرب من 80٪ من يوم النمو 0.
  4. تطعيم الخلايا السرطانية على CAM المكشوفة حديثًا (يوم النمو 10)
    1. تمييع حل المصفوفة خارج الخلية في ضعف حجم RPMI 1640 (مع L-الجلوتامين). فصل خلايا RENCA وإعادة تعليق في الحل أعلاه للوصول إلى تركيز 2 × 104 خلايا / μL.
      ملاحظة: استخدم نسبة 1:1 من خلايا VHL-WT:VHL-KO للغرسات غير المتجانسة وVHL-WT وحدها للزرع المتجانس.
    2. لترسيخ تعليق الخلية مسبقًا ، قم بملء 100 ميكرولتر من كل مزيج من الخلايا في نصائح ماصة 200 ميكرولتر ووضعها في حاضنة الخلايا لمدة 15 دقيقة.
    3. زرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بيضة على سطح CAM من خلال النافذة.
      ملاحظة: تتطلب بعض البروتوكولات خدش CAM قبل الزرع23. هذا ليس ضروريا لخلايا RENCA، لأنها تنمو بسرعة كبيرة.
  5. تنمو الخلايا على CAM لمدة 10 يوما وصورة كل 2 أيام.
  6. القتل الرحيم وحصاد الورم والدم والأعضاء.
    1. في يوم النمو 20 (يوم الورم 10)، وجمع الدم عن طريق الوريد chorioallantoic مع حقنة 10 مل.
    2. القتل الرحيم الأجنة عن طريق وضعها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
    3. حصاد ووزن الأورام. تشريح الرئتين والكبد باستخدام تقنية حصاد الأنسجة المعقمة مماثلة لتلك المستخدمة للفئران22.
      ملاحظة: كبد الدجاج اثنين من فصوص، والتي هي الأعضاء الأولى ينظر في تجويف البطن. لا تخلط بين هذه مع الرئتين. تقع رئتي الدجاج تحت القلب والحاجز26. يمكن تأكيد المجموعة الناجحة للرئتين عن طريق الأضلاع المكشوفة.
    4. إصلاح الأورام والأعضاء تشريح في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها لتضمين البارافين الشمع.
  7. يفقس الدجاج.
    1. للسماح لفترة طويلة من نمو الورم، ومواصلة الحضانة من خلال اليوم 21 والسماح للدجاج يفقس في 37 درجة مئوية والرطوبة على الأقل 60٪.
      ملاحظة: الدجاج يفقس بشكل طبيعي بعد يوم 21 على مدى فترة زمنية 24 ح ولكن في بعض الأحيان لديهم مشكلة الفقس بأنفسهم. في هذه الحالة، تكسير قشر البيض بعض يساعد. من المهم للدجاج لإكمال عملية الفقس في غضون 24 ساعة لأنها سوف تموت من نقص المواد الغذائية بعد ذلك.
    2. زراعة الدجاج في منشأة للحيوانات (2017-102-01A) لمدة أسبوعين.
    3. في يوم النمو 34 (يوم الورم 24) ، قتل الفراخ مع استنشاق الايفورلوران يليه خلع عنق الرحم.
    4. تشريح الرئتين باستخدام تقنية حصاد الأنسجة المعقمة مماثلة لتلك المستخدمة للفئران22. ثم، إصلاحها في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها لتضمين البارافين الشمع.

3- الكيمياء الهيستوكيميائية المناعية

ملاحظة: تم إجراء جميع أقسام الأنسجة وتلطيخ H & E من قبل مختبر علم الأمراض الترجمي الأساسي (TPCL) في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس.

  1. خبز الشرائح في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وdeparaffinize 3x باستخدام xylene وrehydrate بشكل متسلسل من الإيثانول 100٪ إلى الماء.
  2. استرداد المستضدات في المخزن المؤقت التّيّستر في باخرة الخضار لمدة 25 دقيقة.
  3. تطبيق 1٪ BSA للحظر. ثم تطبيق الأجسام المضادة الأولية (المضادة VHL، المضادة لها، المضادة للعلم) أعدت في نسبة تخفيف 1:200 في برنامج تلفزيوني. احتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
  4. بعد غسل 3x مع TBST (7 دقيقة لكل منهما) ، يحتضن الشرائح مع الجسم المضاد الثانوي في 1:200 تخفيف. غسل 3x مع TBST (7 دقيقة لكل منهما) وتطبيق الكواشف DAB تليها هيماتوكسيلين مضادة للبقع.

