التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

Michael Vilkhovoy; David Dai; Sandra Vadhin; Abhinav Adhikari; Jeffrey D. Varner

doi:10.3791/60329

مقالة منهجية

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

DOI:

10.3791/60329

⸱

أكتوبر 25, 2019

Michael Vilkhovoy¹ , David Dai¹ , Sandra Vadhin^*¹ , Abhinav Adhikari^*¹ , Jeffrey D. Varner¹

¹Robert Frederick Smith School of Chemical and Biomolecular Engineering, Cornell University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا قويا لقياس 40 المركبات المشاركة في استقلاب الكربون المركزي والطاقة في تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا. وديريفاتيزيد خليط التوليف الخالي من الخلايا مع الانيلين للفصل الفعال باستخدام الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة ثم تحديده كميا عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام معايير داخلية موسومة بالنظائر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو تكنولوجيا ناشئه في النظم والبيولوجيا التركيبية لإنتاج البروتينات في المختبر. ومع ذلك ، إذا CFPS هو الذهاب إلى الانتقال إلى ما وراء المختبر وتصبح واسعه النطاق والقياسية فقط في الوقت تصنيع التكنولوجيا ، يجب علينا ان نفهم حدود الأداء لهذه الانظمه. نحو هذا السؤال ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتحديد كميه المركبات 40 المشاركة في تحلل الجلوكوز ، ومسار الفوسفات خماسي ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. يستخدم الأسلوب المعايير الداخلية الموسومة مع ¹³ج-الانيلين ، في حين ان المركبات في العينة هي ديريفاتيزيد مع ¹²ج-الانيلين. وكانت المعايير والعينات الداخلية مختلطة ومحلله بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة-قياس الطيف الكتلي (LC/MS). التخلص من المركبات القضاء علي قمع الأيونات ، والسماح للقياس الدقيق لتركيزات المستقلب أكثر من 2-3 أوامر الحجم حيث كان معامل الارتباط المتوسط 0.988. وكانت خمسه من المركبات 40 غير الموسومة مع الانيلين ، ومع ذلك ، كانت لا تزال الكشف عنها في عينه CFPS وكميتها مع طريقه منحني قياسي. يستغرق التشغيل الكروماتوغرافي حوالي 10 دقائق لإكماله. معا ، قمنا بتطوير طريقه سريعة وقويه لفصل وتحديد كميات 40 المركبات المشاركة في CFPS في واحد LC/MS تشغيل. الأسلوب هو نهج شامل ودقيق لتوصيف الأيض خاليه من الخلايا ، بحيث في نهاية المطاف ، يمكننا فهم وتحسين الغلة والانتاجيه وكفاءه الطاقة من الانظمه الخالية من الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو منصة واعده لتصنيع البروتينات والمواد الكيميائية ، وهو التطبيق الذي تم حجزه تقليديا للخلايا الحية. وتستمد الانظمه الخالية من الخلايا من مستخلصات الخلايا الخام وتزيل المضاعفات المرتبطة بنمو الخلايا¹. الاضافه إلى ذلك ، يسمح CFPS للوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون تدخل جدار الخلية. ومع ذلك ، فقد افتقر إلى فهم أساسي لحدود أداء العمليات الخالية من الخلايا. الطرق عاليه الانتاجيه للقياس المستقلب هي قيمه لتوصيف الأيض وحاسمه لبناء نماذج الحسابية الايضيه²^,³^,⁴. وتشمل الأساليب الشائعة المستخدمة لتحديد تركيزات المستقلب الرنين المغناطيسي النووي (nmr) ، تحويل fourier-الطيفي الاشعه تحت الحمراء (FT-IR) ، والاختبارات القائمة علي انزيم ، والطيف الكتلي (MS)⁵^،⁶^،⁷ ^،⁸. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه الطرق محدوده بسبب عدم قدرتها علي قياس مركبات متعددة بكفاءة في ان واحد ، وغالبا ما تتطلب حجم عينه أكبر من ردود الفعل النموذجية الخالية من الخلايا. علي سبيل المثال ، يمكن غالبا استخدام الاختبارات المستندة إلى الانزيم فقط لقياس مركب واحد في التشغيل ، وتكون محدوده عندما يكون حجم العينة صغيرا ، مثل تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا (عاده ما يتم تشغيلها علي مقياس 10-15 μL). وفي الوقت نفسه ، يتطلب NMR وفره عاليه من نواتج الأيض للكشف والتقدير الكمي⁵. النسبة لأوجه القصور هذه ، توفر أساليب الفصل اللوني بالترادف مع قياس الطيف الكتلي (LC/MS) العديد من المزايا ، بما في ذلك الحساسية العالية وقدره الأنواع المتعددة في^{ان واحد في}نفس الوقت ؛ ومع ذلك ، فان التعقيد التحليلي يزيد كثيرا مع عدد وتنوع الأنواع التي يجري قياسها. ولذلك ، من المهم تطوير أساليب تحقق بالبالكامل الإمكانات العالية الانتاجيه لأنظمه LC/MS. يتم فصل المركبات في عينه بواسطة اللوني السائل وتحديدها من خلال قياس الطيف الكتلي. تعتمد اشاره المركب علي تركيزه وكفاءه التاين ، حيث يمكن ان يختلف التاين بين المركبات وقد يعتمد أيضا علي مصفوفة العينة.

