يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

عدوي فيروس نقص المناعة المزمنة والحاده والمعاد تنشيطها في نماذج الماوس المناعية الانسانيه

10.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60315

⸱

ديسمبر 3, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Human Virology, School of Medicine, University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia

في هذه المقالة

ملخص

وفيما يلي ثلاثه نهج تجريبية لدراسة ديناميات الاصابه بفيروس نقص المناعة التي تصيب الفئران الانسانيه. ويسمح الأول بدراسة احداث العدوى المزمنة ، في حين يسمح الأخيران بدراسة الاحداث الحاده بعد العدوى الاوليه أو أعاده التنشيط الفيروسي.

الملخص

أنسنه إيماءه/SCID/آيل-2 مستقبلات γ-سلسله الفئرانفارغه تلخيص بعض ملامح المناعة البشرية ، والتي يمكن استغلالها في البحوث الاساسيه وما قبل السريرية علي الامراض المعدية. وصفت هنا ثلاثه نماذج من الفئران المناعية الانسانيه لدراسة ديناميات العدوى بفيروس نقص المناعة التي. ويستند الأول علي حقن داخل الكبد منCD34 + الخلايا الجذعية للدم في الفئران حديثي الولادة ، والذي يسمح لأعاده تشكيل العديد من الدم والخلايا اللمفاوية الانسجه المحصورة ، تليها العدوى مع سلاله الفيروس المرجعي. هذا النموذج يسمح رصد لمده تصل إلى 36 أسابيع بعد العدوى ، التالي يسمي النموذج المزمن. ويشار إلى النموذجين الثاني والثالث باسم النماذج الحاده وأعاده التنشيط ، حيث يتم حقن الخلايا أحاديه النواة في الدم المحيطيه داخل الفئران البالغة. وفي النموذج الحاد ، يتم تطويق الخلايا من متبرع صحي من خلال الطريق داخل الصفاق ، تليها العدوى بسلاله الفيروس المرجعية. وأخيرا ، في نموذج أعاده التنشيط ، يتم التعاطي مع خلايا من متبرع مصاب بفيروس نقص المناعة التي تخضع للعلاج المضاد للفيروسات الرجعية عبر الطريق داخل الصفاق. في هذه الحالة ، بيئة خاليه من المخدرات في الماوس يسمح لأعاده تنشيط الفيروس وزيادة في الحمل الفيروسي. وتصف البروتوكولات المقدمة هنا النهج التجريبي التقليدي لنماذج الماوس الانسانيه وغير المناعية للاصابه بفيروس نقص المناعة الفيروس.

المقدمة

وتستند هذه الفئران علي السكري غير البدناء (إيماءه) الخلفية ، مع طفرة scid والطفرة المستهدفة في مستقبل il-2 γ-سلسله الموضع (المشتركة γ سلسله ل il-2 ، آيل-4 ، آيل-7 ، آيل-9 ، آيل-15 ، وآيل-21) ، التي تحفز علي ضعف شديد في تطوير الماوس T-، B-، والطبيعية القاتل (NK) الخلايا1. التالي ، فانها تدعم الانسجه البشرية ، والCD34 البشرية + الخلايا الجذعية التي تكون الدم (hscs) ، والإنسان الطرفية خلايا أحاديه النوى (pbmcs)3،4،5. الاضافه إلى ذلك ، فان التعبير المعدل وراثيا لعوامل الدم البشرية ، مثل عامل الخلايا الجذعية ، والحبيبية/الضامة-عامل تحفيز المستعمرات (GM-السائل الدماغي الشوكي) ، و IL-3 يعزز التطعيم من السكان النخاعي البشري6،7،8.

بالنسبة للدراسات المتعلقة بفيروس نقص المناعة البشرية ، تم وصف عده نماذج من الماوس γ-سلسلهفارغه ، والتي تختلف في سلاله الماوس ، ونوع من خلايا الإنسان المستخدمة ، ونوع من الانسجه للانغراف ، واصل الخلايا (اي ، صحية مقابل. المتبرع المصاب بالفيروس)9،10. سلاله الأصلي ، ومع ذلك ، يستخدم علي نطاق واسع نظرا للمستويات العالية من الخلايا البشرية النسخ المتماثل والفيروسية بعد العدوى مع سلاله الفيروس المرجعي11،12،13. سلالات الماوس المناعية مماثله مع التعبير المحورة وراثيا من العوامل التي تكون الدم الإنسان (علي سبيل المثال ، شراب-exl أو SGM3) أو مع يزرع من الكبد البشري وانسجه الغدة الصعتريه (الفئران نخاع العظم-الكبد-الغدة الصعتريه) مفيده لتقييم دور السكان النخاعي في الاستجابة المناعية المضادة للفيروس ، والآثار المترتبة علي الفيروس علي هذه الانسجه ، ومشاركتها كخزانات الفيروسية14،15. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام بعض السلالات مع التعبير المحور وراثيا من جزيئات الكريات البيضاء البشرية (هلا) ، فضلا عن الفئران ، لدراسة استجابه الخلايا التائية للعدوى بفيروس نقص المناعة16،17.