4. تدفق الخلايا

  1. معالجة الماوس أو دم الدجاج مع خلايا الدم الحمراء (RBC) العازلة العازلة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لا يكفي تحلل RBC مهم بشكل خاص عند تحليل دم CAM لأن RBCs الدجاج هي نوياتتيد ولا يمكن تمييزها بسهولة في قياس التدفق الخلوي باستخدام مبعثر إلى الأمام والجانب.
  2. تشغيل تدفق الخلايا على تحلل الدم وتحليل البيانات للتعبير mStrawberry وEGFP.
  3. تعيين البوابات الأساسية على أساس الأمام والجانب مبعثر باستثناء الحطام والخلايا الميتة ، وRBCs غير مُغسَّر.
  4. تعيين بوابات الفلورسينس على أساس عينات غير ملطخة وضوابط واحدة ملطخة. استخدام تحليل الدم تستعد مع VHL-WT، VHL-KO، أو خلايا RENCA غير المسمى كعناصر تحكم واحدة ملطخة والضوابط غير الملطخة، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تنفيذ كل تجربة على الأقل 3x ما لم يذكر خلاف ذلك. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). تم تحديد الأهمية من خلال اختبار T للطلاب المقترنة عندما كانت هناك مجموعتين أو بواسطة ANOVA أحاديالاتجاه عندما كانت هناك ثلاث مجموعات أو أكثر. تم استخدام قطع قيمة p من 0.05 لتحديد الأهمية.