ويمثل تحقيق نفس كفاءه التاين بين العينة والمعايير تحديا عند استخدام LC/MS لقياس التحاليل. وعلاوة علي ذلك ، يصبح القياس الكمي أكثر تحديا مع تنوع المستقلب بسبب تقسيم الاشاره والتغاير في تقارب البروتون والقطبية¹⁰. وأخيرا ، يمكن لمصفوفة العينة المشتركة ان تؤثر أيضا علي كفاءه تاين المركبات. لمعالجه هذه القضايا ، يمكن ان تكون الأيض ديريفاتيزيد كيميائيا ، وزيادة دقه الفصل والحساسية من قبل أنظمه LC/MS ، في حين خفض تقسيم الاشاره في وقت واحد في بعض الحالات¹⁰^،¹¹. اشتقاق الكيميائية يعمل عن طريق وضع علامات مجموعات وظيفية محدده من الأيض لضبط خصائصها الفيزيائية مثل تهمه أو هيدروفوبيسيتي لزيادة كفاءه التاين¹¹. يمكن استخدام عوامل الوسم المختلفة لاستهداف مجموعات وظيفية مختلفه (علي سبيل المثال ، الأمينات ، هيدروكسي ls ، الفوسفات ، الأحماض الكربوكسيليه ، الخ). انيلين ، واحده من هذه العوامل اشتقاق ، تستهدف مجموعات وظيفية متعددة في وقت واحد ، ويضيف مكون مسعور في جزيئات هيدروفيله ، التالي زيادة قرار الانفصال واشاره¹². للتصدي للتاثير المشترك لقمع أيون المصفوفة ، قام يانغ وزملاء البحث بتطوير تقنيه تستند إلى وضع العلامات الخاصة بالتكنولوجيا القياسية الداخلية الخاصة بالمجموعة (جسيست) حيث يتم تمييز المعايير مع نظائر الانيلين ¹³ج ومزجها مع العينة¹²^,¹³. المستقلب والمعايير الداخلية المقابلة لها نفس كفاءه التاين لأنها مشتركه ، ويمكن استخدام نسبه شدتها لقياس التركيز في العينة التجريبية.