بشكل عام ، في هذه الفئران ، والانسنه يعتمد علي الأصل الخلوية ، والطريق التسليم (داخل الكبد ، في الوريد ، الحقن الوريدي ، اينترارداك) والفار العمر في وقت اينغراتمال18،19،20. وفيما يتعلق أصل الخلية ، CD34الإنسان + HSC المستمدة من دم الحبل الشوكي ، كبد الجنين ، أو الدم الطرفية المعباه يمكن حقنها في حديثي الولادة أو الفئران الشباب3،21. الاضافه إلى ذلك ، الكبار γ-سلسله الفئرانالفارغة يمكن أنسنه بواسطة حقن pbmc (هنا ، يشار اليه باسم الفئرانالخالية من السلسلة γ-pbl-NS) ، مما يسمح للدوران الزمني لهذه الخلايا في الدم ، والاجهزه اللمفاوية الثانوية ، والانسجه الملتهبة22،23،24.

وصفت هنا هو بروتوكول مفصل لإنشاء huNS γ سلسلهخاليه من نماذج الماوس لدراسة العدوى بفيروس نقص المناعة الذاتي. الأول هو النموذج المزمن ، حيث يتم حقن الإنسانCD34 + hscs المستمدة من دم الحبل الشوكي من متبرع صحي في الفئران حديثي الولادة ، تليها العدوى مع سلاله الفيروس المرجعي بعد 14 أسبوعا من أعاده تشكيل جهاز المناعة البشرية. هذا النموذج يسمح رصد الفئران لمده تصل إلى ~ 36 أسابيع بعد العدوى. النموذج الثاني هو نموذج حاد ، والتي يتم حقن Pbmmms من متبرع صحي في الكبار NS γ-سلسله الفئرانفارغه ، تليها العدوى مع سلاله فيروس نقص المناعة البشرية المرجعية بعد 3 أسابيع من الإنسان T-خليه التوسع في الماوس. وأخيرا ، فان النموذج الثالث هو نموذج أعاده التنشيط ، الذي يستمد منه المانحون المصابون بفيروس نقص المناعة المكتسب في اطار العلاج المضاد للفيروسات العكوسه (ART) في الفئران البالغة الγهالخالية من الإيدز. في هذه الحالة ، بيئة خاليه من المخدرات يسمح لأعاده تنشيط الفيروسية وزيادة في الحمل الفيروسي. النموذجين الأخير تسمح الرصد لمده تصل إلى ~ 9 أسابيع بعد العملية.

عموما ، هذه النماذج الثلاثة هي مفيده للدراسات الفيروسية ، والدراسات قبل السريرية من الادويه الجديدة ، وتقييم اثار العدوى بفيروس نقص المناعة الذاتي علي الاستجابة المناعية العالمية. ومن المهم أيضا النظر في ان استخدام الفئران الانسانيه المصابة بفيروس نقص المناعة الذاتية يتطلب مراجعه وموافقه من قبل لجنه السلامة المؤسسية للسلامة البيولوجية وكذلك من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الماشية (IACUC) قبل اي تجربه. وهذا يضمن ان تتبع الدراسة جميع الانظمه المؤسسية الداخلية والخارجية لاستخدام المواد البيولوجية الخطرة والمناولة الانسانيه للحيوانات التجريبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وفي هذا العمل ، تم تنفيذ جميع الرعاية والإجراءات الحيوانية وفقا للبروتوكولات التي استعرضتها ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية واستخدامها في كليه الطب بجامعه ماريلاند (البروتوكول رقم 1018017 ، 1018018 ، 0318009).