نمت خلايا RENCA المزروعة تقويم العظام بنجاح على كلى الفئران ، كما أكدت BLI وتلطيخ H & E(الشكل 2A-B...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بالنسبة للعديد من المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الظهارية ، فإن الانبثاث في الأعضاء الحيوية هو السبب الرئيسي للوفاة. لذلك ، من الضروري العثور على الآلية الأساسية ووسيلة جديدة للعلاج من الأمراض النقيلية. لسوء الحظ، هناك نقص في النماذج الحيوانية CCRCC النقيلية ذات الصلة. التحدي في جزء كبير منه يرجع إلى عدم القدرة على إعادة ccRCC في الفئران على الرغم من توليد العديد من الكلى المعدلة وراثيا الظهارية المستهدفة نماذج الماوس VHL خروج المغلوب9،10. هنا ، نُظهر طرق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل منحة البذور جامعة كاليفورنيا JCCC، منحة UCLA 3R، جامعة كاليفورنيا CTSI، وجامعة كاليفورنيا TRDRP (LW). نشكر مرفق التصوير قبل السريري التابع لمعهد كرومب، وTPCL، وقسم الطب الحيواني المختبري في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (DLAM) لمساعدتهم في الطرق التجريبية. تم إجراء قياس التدفق الخلوي في مركز السرطان الشامل في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس جونسون (JCCC) ومركز أبحاث الإيدز تدفق الخلوي مرفق الأساسية التي تدعمها المعاهد الوطنية للصحة جوائز P30 CA016042 و 5P30 AI028697، وJCCC، ومعهد الإيدز في جامعة كاليفورنيا، وكلية ديفيد جيفن للطب في جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس، ومكتب رئيس جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس، ومكتب جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس تم توفير خدمات الاستشارات الإحصائية وتحليل البيانات من قبل برنامج جامعة كاليفورنيا CTSI للإحصاءات الحيوية وعلم الأوبئة وتصميم الأبحاث (BERD) الذي يدعمه معهد الصحة القومي / المركز الوطني للنهوض بالعلوم المترجمة في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس CTSI رقم UL1TR001881.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ تربسين ، 0.1٪ EDTA في HBSS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم وبيكربونات الصوديومCorning25053CI
8050-N / 18 Micro 8V Max Tool KitDremel8050-N / 18
الأجسام المضادة المضادة ل VHLAbcamab135576
BD Lo-Dose U-100 محاقن الأنسولينBD Biosciences14-826-79
BD Pharm LyseBD Biosciences555899
BDGeneral الاستخدام والدقةGlide الإبر تحتفيشر Scientific14-826-5D
DAB Chromogen KitBiocare MedicalDB801R
D-Luciferin Firefly ، ملح البوتاسيومGoldbioLUCK-1G
DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيومGibcoLS14190250
DYKDDDDK Tag الأجسام المضادة أحادية النسيلة (FG4R)eBioscience14-6681-82
إدارة أسطوانات الإيثانول 20043196-11تحضير 70٪ في مصل
الأبقار الجنيني المائي ، المؤهل ، المناطق المعتمدة من وزارة الزراعة الأمريكيةفيشر ساینتفيك10-437-028
مقص تشريح حاد مدبب فيشرساينتيك08-940
كرات قطنية معقمة فيشرعلمية22-456-885
Fisherbrandملاقط / ملقط فائق الدقة مدبب مستقيم عالي الدقة / ملقطفيشر Scientific12-000-122
Fisherbrand أنابيب الطرد المركزي الدقيقةPremium: 1.5 ملFisher Scientific05-408-129
Formaldehyde Soln. ، 4٪ ، مخزن ، درجة الحموضة 6.9 (حوالي 10٪ Formalin soln.) ، لعلم الأنسجةMilliporeSigma1.00496.5000
حقنة هاميلتون مخصصةهاميلتون8040825 & مايكرو ؛ L ، موديل 702 SN ، المقياس: 30 ، نمط النقطة: 4 ، الزاوية: 30 ، طول الإبرة: 17 مم
الجسم المضاد لمسبار HA(Y-11)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc805
مقياس الدمهوسر ساینتيفيك3100
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Kit ComboKit مستودعHB1588D
Isothesia (Isoflurane) حلHenry Schein Animal Health1169567762
IVIS Lumina II في الجسم الحي نظام التصويرPerkin Elmer
Matrigel GFR MembraneCorningC354230
Medline Surgical Instrument Drape ، لاصق شفاف ، 24 × 18 بوصةMedex SupplyMED-DYNJSD2158
OmniPur BSA ، Fraction V [ألبومين مصل البقر] عزل الصدمات الحراريةMilliporeSigma2910-25GM
حل البنسلين والستربتومايسين ، 100X ، 10,000 وحدة دولية بنسلين ، 10,000 ميكروغرام / مل ستربتومايسينفيشر ScientificMT-30-002-CI
بنتوباربيتال الصوديومسيجما ألدريتش57-33-0تحضير 1٪ في محلول
ملحي بيروكسيداز أفينيبيور مضاد للفأر IgG (H + L)مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية115-035-062
بيروكسيداز أفينيالماعز النقي المضاد للأرانب IgG (H + L)مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية111-035-045
محلول بوفيدون اليود USP ، 10٪ (وزن / حجم) ، 1٪ (وزن / حجم) اليود المتاح ، للاستخدام المختبريRicca Chemical395516
pSicoRAddgene11579
هيدرات بوروميسين ثنائي هيدروكلوريد ، 99٪ ، ACROS Organicsفيشر ScientificAC227420500
RencaATCCCRL-2947
RPMI 1640 متوسط (Mod.) 1X مع L-GlutamineCorning10040CV
Scientific 96-Well غير الحواف لوحات ، نصائحمنخفضة المستوى Fisher ScientificAB-0700
SHARP ، ل P-200 ، 200 & micro ؛ لتر ، 960 (10 رفوف من 96)شريط شحن توماس سينتيفيك1159M40
، متعدد الأغراض ، 1.89 بوصة × 109.4 ياردة ، تان ، عبوة من 6 لفاتمن مستودع المكاتب220717
خياطةEthiconJ385H
Tegaderm ضمادة شفافة نمط الإطار الأصلي 2 3/8 بوصة × 2 3/4 بوصةMoore Medical1634
وسادة تسخين الدجاجالحرارية K & H تصنيع1000
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 × 3/8 × 1/16 جدار (50 قدما)TygonAACUN017
VHL-KOCRISPR / Cas9-mediated knockout of VHL ، ثم تم تصنيفها على النقي الفيروسي ب EGFP ويراع لوسيفيراز
VHL-WTالمسمى Lentivirally ببروتين فلورسنت الفراولة الموسوم ب HA ولوسيفيراز
اليراعأداة الدقة العالمية ملقط قزحية 10 سم CVD SerrFisher Scientific50-822-331
طقم مشابك الجرحBraintree Scientific ، inc.ACS KIT
Xylenes (النسيجي) ، فيشر كيماوياتفيشر ScientificX3S-4
الجلد Matrix حاجز الدقة

المراجع

  1. Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
  2. Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
  3. Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009(2017).
  4. Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
  5. Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
  6. Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
  7. Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
  8. Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
  9. Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
  10. Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
  11. Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032(2016).
  12. Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
  13. Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6(2015).
  14. DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
  15. Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
  16. Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
  17. Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
  18. Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
  19. Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
  20. Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
  21. Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
  22. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
  23. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815(2011).
  24. Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
  25. Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
  26. Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
  27. Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
  28. Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

VHL CRISPR

مقالات ذات صلة