في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول للكشف عن وكميه 40 المركبات المشاركة في تحلل الجلوكوز ، والمسار الفوسفات البنتوز ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. ويستند هذا الأسلوب علي نهج جسيست, حيث استخدمنا ¹²ج-الانيلين و ¹³ج-الانيلين لوسم, كشف, وقياس الأيض باستخدام عكس المرحلة LC/MS. وامتدت المجموعة الخطية لجميع المركبات 2-3 أوامر الحجم بمعامل ارتباط متوسطه 0.988. التالي ، فان الأسلوب هو نهج قوي ودقيق لاستجواب الأيض خاليه من الخلايا ، وربما مقتطفات خليه كامله.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اعداد الكواشف لوضع العلامات الانيلين

اعداد محلول انيلين 6 م في 4.5 pH. العمل في هود ، والجمع بين 550 μL من الانيلين مع 337.5 μL من المياه LCMS الصف و 112.5 μL من حمض الهيدروكلوريك 12 م (HCl) في أنبوب الطرد المركزي. دوامه جيدا وتخزين في 4 درجه مئوية.
ملاحظه: يمكن تخزين الانيلين في 4 درجه مئوية لمده شهرين.
تحذير: الانيلين شديد السمية ويجب ان يعمل معه في غطاء الدخان. حمض الهيدروكلوريك هو تاكل للغاية
اعداد محلول انيلين 6 م ¹³ج في 4.5 pH. الجمع بين 250 ملغ من ¹³ج₆-انيلين مع 132 μl من الماء و 44 Μl من 12 م HCl. دوامه جيدا وتخزين في 4 درجه مئوية.
اعداد 200 ملغ/مل N-(3-ديميثيلامينوبروبيل)-ن-ايثيل كربوديوميد هيدروكلوريد (أدك) الحل. تذوب 2 ملغ من أدك في 10 μL من الماء لكل عينه ليتم الموسومة ودوامه جيدا.
ملاحظه: يجب اعداد حل أدك في نفس يوم رد الفعل. تعمل أدك كمحفز لاشتقاق المركبات مع الانيلين¹².

2-اعداد المعايير

جعل حلول الأسهم منفصلة من جميع المركبات المذابة في LC/MS الصف المياه (الجدول 1).
اعداد حل المخزون القياسي الداخلي
1. الجمع بين جميع المركبات باستثناء نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد (NAD) ، نيكوتيناميد ادينين دينوكليوتيد الفوسفات (NADP) ، فلافين ادينين دينوكليوتيد (بدعه) ، انزيم اسيتيل A (ACA) ، والجلسرين 3-الفوسفات (Gly3P) ، مع وحدات التخزين المناسبة إنشاء حل الأسهم 2 مم من جميع المركبات.
الجمع بين NAD ، NADP ، بدعه ، ACA ، و Gly3P مع وحدات التخزين المناسبة لإنشاء حل الأسهم 2 مم.

3-اعداد العينة (الشكل 1)

إخماد ويعجل البروتينات في رد فعل تخليق البروتين خاليه من الخلايا عن طريق أضافه كميه متساوية من الجليد البارد 100 ٪ الايثانول إلى رد الفعل. الطرد المركزي العينة في 12,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 ° c. نقل ماده طافي إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد.
ملاحظه: يمكن تخزين عينات في-80 درجه مئوية في هذه المرحلة وتحليلها في وقت لاحق