1. الإنسانCD34 + HSC تهجين فئران حديثي الولادة

  1. استخدم دائما معدات الحماية الشخصية القابلة للتصرف ، بما في ذلك الدعك المعقمة ، والقفازات ، والاحذيه المخصصة ، وأغطيه الاحذيه ، والاقنعه ، والنظارات الواقية ، وغطاء الشعر/اللحية ، ومعاطف المختبرات المعقمة.
  2. أعاده التعليق 1 × 106 من CD34 المجمدة + hscs (انظر جدول المواد) في 10 مل من rpmi 1640 وسائل الاعلام 10 ٪ التي تمت ببموجب خزانه معتمده للسلامة البيولوجية والحفاظ علي ظروف معقمه.
  3. استخدام 10 μL من تعليق لحساب (لضمان وجود العدد المتوقع من الخلايا) والتحقق من سلامه الخلية بواسطة اللون الأزرق الاستبعاد تريبين تلطيخ في الكريات الدموية.
  4. أجهزه الطرد المركزي في 400 x g لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT). تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق في الباردة 1x تلفزيوني إلى التركيز المطلوب (1.4 x 105 منCD34 + hscs في 50 μl). الحفاظ علي الخلايا علي الجليد حتى الحقن.
  5. مكان الجراء (NS γ-سلسله من الجراءفارغه من كلا الجنسين من 1 إلى 4 أيام من العمر) إلى 100 العقيمة مم2 طبق بيتري جنبا إلى جنب مع كميه صغيره من المواد الفراش من قفص المربي. بالاضافه إلى ذلك ، فرك الفراش نظيفه بين اليدين لمزيد من قناع اي الروائح الغريبة علي الجراء المتلقي.
    ملاحظه: هذا يقلل من الروائح الغريبة يجري مشربه علي الجراء ، التالي تحسين فرص الأمهات قبول الجراء العودة إلى أقفاص بعد العملية.
  6. وضع طبق بيتري في قفص النقل نظيفه ووضع القفص في قفص الماوس الصغيرة نظيفه لحماية الجراء من البيئة. تغطيه قفص النقل مع غطاء وساده لتجنب التعرض للحيوانات إلى الضوء الخارجي اثناء العبور إلى غرفه التشعيع.
  7. الإشعاع الجراء مع 100 cGy الجسم كله التشعيع (WBI) عن طريق التعرض لمصدر 137 Cs. تنظيف المناطق الداخلية من المبرد مع محلول مطهر ، مكان الفئران في المبرد ، وتشغيل القرص الدوار بحيث يتم المشعة جميع الجراء متجانسة. اغلق المبرد واضغط علي مفتاح الطاقة لبدء عمليه التشعيع. انتظر حتى اكتمال وقت التشعيع وأزاله الفئران فورا.
    ملاحظه: بما ان التشعيع لا يولد الإجهاد في الفئران ، فان التخدير السابق غير مطلوب.
  8. 2 – 4 ساعات بعد العملية الاشعاعيه ، ضع الجراء في خزانه السلامة الاحيائيه داخل صحن التعقيم المعقم المبرد المغطي بالشاش المعقم علي الجليد ، حتى يتم تخديره (~ 5 – 10 دقائق). ويتحقق التخدير الكافي عندما تتوقف الحركات الاجماليه.
  9. تحميل حقنه مع ابره المرفقة (29 ز, 0.5 ") مع 50 μL من تعليق الخلية و 1.4 x 105 منCD34 + hscs تحت السلامة البيولوجية المعتمدة مجلس الوزراء.
  10. بالنسبة للحقن عن طريق الحقن الكبدي ، وكبح جماح الجراء مع الإبهام ومؤشر الأصابع. للتقليل من ضبط الفاره (~ 30 – 45 ق) ، والسماح لأحد المحققين عقد الجرو وأداره الحقن ، ويكون المحقق الثاني تحميل حقنه مع تعليق HSC. تنظيف موقع الحقن مع 70 ٪ الكحول وتقديم 50 μL من الخلايا مباشره في الكبد. استخدام زاوية ابره الضحلة عند الحقن لتجنب ثقب تماما في الكبد. كعنصر تحكم ، حقن الفئران مع 50 μL من 1x تلفزيوني في الكبد.
  11. ضع الجراء علي طبق بيتري معقم قبل التسخين مغطي بالشاش المعقم لمده 1 – 5 دقائق للسماح بالتعافي. قبل الحارة الطبق باستخدام لوحه الاحترار الاشعه تحت الحمراء لقوارض في 20 درجه مئوية لضمان ان الجراء لن تكون أكثر دفئا.
  12. مباشره قبل العودة الجراء إلى إبائهم ، وتطبيق كميه صغيره من المنثول-والكافور القائم علي مرهم ، وذلك باستخدام الإبهام ومؤشر الأصابع ، إلى الخطم من كلا الوالدين لتجنب أكل لحوم البشر أو رفض الجراء.
  13. افحص الأقفاص كل يوم ، وابحث عن اي علامات علي مرض الطعم مقابل المضيف (GVHD) في الجراء مثل الجلد الجاف ، وعدم التغذية ، والطفح الجلدي ، والثعلبة. موت ببطء الماشية إذا لوحظت اي من هذه العلامات.
  14. الفئران wean في 3 أسابيع من العمر ، وتجميعها حسب الجنس. لا تضع أكثر من 5 الحيوانية في القفص. تحقق من التطويق في الدم المحيطي عن طريق قياس التدفق الخلوي في 14 أسبوعا من العمر.
    ملاحظه: معدل النجاح لل تهجين التي تتراوح بين 80 ٪-100 ٪.

