توضح هذه المقالة طريقة لاستزراع وتحليل الخلايا الظهارية الكبيبية خارج الخلايا المغلفة من glomeruli معزولة عن الكلى الماوس. ويمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة المسارات التي ينطوي عليها انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Glomerular Outgrowth كما مُجرا السابق Vivo لتحليل المسارات المشاركة في تنشيط الخلية الظهارية Parietal
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية (PEC) هو أحد العوامل الرئيسية التي تشارك في تطوير وتطور تصلب الكبيمرتولوس. وبالتالي فإن تثبيط المسارات التي تشارك في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية يمكن أن يكون أداة لتكبيل تطور الأمراض الكبية. توضح هذه المقالة طريقة للثقافة وتحليل الخلايا الظهارية الجدارية خارج من كبيبات مغلفة معزولة من الكلى الماوس. بعد تشريح الكلى الماوس المعزولة ، يتم سلخ الأنسجة ، ويتم عزل الجلاميرولي عن طريق الغربلة. يتم جمع glomeruli مغلفة، ويتم استزراع glomeruli واحد لمدة 6 أيام للحصول على الخروج الكبيّة من الخلايا الظهارية الجدارية. خلال هذه الفترة، يمكن تحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة عن طريق تحديد عدد الخلايا أو المساحة السطحية للخلايا التي تتكاثر. وبالتالي يمكن استخدام هذا الفحص كأداة لدراسة آثار التعبير الجيني المتغير في الفئران المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب أو آثار ظروف الثقافة على خصائص نمو الخلايا الظهارية الجدارية والإشارة. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن دراسة مسارات مهمة تشارك في عملية تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية وبالتالي في glomerulosclerosis.
المقدمة
الأمراض الكبوية هي مجموعة هامة من اضطرابات الكلى وتمثل سببا رئيسيا للمرض الكلوي المرحلة النهائية (ESRD). لسوء الحظ، خيارات العلاج المحددة محدودة والتقدم إلى ESRD أمر لا مفر منه. يتم تعريف الأمراض الكبوية من خلال وجود إصابة glomerular ويمكن تجميعها في الأمراض الالتهابية وغير الالتهابية. على الرغم من أن الإهانة الأولية مختلفة ، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الآلية الخلوية الشائعة تؤدي إلى تضخم الخلايا الظهارية الكبيّة وفي النهاية إلى تصلب الكبيات في جميع الأمراض الكبيات ، بغض النظر عن السبب الأساسي1،2،3،4.
على وجه التحديد، فقد تبين أن الآفات الكبيبية تتكون أساسا من الخلايا الظهارية الجدارية تنشيط5،6. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تكون الخلايا الظهارية الجدارية خلايا ظهارية مسطحة هادئة تصطف كبسولة بومان من الجلجوميول. ومع ذلك، فإن أي إصابة الكبيّة إما بسبب الطفرات الوراثية (على سبيل المثال، podocyte محددة أو اعتلالات الميتوكوندريا)، أو الالتهاب أو فرط الترشيح (على سبيل المثال، الناجم عن انخفاض كتلة الكلى، وارتفاع ضغط الدم، والسمنة أو داء السكري) يمكن أن تؤدي إلى تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية تتكاثر و تودع مصفوفة خارج الخلية مما يؤدي إلى تكوين الهلال الخلوي أو الآفات الصلبة5,7,8. يؤدي تطور هذه العمليات إلى فقدان وظائف الكلى9. ولذلك، تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية هو عامل رئيسي في تطور وتطور glomerulosclerosis في كل من الأمراض الكبياتية الالتهابية وغير الالتهابية1،2،3،4،10.
والعمليات الجزيئية التي تتوسط في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. وتظهر الدراسات الحديثة أن تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية دي نوفو أعرب CD44, مستقبلات التي هي مهمة لتفعيل مسارات مختلفة تشارك في انتشار الخلوية والهجرة. وعلاوة على ذلك، تم إظهار تثبيط CD44 لمنع تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية و الحد من تطور تشكيل الهلال و glomerulosclerosis في النماذج الحيوانية من الأمراض الكبيبية غير الالتهابية وكذلك11،12.
كما تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية هو لاعب رئيسي لتطوير glomerulosclerosis وتشكيل الهلال، تثبيط هذه الخلايا يمكن أن تبطئ تطور الأمراض الكبيات. قد يؤدي توضيح المسارات الجزيئية التي تقود تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية إلى تطوير تدخلات علاجية محددة تُعَطَّن تكوين الآفات الخافتة بالضمير الكيسي وتكبيبات الدم في الأمراض الكبيات.