4. وضع العلامات رد فعل

تسميه عينه مع ¹²ج-الانيلين الحل
1. نقل 6 μL من عينه في أنبوب الطرد المركزي الجديد وجعل حجم إلى 50 μL مع الماء.
  ملاحظه: حجم نموذج وحده التخزين قد تعتمد علي رد فعل CFPS محدده.
2. أضافه 5 μL من 200 mg/mL الحل أدك.
3. أضافه 5 μL من ¹²C-حل الانيلين.
  ملاحظه: الحل الانيلين يفصل إلى مرحلتين. تخلط جيدا قبل أضافه إلى رد الفعل.
4. دوامه رد فعل مع اهتزاز لطيف لمده 2 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
5. بعد 2 ح ، وأزاله الأنابيب من شاكر وأضافه 1.5 μl من ثلاثي الايثيلامين (الشاي) إلى رد فعل في غطاء الدخان.
  ملاحظه: تريثيلاميني يرفع درجه الحموضة من الحل الذي يوقف تفاعل العلامات الانيلين ويستقر المركبات.
  تحذير: تريثيلاميني سمي ويسبب تهيج العينين والجهاز التنفسي.
6. الطرد المركزي في 13,500 x g لمده 3 دقائق.
وصف المعايير الداخلية مع ¹³ج-حل الانيلين
1. تمييع حل الأسهم الداخلية إلى 80 μM مع حجم النهائي من 50 μL.
  ملاحظه: يمكن تعديل تركيز المعايير الداخلية إلى مستويات قريبه من العينة التجريبية.
2. أضافه 5 μL من 200 mg/mL الحل أدك.
3. أضافه 5 μL من ¹³C-حل الانيلين.
4. دوامه رد فعل مع اهتزاز لطيف لمده 2 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
5. بعد 2 ح ، وأزاله الأنابيب من شاكر وأضافه 1.5 μL من الشاي إلى رد فعل في غطاء الدخان.
6. الطرد المركزي في 13,500 x g لمده 3 دقائق.
الجمع بين الموسومة القياسية الداخلية وعينه الموسومة
1. مزيج 25 μL من ¹²ج-الانيلين المسمي عينه مع 25 μl من ¹³ج-الانيلين المسمي القياسية.
2. نقل إلى قارورة لصناعه السيارات في العينات وتحليلها من قبل LC/MS الاجراء.
إنشاء منحني قياسي لنواتج الأيض غير الموسومة
1. محلول الأسهم تمييع من الأيض غير الموسومة (NAD ، NADP ، بدعه ، ACA ، و Gly3P) إلى تركيزات النهائية من 320 μM ، 80 μM ، 20 μM و 5 μM مع حجم 50 μL.
2. أضافه 5 μL من 200 mg/mL الحل أدك.
3. أضافه 5 μL من ¹²C-حل الانيلين.
4. دوامه رد فعل مع اهتزاز لطيف لمده 2 ساعة في درجه حرارة الغرفة.
5. بعد 2 ح ، وأزاله الأنابيب من شاكر وأضافه 1.5 μL من الشاي إلى رد فعل في غطاء الدخان.
6. الطرد المركزي في 13,500 x g لمده 3 دقائق.
7. نقل ماده طافي إلى قارورة لصناعه السيارات في العينات وتحليلها من قبل LC/MS الاجراء.
  ملاحظه: الأيض غير الموسومة تتبع نفس الاجراء مثل العينة للنسخ المتماثل نموذج مصفوفة من أجل الحفاظ علي كفاءه التاين مماثله.