2-الاجهزه البشرية لفئران الاحداث

  1. بالنسبة للنماذج الحاده وأعاده التنشيط ، احقن الفئرانالخالية من الفيروسات γ-سلسله NS التي تتراوح مدتها بين 6 و 8 أسابيع داخل الإطار البشري المشتق من المتبرع الصحي أو المريض المصاب بالإيدز الذي كان تحت الفن ، علي التوالي. في كلا النموذجين ، وتشمل الفئران التي تم حقنها مع Pbmmcmcmcmin من متبرع صحي دون عدوي فيروس نقص المناعة التي (الشام) والضوابط.
  2. طبقه 15 مل من الدم كله في 5 مل من متوسطه التدرج الكثافة المعقمة إلى أنبوب مخروطي 50 mL.
  3. أجهزه الطرد المركزي في 400 x ز لمده 30 دقيقه في RT ، دون الفرامل ، لتجنب معطف بافي من ان تصبح مختلطة مع متوسط التدرج الكثافة.
  4. بعناية جمع جزء من الخلايا أحاديه النوى (بين المتوسطة التدرج الكثافة و supernatant) ونقل معطف بافي إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي علي 10 مل من 1x تلفزيوني. الطرد المركزي في 300 x ز ل 10 دقيقه في RT.
  5. تجاهل ماده طافي وأزاله خلايا الدم الحمراء المتبقية عن طريق ليسينج مع 5 مل من المخزن المؤقت ACK أضافه إلى الخلايا المغلفة. احتضان لمده 4 دقائق في RT.
  6. أجهزه الطرد المركزي في 300 x ز ل 10 دقيقه في RT. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق في 10 مل من 1x تلفزيوني أو rpmi 1640 المتوسطة.
  7. استخدام 10 μL من تعليق الخلية لحساب الخلايا والتحقق من القدرة علي البقاء بواسطة تريبان تلطيخ الاستبعاد الأزرق في الكريات الدموية. عاده ، يتم الحصول علي 1-2 × 106 خلايا لكل 1 مل من الدم ، مع أكثر من 95 ٪ القدرة علي البقاء.
  8. أجهزه الطرد المركزي في 300 x ز ل 10 دقيقه في RT. تجاهل ماده طافي وضبط رقم الخلية إلى التركيز المطلوب (في هذه الحالة ، 3.5 x 106 خلايا في 200 μl من 1x تلفزيوني).
  9. تحميل حقنه مع ابره المرفقة (28 ز, 0.5 ") مع 3.5 x 106 من pbmmcs في 200 μl من 1X تلفزيوني تحت خزانه السلامة الاحيائيه المعتمدة.
  10. أزاله الماوس من القفص والاحتفاظ بها من قبل الذيل بحيث يمكن قبضه الشبكة ، وتطبيق الجر لطيف إلى الوراء. ثم ضع السبابة وأصابع الإبهام علي أكتاف الحيوانية ، وامسك الجلد المترهل للرقبة واستخدم الاصبع الأوسط لتثبيت ظهره.
  11. حرك راس الماوس مره أخرى بحيث ظهرها فوق الراس. وهذا يسمح للأحشاء في تجويف البطن ان تكون النازحين إلى الوراء ويقلل من خطر ثقب الأعضاء الداخلية اثناء الحقن.
  12. تنظيف موقع الحقن مع 70 ٪ الكحول.
  13. تخترق الحقنه المستخدمة في الخطوة 2.9 من خلال جدار البطن ويستنشق قبل حقن الخلايا ، إذا كان يتم يستنشق اي ماده ، وأزاله الحقنه وتجاهله. والا ، حقن الخلايا ببطء في تجويف داخل الصفاق ، وأزاله الحقنه وتجاهله. حقن 1x تلفزيوني للسيطرة علي الفئران.
  14. أعاده الحيوانية إلى قفصها.
  15. التحقق من التطويق في الدم المحيطي عن طريق تدفق الخلوي في 3 أسابيع بعد الحقن.

3. رعاية ما بعد الخدمة

  1. تحديد الفئران عن طريق وضع علامات علي الاذن.
  2. مراقبه الفئران المستخدمة في هذه التجارب عن كثب 2x في اليوم الواحد بعد كل اجراء لعلامات الاستغاثة السريرية.
  3. بعد زرع الخلايا البشرية ، ورصد الفئران ل GVHD. لرصد اعراض GVHD في حديثي الولادة ، والاحداث ، والفئران الكبار ، وتقييم الحيوانية لظهور امراض الجلد (اي اللون ، وجفاف ، والطفح الجلدي ، وثعلبه) ، بالاضافه إلى قياس وزن الجسم. تقييم الحيوانية التي تظهر هذه العلامات من قبل طبيب بيطري للنظر في وقت مبكر القتل الرحيم.