في النماذج الحيوانية التجريبية، من الصعب في كثير من الأحيان تقديم أدلة على التأثير المباشر للتعبير الجيني المتغير (نماذج الماوس الناتجة عن الماوس أو نماذج الماوس المعدلة وراثيا) أو العلاج من المخدرات على الخلايا الظهارية الجدارية. في الماوس خروج المغلوب التقليدية لوحظ في التغيرات الجسمية يمكن تفسيرها من خلال التغيرات المباشرة في الخلايا الظهارية الجدارية. ومع ذلك، بما أن التعبير الجيني قد تغير أيضاً في أنواع الخلايا الأخرى داخل الماوس، فلا يمكن استبعاد الآثار غير المباشرة التي تتوسط فيها أنواع الخلايا الأخرى. وقد وفرت تطوير الفئران كري لوكس المشروطة التي يقودها المروجين النشطة أساسا في الخلايا الظهارية الجداري حلا في بعض الحالات13. ومع ذلك، فإن النماذج المعدلة وراثيا المشروطة معقدة، وعلى الرغم من أن هناك خطوطا أكثر مشروطا تصبح متاحة، فإن العديد من خطوط الماوس التقليدية أو الماوس المعدلة وراثيا لا يوجد بعد بديل مشروط.
لدراسة الآثار المباشرة على الخلايا الظهارية الجدارية، وقد وضعت مجموعتنا مقايسة الجسم الحي السابق باستخدام كبيبات مغلفة واحدة معزولة عن الكلى الماوس لقياس وتحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية والهجرة. هذه الطريقة سوف تمكننا من تحديد الآثار الخاصة بالخلايا الظهارية الجدارية والعثور على مسارات مسؤولة لتنشيط الخلايا الظهارية الجدارية وخيارات العلاج الاختبار لمنع هذا التنشيط.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم إجراء جميع التجارب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة رادبود نيميغن.
ملاحظة: تم التضحية بالفئران غير المعالجة والصحية من النوع البري (WT) (n = 4) وcd44-/- (n = 4) الفئران في عمر 12-16 أسبوعاً. واستخدمت الفئران الذكور والإناث على حد سواء. كانت جميع الفئران على خلفية C57Bl/6.
1. ماوس تشريح الكلى
- التضحية الفئران WT صحية أو الفئران المعدلة وراثيا عن طريق خلع عنق الرحم.
- تشريح الكلى الماوس كله مباشرة بعد التضحية الفئران. لهذا, إجراء عملية استئصال البطن المتوسطة باستخدام مقص البطن, قطع الجلد ومن ثم عضلات البطن. إزالة الأمعاء ووضعها بجانب الماوس.
- حرّر الكلى من توصيل الأنسجة واسحب الكلى باستخدام ملقط جراحي، وقطع الشريان الكلوي والوريد الكلوي والوَلَب بالمقص.
- إزالة كبسولات الكلى من الكلى عن طريق عقد الكلى مع ملقط الجراحية وسحب قبالة كبسولة باستخدام زوج آخر من ملقط.
- ضع الكلى في طبق ثقافة 6 خلايا جيدًا (2 كليتين/بئر) تم إعداده مع 2 مل من محلول الملح المتوازن (HBSS) لكل بئر ووضع على الجليد.
2. عزل من الكبيبات من الكلى الماوس
- نقل الكلى إلى طبق بيتري 100 مم ويمرم الكلى إلى قطع صغيرة من 1−2 ملم باستخدام مشرطين. الحفاظ على قطع الكلى المفروم الرطب باستخدام 1−2 مل من HBSS.
- ضع قطع الكلى المفرومة فوق منخل معدني 300 ميكرومتر واضغط على الكلى من خلال المنخل باستخدام المكبس من حقنة 20 مل. شطف مرارا وتكرارا منخل مع HBSS في ما بين وجمع تدفق من خلال في طبق بيتري نظيفة باستخدام الأنابيب المصلية. جمع أيضا كل ما تبقى / العصي على الجانب السفلي من الغربال عن طريق كشط تشغيله مع مشرط ونقلها إلى تدفق التي تم جمعها من خلال (تجانس الكلى).