5. اعداد LC/MS الاجراء

اعداد المذيبات
1. اعداد محلول مائي ثلاثي butylamine (الذي تم تعديله) بمعدل 5 مم لدرجه الحموضة 4.75 مع حمض الخليك.
  ملاحظه: يساعد التالية في مرحله المحمول التحليلات تحقيق دقه جيده والانفصال¹⁴.
2. اعداد 5 مم التالية في اسيتلونيتريل (ACN).
3. اعداد المذيبات يغسل مع 5 ٪ المياه و 95 ٪ ACN.
4. اعداد المذيبات تطهير مع 95 ٪ المياه و 5 ٪ ACN.
اعداد شروط MS
1. تعيين مطياف كتله إلى وضع أيون السلبية مع درجه حرارة المسبار 520 درجه مئوية ، والجهد الشعرية السلبية من-0.8 kV ، والجهد الشعرية الايجابيه من 0.8 kV ، وتعيين البرنامج للحصول علي البيانات في 5 نقاط/ثانيه.
2. تعيين التسجيلات الايونيه المحددة (SIR) لكل المستقلب مع الفولتية مخروط محدده والكتلة علي تهمه (م/ض) القيم. انظر الجدول 1.
تهيئه LC/MS وفقا لتعليمات الشركة المصنعة
1. خطوط رئيسيه المذيبات في مدير المذيبات لمده 3 دقائق.
2. رئيس المذيبات غسل (5 ٪ المياه ، 95 ٪ ACN) وتطهير المذيبات (95 ٪ المياه ، 5 ٪ ACN) لمده 15 ثانيه لمده 5 دورات.
3. تعيين مدير العينة إلى 10 درجه مئوية.
4. تثبيت C18 (1.7 μm ، 2.1 مم × 150mm) العمود وتهيئه العمود مع 100 ٪ ACN في 0.3 mL/min لمده 10 دقيقه.
5. شرط العمود في 95 ٪ المياه و 5 ٪ ACN في 0.3 mL/min لمده 10 دقيقه قبل إدخال المذيبات مع المخازن المؤقتة.
6. شرط العمود في 95 ٪ المذيبات A (5mM الماء الصالح لل الماء ، والرقم الهيدروجيني 4.75) و 5 ٪ المذيبات B (5 مم التالية في ACN) في 0.3 mL/min لمده 10 دقيقه.
7. اعداد بروتوكول التدرج مع الشطف بدءا من 95 ٪ المذيبات A و 5 ٪ المذيبات B ، ورفعت إلى 70 ٪ المذيبات B في 10 دقيقه ، ورفعت إلى 100 ٪ المذيبات B في 2 دقيقه وعقد في 100 ٪ المذيبات ب لمده 3 دقائق. العودة إلى الظروف الاوليه (95 ٪ المذيبات ، 5 ٪ المذيبات ب) أكثر من 1 دقيقه وعقد لمده 9 دقائق لأعاده تتوازن العمود.
8. شرط العمود مع بروتوكول التدرج 3 مرات قبل اي حقن علي العمود.
عينه الحقن والمعايير
1. حقن 5 μL من العينة في العمود والحصول علي كثافة الأيونات m/z المناسبة ل ¹²C-انيلين عينه الموسومة.
2. حقن 5 μL من نفس العينة مره أخرى ، ولكن هذه المرة الحصول علي كثافة الأيونات م/ز ل ¹³ج-انيلين الموسومة المعايير.
  ملاحظه: لدينا LC/MS النظام غير قادر علي الحصول علي كل من ¹²c و ¹³c m/z كثافة في الإطارات الزمنيه المحددة السير ، لأنه هو الكثير من البيانات للحصول علي في الإطار الزمني المحدد. ولذلك ، فاننا حقن نفس العينة مرتين.
3. حقن معايير المستقلب غير الموسومة من ادني تركيز إلى اعلي وتسجيل كثافة الأيونات m/z المناسبة.