4-إجراءات الاصابه بفيروس نقص المناعة التي تصيب الشام

ملاحظه: بالنسبة للنماذج المزمنة والحاده ، تصاب الفئران بالسلالة المرجعية لفيروس نقص المناعة الذاتية في الأسبوع 14 والأسبوع 3 بعد التطعيم ، علي التوالي. وتدار الحقن بفيروس نقص المناعة الذاتية داخل أرباع البطن السفلي.

  1. تنفيذ عمليه التحميل من الفيروسات/تلفزيوني في المحاقن ، وذلك باستخدام 28 جرام 0.5 "ابره ، في BSL2 خزائن التالية ABSL2 الإجراءات. المبلغ الإجمالي للفيروس حقن 15,000 متوسط الجرعة المعدية ثقافة الانسجه (TCID50) في 200 μl من rpmi العقيمة 1640.
  2. أزاله الماوس من القفص والاحتفاظ بها من ذيله بحيث يمكن قبضه الشبكة ، وتطبيق الجر لطيف إلى الوراء. ثم ، ضع السبابة والإبهام علي أكتاف الحيوانية ، والاستيلاء علي الجلد فضفاضة من الرقبة واستخدام الاصبع الأوسط لتحقيق الاستقرار في الظهر.
  3. حرك راس الماوس مره أخرى بحيث ظهره هو فوق راسه. وهذا يسمح للأحشاء في تجويف البطن ان تكون النازحين إلى الوراء ويقلل من خطر ثقب الأعضاء الداخلية اثناء الحقن.
  4. تنظيف الفئران مع وساده الكحول قبل المبللة في الربع السفلي الأيسر/الأيمن من البطن. حقن 15,000 TCID50 من فيروس بال فيروس الواردة في 200 ΜL من rpmi العقيمة 1640.
  5. بعد الحقن ، وأعاده الماوس إلى قفصه المنزل.

5. جمع الدم عن طريق ثقب خلف المداري

ملاحظه: النزيف الرجعي يسمح لجمع سريع من الدم ، التالي تقليل الوقت جمع الكلي وزيادة استقرار علامات الخلايا اللمفاوية البشرية. استخدام أنابيب أدتا لجمع الفئران الدم.

  1. في النموذج المزمن ، في 14 أسابيع بعد حقن HSC ، وجمع الدم عن طريق الوريد الرجعي. في النماذج الحاده وأعاده التنشيط ، وتنفيذ هذا الاجراء في 3 أسابيع بعد حقن PBMC.
  2. تخدير الماشية باستخدام 250 μl من استنشاق ايزوفلواني قبل جمع الدم في فئة غطاء السلامة البيولوجية B2 التي يتم أنبوبي خارجيا.
  3. الاستغناء عن ايزوفلواني في منصات القطن تحت شبكه سلكيه في جره 1 L واضحة في خزانه السلامة الاحيائيه تنفيس خارج المبني. استخدام شبكه يضمن ان الكائنات لا تتصل الوسادة ايزوفلواني غارقه ، والتي يمكن ان تسبب تهيج الجلد والجرعات الزائدة المحتملة منذ ايزوفلواني يمتص أيضا من خلال الجلد. أيضا ، وضع منشفه ورقيه لينه بين شبكه والحيوانية لتجنب إصابات الأطراف.
  4. مره واحده يتم المشبعة جره مع ايزوفلواني (حوالي 1 دقيقه بعد اضافته) ، وإدخال الحيوانية ومراقبه معدل التنفس ، والتي سوف تزيد ثم انخفاض. التحقق من الدلالة السريرية لمستوي عميق من التخدير ، والذي يتضمن عدم وجود منعكس اليمين (علي الجرة البقشيش بلطف) وعدم وجود حركات الإجمالي. بدء الاجراء النزيف بمجرد ان الحيوانية هو استرخاء تماما وتفتقر إلى المنعكس قرصه اصبع القدم.
    ملاحظه: منذ يتبخر ايزوفلوان ، والاستغناء عن المزيد من المخدرات إذا لم يلاحظ اي علامات التخدير.
  5. لنزيف خلف المداري ، اضغط علي الماوس وريد الوداجي الخارجي إلى الفك السفلي مع الإبهام ، ومع نفس اليد ، ورفع بلطف الجفن العلوي مع السبابة.
  6. ادراج أنبوب الهيكوريت في السائل الإنسي العين وتوجيهها في اتجاه الأفقي حتى يبدا الدم فلوشينغ.
  7. جمع ما لا يقل عن 100 μL من الدم. وبمجرد الحصول علي الحجم المطلوب من الدم (حجم لا يزيد عن 1 ٪ من وزن الجسم من الحيوانية) ، والتوقف عن الضغط الوداجي الخارجي وأزاله أنبوب الهيتوكريت.
  8. تاكد من اكتمال الأرقاء عن طريق تطبيق الضغط المباشر علي العين باستخدام شاش معقم لمده 30 ثانيه كحد ادني.
  9. تطبيق قطرات تتراكائين في العين. مراقبه الحيوانية حتى انها قد تعافي تماما من التخدير ووضعه مره أخرى في القفص.
    ملاحظه: يتم استخدام 100 μL من الدم التي تم جمعها لتقييم مستوي الCD45 البشرية + وغيرها من السكان خلايا الدم ، وكذلك لتقييم الحمل الفيروسي البلازما.