- شطف تجانس الكلى من خلال منخل 75 ميكرومتر مع HBSS. جمع تدفق من خلال وشطف بعد ذلك هذا التدفق من خلال من خلال منخل 53 ميكرومتر. غسل كل من الغربال باستخدام HBSS لإزالة جميع الهياكل الصغيرة.
ملاحظة: في هذه الخطوة يتم شطف التدفق على الرغم من ذلك فقط ولكن ليس الضغط من خلال 75 ميكرومتر و 53 ميكرومتر منخل. الغسيل مع HBSS ضروري لإزالة الحطام والهياكل الأصغر على المناخال. لذلك عادة يتم استخدام 200-300 مل من HBSS في المجموع. - جمع هياكل الكلي / المواد التي تبقى على 75 ميكرومتر و 53 ميكرومتر منخل عن طريق غسل السطح العلوي من الغربال مع متوسطة النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) تكملها 20٪ مصل عجل الجنين (FCS) ونقل المواد إلى 6-جيدا مرفقات منخفضة جدا microplate.
ملاحظة: لغسل السطح العلوي من المنخل، شطف منخل في وضع مائل (> 45 درجة) وجمع مواد الكلى على حافة منخل. يتم إثراء المواد التي تم جمعها لتغليف وكذلك كبيبات مفككة، تظهر سوى شظايا أنبوبية قليلة. glomeruli مغلفة لزجة جدا. لجمع كبيباتولي واحد، ولذلك من المهم لمنع كبيباتولي على التمسك سطح طبق بيتري أو لوحة جيدا. لتجنب الالتزام، استخدم المتوسطة مع 20% FCS واستخدم لوحات مرفقات منخفضة للغاية لهذه الخطوة.
3. زراعة من النمو الكبي
- جلب microplate مرفق منخفضة للغاية إلى المجهر ضوء مقلوب وجمع واحد مغلفة و / أو glomeruli مع ماص 20 ميكرول. تجنب الأنابيب الهياكل الأخرى والحطام. بعد جمع كبيبات واحدة في طرف الماصات، إضافة طازج DMEM المتوسطة دون جمع مواد الكلى في نفس تلميح ماصة إلى حجم 20 ميكرولتر.
- نقل الكبيبات واحد مع 20 ميكرول متوسطة DMEM إلى مركز بئر من 24 بئر خلية لوحة الثقافة واحتضان لمدة 3 ح في 37 درجة مئوية و 5٪ (v/ الخامس) CO2 للسماح مرفق من الكبيبات إلى مركز البئر. نقل لوحة بعناية لتجنب تعويم من الكبيات إلى الحدود من البئر.
- بعد 3 ح حضانة، يتم إرفاق الكبيّة إلى مركز البئر. إضافة بعناية 500 ميكرولتر من الوسط القاعدي endothelial (EBM) تكملها مع مجموعة عوامل النمو التي تحتوي على الهيدروكورتيزون، عامل النمو endothelial الإنسان، استخراج الدماغ البقري وgentamicin كبريتات amphotericin B(جدول المواد)وإضافية 5٪ (v/v) FBS و 1٪ (v/v) البنسلين /الستريبتوميسين (القلم / strep).
- ثقافة [كهميمرولي] وحيدة ل 6 أيام في 37 [ك], 5% ([ف/ف]) CO2.
ملاحظة: في غضون 6 أيام يتم تشكيل خارج التي تتكون من الخلايا الظهارية الجدارية. إذا كان أحد يهدف إلى اختبار آثار مركبات معينة أو المخدرات على الخلايا الظهارية الجدارية ينبغي أن تضاف إلى المتوسطة في غضون هذه الفترة ستة أيام.
4 - تحليل انتشار الخلايا الظهارية الجدارية
- تحليل خارج الكبيّة بعد 6 أيام. التقاط صور مجهرية باستخدام مجهر ضوئي رقمي مقلوب.
- استخدام برنامج تحليل الصور (على سبيل المثال، ImageJ/FIJI) لتحديد مساحة السطح وقطر النمو الكبي، وعدد الخلايا الخارجة أو الكبيبات التي تتفوق على النمو.
- لتحديد مساحة سطح النتف الكبيّة، افتح الـtif. ملف من نمو glomerular مع شريط مقياس في ImageJ. رسم خط مستقيم على شريط مقياس وتحديد المسافة في بكسل عن طريق النقر على تحليل وقياس (على سبيل المثال، 1 مم = 460 بكسل).