6. فحص مستوي التصوير وتحليل التدفق الخلوي

  1. اتبع بروتوكول تلطيخ التدفق الخلوي التقليدية للدم كله ، والذي يتضمن حضانة الفلوروكروم المسمي الأجسام المضادة للإنسان (للوحه تدفق المقترحة ، انظر جدول المواد) ، تليها تحلل خلايا الدم الحمراء وغسل الخطوات13،15.
    ملاحظه: لفحص مستوي التصوير الطبي ، وتشمل مضاده للإنسان CD45 الأجسام. للمقارنة, ويمكن أيضا ان تستخدم المضادة للماوس CD45 الأضداد. وتشمل ضوابط التعويض وكذلك عينه دم الإنسان ملطخه بنفس مزيج الأجسام المضادة ، والماوس غير الملون وعينات الدم البشري ، والسيطرة غير أنسنه لاختبار عبر التفاعل من الكواشف. بعد تلطيخ ، وهناك دائما بعض اشاره الخلفية. ومع ذلك ، فان جميع الإشارات الايجابيه تتميز بوضوح عن الضوابط السلبية والتفاعلية.
  2. في التدفق الخلوي المناسب ، والحصول علي ما لا يقل عن 10,000 الاحداث علي بوابه الخلايا اللمفاوية (FSC-A مقابل SSC-a). لتحليل تدفق الخلايا الخلوية ، بعد الاستبعاد المتكرر ، تحديد النسبة المئوية للخلايا البشريةCD45 + وكذلك السكان الخلايا الأخرى من الفائدة.

7. تقييم حموله البلازما الفيروسية

  1. تقييم الحمل الفيروسي في المصابين بفيروس نقص المناعة الحيوانية 1x في الأسبوع بعد العدوى.
  2. بعد النزيف خلف المداري (حوالي 100 μl) ، والحصول علي البلازما عن طريق جمع ماده طافي بعد طرد من الدم التخثر في 3,500 x ز لمده 3 دقائق في ميكروطارد للطرد المركزي. ويستخدم بيليه لخلايا الدم الظاهرية.
  3. استخدام التجارية الفيروسية RNA استخراج عده (انظر جدول المواد) للحصول علي الحمض الريبي النيبالي من 40 μl من البلازما.
  4. تحويل RNA إلى cDNA باستخدام مزيج التوليف سلاله الاولي (انظر جدول المواد) وفيروس نقص المناعة الSK431 التمهيدي هفوة.
  5. اجراء الكمية في الوقت الحقيقي PCR باستخدام فيروس نقص المناعة الذاتي هفوة الإشعال SK38/SK39 والاصباغ الخضراء الفلورسنت (علي سبيل المثال ، sybr الأخضر) كما هو موضح في الدراسات السابقة13،25.

8-أداره العلاج المضاد للفيروسات العكوسه

  1. أداره الفن عن طريق الفم علي الأقل 3 أسابيع بعد الاصابه ، عندما لوحظ الحمل الفيروسي عاليه ، في المزمنة ، والحاده ، ونماذج أعاده التنشيط.
  2. احسب جرعات الجرعة الزائدة (tdf) ، و امتريسيتابين (الفيدرالية) ، و ralteوزني (RAL) ، وفقا لقيم Km من 37 و 3 للبشر والفئران ، علي التوالي26. عاده ، الجرعات المكافئة للإنسان من TDF ، الفيدرالية ، و RAL هي 61.7 ملغ/كغ/يوم ، 40.7 ملغم/كغ/يوم ، و 164 ملغم/كغ/يوم ، علي التوالي.
  3. للاداره في مياه الشرب ، وسحق أقراص المخدرات وأضافه المبلغ المعني في زجاجه المياه ، وضمان ان كل الماوس في القفص يكتسب الجرعة اليومية. منذ مسحوق المخدرات قد تشكل الرواسب في الزجاجة ، يهز بشكل دوري زجاجه المياه لتحقيق تعليق متجانسة.
  4. تغيير زجاجه المياه كل أسبوع مع المخدرات الذائبة الطازجة.
  5. جمع الدم عن طريق الوريد الرجعي كل أسبوع أو كل 2 أسابيع بعد بدء الفن لتقييم التغيرات في الحمل الفيروسي و CD8: نسبه.

9. الفار القتل الرحيم ، وجمع الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، وعزل الخلايا أحاديه النواة

  1. يتم تنفيذ القتل الرحيم في نماذج الماوس أنسنه الثلاثة ، بشكل دوري علي طول الوقت العدوى ، أو في نهاية التجربة.
  2. أداء القتل الرحيم من الفئران الكبار بواسطة CO2 خنق ، تليها خلع عنق الرحم. لخنق ، واستخدام غرفه غير المشحونة مسبقا ، والاستغناء CO2 من اسطوانه تجاريه مع منظم ضغط ثابت وفي خط مقيد السيطرة علي تدفق الغاز في غضون 20 ٪-30 ٪ من حجم الغرفة/دقيقه للامتثال للمبادئ التوجيهية 2013 avma.
  3. الحفاظ علي تدفق CO2 ل> 60 s رصد التوقف التنفسي (الذي قد يستغرق ما يصل إلى 5 دقائق) ، تليها خلع عنق الرحم لضمان القتل الرحيم.
  4. موت ببطء الولدان < 7 أيام من العمر بطريقه فيزيائية (اي باستخدام مقص حاد).
  5. تصور العقد اللمفاوية الابطيه ، والوسيط ، والغدد الليمفاوية المساريقي (والتي عاده ما يتم ملاحظتها) واستخراجها بملاقط ومقص حاد. أيضا استخراج الطحال ، وتقع في الجانب الأيسر العلوي من التجويف البريتوني.
  6. إيداع الانسجه اللمفاوية في 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي علي RPMI العقيمة 1640 المتوسطة.
  7. معالجه الانسجه اللمفاوية علي الفور في 70 مم المسام الحجم النايلون مصفاه الخلية ، وجمع الخلايا في أنبوب 50 mL. لا يستنشق الانسجه.
  8. غسل الخلايا مع 5 مل من RPMI 1640 المتوسطة المضافة مع 1 ٪ لتسهيل تصفيه الخلايا.
  9. بعد تصنيف الانسجه ، الطرد المركزي الخلايا تعليق في 3,500 x ز ل 10 دقيقه في الطرد المركزي الصغير.
  10. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا مع 500 μl من 1x تلفزيوني.
  11. نقل تعليق الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL التي تحتوي علي 500 μL من المتوسطة الانحدار الكثافة المعقمة.
  12. أجهزه الطرد المركزي في 3,500 x ز ل 3 دقيقه في الطرد المركزي ، دون الفرامل ، لمنع معطف بافي من الاختلاط مع متوسط الكثافة التدرج
  13. بعناية جمع جزء من الخلايا أحاديه النوى (بين المتوسطة التدرج الكثافة و supernatant) ونقل معطف بافي إلى 1.5 mL أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي علي 500 μL من 1x تلفزيوني. الطرد المركزي في 3,000 x ز لمده 3 دقائق.
  14. أزاله خلايا الدم الحمراء المتبقية بواسطة ليسينج مع 500 μL من ACK المخزن المؤقت ، احتضان لمده 4 دقائق في RT.
  15. الطرد المركزي في 3,000 x ز لمده 3 دقائق. تجاهل ماده طافي وأعاده التعليق في 1 مل من 1x تلفزيوني أو المتوسطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كما هو موضح أعلاه ، في 14 أسبوعا بعد حقن HSC (نموذج المزمن) أو في 3 أسابيع حقن بعد PBMC (نماذج الحاده وأعاده التنشيط) ، ونزفت الفئران للكشف عن مستوي الخلايا البشرية التي يتم الكشف عنها عن طريق تدفق الخلوية. ممثل استراتيجية لتقييم 1) CD45الإنسان + أعاده تكوين الخلايا و 2) وترد النسبة المئوية من الخلايا التائية والCD8 + T في الشكل 1ا. عاده ، فان مستوي الجرعة (النسبة المئوية من الخلايا البشريةCD45 + ) يتراوح من 10 ٪ إلى 80 ٪ بعد حقن