- تحديد المقياس بالنقر على تحليل، تعيين مقياس واكتب المسافة المعروفة في بكسل (على سبيل المثال ، 460) ، وأيضا اكتب المسافة المعروفة (على سبيل المثال ، 1) ووحدة الطول (على سبيل المثال ، 1 مم). انقر فوق موافق.
- تحديد النتائج التي ستظهر في جدول النتائج بالنقر على تحليل ثم تعيين القياسات. لتحديد مساحة سطح الارتجاج الكبيائي، قم بتنشيط منطقة الخيارات وتسمية العرض. انقر فوق موافق.
- لتحديد مساحة سطح الارتجاج الكبيّة، رسم اختيار حر حول الهزّة الكبوية. انقر على تحليل ثم قياس، جدول النتائج سوف يطفو على السطح في ImageJ تظهر مساحة سطح خارج النمو في مقياس تحديد سابق (انظر الخطوة 4.4، على سبيل المثال، مم2).
5. توصيف الخلية الكبوية خارج النمو
ملاحظة: لتقييم التركيب الخلوي للذرة، يتم تنفيذ تلطيخ الفلورة المناعية لعلامات الخلية الخاصة على النمو الكبيائي في t = 6 أيام.
- إزالة بعناية المتوسطة وغسل بلطف الكبيبات مرتين باستخدام الفوسفات المخزنة المالحة (PBS).
- ثبّت ل 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام 2٪ (ث / الخامس) شبهformaldehyde (PFA) تكملها مع 4٪ (ث / الخامس) السكروز في برنامج تلفزيوني وغسل بعناية 2X باستخدام برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية مع التركيز المناسب (جدول المواد) المخفف في البي بي إس -أوفين المصل الألبومين (BSA) 1٪ (الخامس / الخامس) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة حل الأجسام المضادة وغسل بعناية 3X مع برنامج تلفزيوني.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (جدول المواد) المخفف في PBS-BSA 1٪ (v/v) في الظلام لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل بعناية 3X مع برنامج تلفزيوني وجبل باستخدام 1−2 قطرات من المتوسط المتصاعد مائي مع 4′، 6-diamidino-2-فينيليندول (DAPI) لتصور النوى وتغطية البئر مع زلة غلاف مستديرة.
- التقاط صور مجهرية باستخدام مجهر الفلورسنت.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم عرض مخطط منهجي لطريقة تنفيذ مقايسة النمو الكبي في الشكل 1. ويبين الشكل 2A-D النمو الكبيبي من الكبيبات المغلفة في نقاط زمنية مختلفة كما لوحظ باستخدام المجهر الخفيف. وتظهر outgrowths في اليوم 2 و 4 و 6(الشكل 2B-D)في الثقافة بعد عزل الكبيبات من الكلى الماوس. من أجل التحقق من صحة أن الخلايا التي تتفوق هي خلايا ظهارية الجدارية ، تم أيضا عزل الكبيبات المزيلة وراثيا واس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
باستخدام البروتوكول الموضح في هذه المقالة، يمكن للمرء استخدام كبيبات مغلفة واحدة لتقييم انتشار الخلايا الظهارية الجدارية التي هي نتيجة لتنشيط خلية الظهارية الجدارية. هذا النموذج السابق vivo سوف تمكننا من دراسة مفصلة المسارات الجزيئية، والتي تشارك في تنشيط الخلايا الظهارية الجدارية. تعتمد الطريقة الموصوفة على المفهوم البسيط لتشريح الكلى وغربلة لعزل وثقافة مغلفة الكبيبات ومقارنة انتشار و / أو هجرة الخلايا الظهارية الجدارية في ظل ظروف تجريبية مختلفة. النتائج التي يمكن تحليلها بعد 6 أيام في الثقافة هي ، على سبيل المثال ، مسا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة الكلى الهولندية (منحة 14A3D104) والمنظمة الهولندية للبحث العلمي (منحة NWO VIDI: 016.156.363).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| لوحة زراعة الخلايا ذات 24 بئر | Corning Costar | ||
| anti-CD31 | BD Pharmingen | علامة الخلايا البطانية (التركيز المستخدم 1:200) | |
| دجاج مضاد للفئران Alexa 647 | Thermo Fisher | ؛ ( التركيز المستخدم 1: 200) | |
| DAPI-Fluoromount G | Southern | Biotech Mounting medium الذي يحتوي على | |
| Westburg ، EVOS FL مجهر | |||
| حمار مضاد للماعز Alexa 568 | Thermo Fisher | ؛ ( التركيز المستخدم 1: 200) | |
| الحمار المضاد للأرانب Alexa 568 | Thermo Fisher | ؛ ( التركيز المستخدم 1: 200) | |
| النسر المعدل من Dulbecco ؛ | Lonza | ||
| EBM Medium | Lonza | ||
| EBM-MV Single Quots | Kit Lonza | التي تحتوي على الهيدروكورتيزون و hEGF و GA-1000 و FBS و BBE | |
| مصل الأبقار الجنينية | Lonza | ||
| مصل عجل الجنين | Lonza | ||
| مجهر فلوري | Leica Microsystems GmbH | ||