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تم تحقيق تقدم هام في تطوير سلالات الماوس نقص المناعة لأنسنه ، مع عدد من الخيارات المختلفة التي يمكن استخدامها وفقا للاهتمام البحوث1. المنصوص عليها هنا هو بروتوكول عام لإضفاء الطابع الإنساني علي NS γ-سلسلهخاليه من الفئران وسلالات مماثله وراثيا لاستخدامها في ثلاثه نماذج مختلفه لدراسة العدوى بفيروس نقص المناعة الذاتي. في النهج التجريبي الأول ، يتم حقن الفئران حديثي الولادة المشعة مع CD34الإنسان + hscs ، والتي يمكن ان تستمد من دم الحبل الشوكي ، كبد الجنين ، أو حشدت الدم المحي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل من قبل القسم السريري IHV الصناديق الداخلية إلى JCZ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0. 5 مل أنابيب الطرد المركزينبتون3735.S.X
1. 5 مل أنابيب الطرد المركزينبتون3745.S.X
10 مل الماصات المصليةالنجمية النجميةVL-4090-0010
15 مل أنابيب مخروطيةعلمية نجميةT15-600
25 مل ماصاتنجميةVL-4090-0025
5 مل ماصات مصليةنجميةعلمية VL-4090-0005
50 مل أنابيب مخروطية علميةT50-600
ACK عازلة تحللالجودة البيولوجية118-156-101
وسادات تحضير الكحولفيشر العلمية06-669-62
استنساخ CD3 المعقم المضاد للإنسان UCHT1Biolegend300439APC
استنساخ CD4 المترافق المضاد للبشر OKT4Biolegend317420AF488 مترافق
مضاد للإنسان استنساخ CD45 2D1Biolegend368522BV421 مترافق
مضاد للإنسان استنساخ CD8 SK1Biolegend344710PerCP-Cy5.5 خزانة
Biosafaty المترافقة المستوى 2إذا كان من الممكن توصيله ب exauste chimeny عند التعامل مع Isoflurane
بونيهفيشر العلمي17-100-900غطاء يستخدم مرة واحدة للحماية الأساسية
CavicideMetrex13-1000خلايا CD34 + مطهر السطح
Lonza2C-101كعدد كبير من القوارير المتوفرة من
جهاز طرد مركزيBeckman65-6KR
جرة شفافةAmazon77977
وسادةشاش قطنيةفيشر العلمي22-415-468
معاطف مختبر معقمة يمكن التخلصمنها فيشر علمي19-472-422
أنابيب EDTA الدقيقةGreiner bio-one450480
قناع الوجهفيشر العلمي17-100-897
حل FACS للتحللBD340202
FBS قسط HIAtlanta biologicalsS1115OH
FicollGE health one17-1440-02
مقياس التدفق الخلوياستخدمنا FACS Aria II
أنابيب قياس التدفق الخلويFalcon3520545 مل من البوليسترين والقاع المستدير
HIV BaLالمحضرة في منشأتنا
متطوعين إيجابيين وسلبيين لفيروس نقص المناعة
بالأشعة تحت الحمراء وسادة الاحترارVenet العلميةDCT-25وسادة الاحترار العلاجية المؤقتة للحيوانات الصغيرة
Isentress (Raltegravir) MerckNSC 0006-0227061الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) - مثبط Integrase
IsofluraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
Mark I معدات الإشعاعالتابعة لجامعة ماريلاند
الماصات الصغيرة أجهزة
الطرد المركزيالدقيقة Eppendorf
Mouse علامات الأذن NationalBand & شركة العلامة1005-1L1
أنابيب جمع الدم Natelsonفيشر العلمية02-668-10
NOG-EXLتاكونيكHSCFTL-13395-F
NSG الفئرانجاكسون5557الإناث الحوامل للنقش CD34 والأحداث لنقش PBMCs
NSG-SGM3جاكسون13062
بارافورمالدهيد 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710
PBS 1X درجة الحموضة 7.4Gibco100-10-023
أطباق بتريفيشر العلمية08-757-28
آلة Quantistudio qPCRخزانات كاشف ThermoQS3
Costar4870
RPMI media 1640 1XGibco11875-093
حذاء يغطيفيشر العلمي17-100-911
قفازات معقمة يمكن التخلصMicroflexSUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMixInvitrogen10080-400تخليق cDNA
28-G x 1/2BD329-461
محاقن 29-G x 1/2BD324-702
Truvada (Emtricitabine و TenofovirGileadNDC 61958-0701-1الأدوية المضادة للفيروسات القهقرية لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) - مثبط النسخ التناظري نيكليوزيد
Trypan blueSigmaT8154عدد الخلايا وقابليتها للحياة
Vick Vaporubالصحة المدرسية43214مرهم يعتمد على المنثول والأوكالبتوس
درجة البيولوجيا الجزيئية للمياهالجودة البيولوجية351-029-131
الدقيقة الدقيقة مصلية علمية ممتازة متبرع واحد الأساسية uQUANT البشرية منها محاقن

المراجع

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118(2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), Basel, Switzerland. 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID "Meet the Experts" 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker's guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of "humanized" mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , Chapter 15, Unit 15.21 (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, Clifton, N.J. 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), Baltimore, Md. 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), Orlando, Fla. 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), Baltimore, Md. 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , Chapter 2 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280(2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, Suppl 2 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD34
عدوي فيروس نقص المناعة المزمنة والحاده والمعاد تنشيطها في نماذج الماوس المناعية الانسانيه
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.