| علامة الماعز المضادة للsynaptopodin | سانتا كروز | Podocyte (التركيز المستخدم 1: 200) | |
| Hanks'Balanced Salt Solution | Gibco | ||
| ImageJ software | FIJI 1.51n | ||
| طبق بتري | Sarstedt | حجم 100 | |
| أرنب مضاد للكلودين 1 | Abcam | الجداري علامة الخلية الظهارية (التركيز المستخدم 1:100) | |
| مركز | روزويل بارك الشامل للسرطان ، بوفالو ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية | ، مقدمة من الدكتور إي جيلمان ، علامة الخلايا | |
| الفئران المضادة ل CD44 | BD Pharmingen | الخلية الظهارية الجداري (التركيز المستخدم 1: 200) | |
| مشرط | Dahlhausen | حجم 10 | |
| غربال & nbsp ؛ | Endecotts Ltd | مقاس 300 & مايكرو; م ، 75 وميكرو ؛ م ، 53 ومايكرو ؛ م ، حقنة فولاذية | |
| BD Plastipak | الحجم: 20 مل | ||
| دقيقة مرفقة منخفضة للغاية ؛ | كورنينج كوستار | 6 آبار |
المراجع
- Fatima, H., et al. Parietal epithelial cell activation marker in early recurrence of FSGS in the transplant. Clinical journal of the American Society of Nephrology: CJASN. 7 (11), 1852-1858 (2012).
- Dijkman, H. B., et al. Proliferating cells in HIV and pamidronate-associated collapsing focal segmental glomerulosclerosis are parietal epithelial cells. Kidney International. 70 (2), 338-344 (2006).
- Kuppe, C., et al. Common histological patterns in glomerular epithelial cells in secondary focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 88 (5), 990-998 (2015).
- Dijkman, H., Smeets, B., van der Laak, J., Steenbergen, E., Wetzels, J. The parietal epithelial cell is crucially involved in human idiopathic focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 68 (4), 1562-1572 (2005).
- Smeets, B., et al. Parietal epithelial cells participate in the formation of sclerotic lesions in focal segmental glomerulosclerosis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 22 (7), 1262-1274 (2011).
- Smeets, B., et al. Tracing the origin of glomerular extracapillary lesions from parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2604-2615 (2009).
- Smeets, B., Moeller, M. J. Parietal epithelial cells and podocytes in glomerular diseases. Seminars in Nephrology. 32 (4), 357-367 (2012).
- Ryu, M., et al. Plasma leakage through glomerular basement membrane ruptures triggers the proliferation of parietal epithelial cells and crescent formation in non-inflammatory glomerular injury. The Journal of Pathology. 228 (4), 482-494 (2012).
- Eymael, J., Smeets, B. Origin and fate of the regenerating cells of the kidney. European Journal of Pharmacology. 790, 62-73 (2016).
- Smeets, B., et al. Renal progenitor cells contribute to hyperplastic lesions of podocytopathies and crescentic glomerulonephritis. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (12), 2593-2603 (2009).
- Eymael, J., et al. CD44 is required for the pathogenesis of experimental crescentic glomerulonephritis and collapsing focal segmental glomerulosclerosis. Kidney International. 93 (3), 626-642 (2018).
- Roeder, S. S., et al. Activated ERK1/2 increases CD44 in glomerular parietal epithelial cells leading to matrix expansion. Kidney International. 91 (4), 896-913 (2017).
- Appel, D., et al. Recruitment of podocytes from glomerular parietal epithelial cells. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 20 (2), 333-343 (2009).
- Yaoita, E., et al. Visceral epithelial cells in rat glomerular cell culture. European Journal of Cell Biology. 67 (2), 136-144 (1995).
- Kuppe, C., et al. Investigations of Glucocorticoid Action in GN. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 28 (5), 1408-1420 (2017).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 19 (10), 1879-1890 (2008).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