6-القياس الكمي

إنشاء أسلوب التصدير
1. في برنامج الحصول علي البيانات ، حدد ملف ≫ أسلوب جديد ≫ طريقه التصدير.
2. حدد اسم ملف ، مثل AnilineTagging_Date.
3. تحقق من ملف التصدير ASCII واختر دليلا لتصدير الملف النصي اليه.
4. في نوع التقرير، حدد ملخص حسب الكل.
5. في المحددات ، للعمود حدد a ،. للصف، حدد [cr] [if].
6. في الجدول، حدد تصدير ثم قم بتحرير الجدول لتضمين سامبلينامي والمساحة والارتفاع والمقدار والوحدات.
7. حفظ طريقه التصدير.
قياس نواتج الأيض مع المعايير الداخلية باستخدام برمجيات الحصول علي البيانات
1. ضمن علامة التبويب مجموعات العينة ، انقر بزر الماوس الأيمن علي تشغيل LC/MS المطابق وحدد عرض ك> قنوات.
2. حدد جميع قنوات SIR ل ¹³C-الانيلين المعايير الداخلية لحقنه واحده ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد مراجعه.
3. إذا لم يظهر اطار " تخطيط أسلوب معالجه LC " تلقائيا ، انتقل إلى عرض ≫ تخطيط أسلوب معالجه.
4. في معالجه تخطيط الأسلوب، انتقل إلى علامة التبويب التكامل وتعيين apااكسكتاك خوارزميه.
5. انتقل إلى علامة التبويب تجانس وتعيين نوع إلى يعني ومستوي تجانس إلى 13.
  ملاحظه: يمكن تحديد اي مستوي تجانس ، طالما انه متناسقة عبر كافة العينات.
6. في علامة التبويب قناه ms ، قم بتعطيل معالجه ms ثلاثية الابعاد .
7. في نافذه قناه SIR ، ودمج كل الذروة ، قناه واحده في كل مره. بمجرد تكامل الذروة ، انتقل إلى خيارات ≫ تعبئة من النتيجة سيتم ملء تفاصيل الذروة في علامة التبويب المكونات . تغيير اسم الذروة إلى اسم مركب المطابق.
8. مره واحده وقد تم تقييم جميع قنوات SIR ، حفظ طريقه المعالجة وإغلاق النافذة.
9. حدد جميع قنوات السير من ¹³ج-الانيلين و ¹²ج-الانيلين عينه الموسومة ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عمليه.
10. تحقق من مربع العملية ، وحدد استخدام أسلوب المعالجة المحدد، واختر طريقه المعالجة التي تم حفظها للتو. أيضا التحقق من مربع التصدير ، حدد استخدام أسلوب التصدير المحدد واختيار طريقه التصدير المحفوظة التي تم إنشاؤها سابقا. انقر فوق موافق.
11. افتح الملف النصي الذي تم تصديره مع Excel واحسب تركيز المركب غير المعروف باستخدام:
  
  حيث C_{x ، وانا} هو تركيز عينه غير معروفه ل المستقلب i ، a_{x ، وانا} هو المنطقة المتكاملة من المستقلب غير معروف ط ،_{std ، وانا}هو منطقه متكاملة من المعيار الداخلي من المستقلب ط ، C_{std ، وانا} تركيز المعيار الداخلي من المستقلب ط ، و D هو عامل التخفيف.
قياس نواتج الأيض غير الموسومة بمنحني قياسي
1. ضمن علامة التبويب مجموعات العينة ، انقر بزر الماوس الأيمن علي تشغيل LC/MS المطابق وحدد عرض ك> القناات.
2. حدد جميع قنوات السير للمعايير غير الموسومة من حقنه واحده ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد مراجعه.
3. إذا لم يظهر اطار " تخطيط أسلوب معالجه LC " تلقائيا ، انتقل إلى عرض ≫ تخطيط أسلوب معالجه.
4. في "تخطيط أسلوب المعالجة" ، انتقل إلى علامة التبويب تكامل وقم بتعيين Apااكسكتاك خوارزميه.
5. انتقل إلى علامة التبويب تجانس وتعيين نوع إلى يعني ومستوي تجانس إلى 13.
  ملاحظه: يمكن تحديد اي مستوي تجانس ، طالما انه متناسقة عبر كافة العينات.
6. في علامة التبويب قناه ms ، قم بتعطيل معالجه ms ثلاثية الابعاد .
7. في نافذه قناه SIR ، ودمج كل الذروة ، قناه واحده في كل مره. بمجرد تكامل الذروة ، انتقل إلى خيارات ≫ تعبئة من النتيجة سيتم ملء تفاصيل الذروة في علامة التبويب المكونات . تغيير اسم الذروة إلى اسم مركب المطابق.
8. مره واحده وقد تم تقييم جميع قنوات SIR ، حفظ طريقه المعالجة وإغلاق النافذة.
9. ضمن علامة التبويب مجموعات العينة ، انقر بزر الماوس الأيمن علي مجموعه عينه وحدد تغيير العينة.
10. حدد المبلغ في النافذة الجديدة.
11. حدد نسخه من أسلوب العملية واختر طريقه العملية التي تم حفظها للتو.
12. ادخل تركيز كل المستقلب لكل قنينة وادخل الوحدة ك < μM لكل مكون (أو الوحدة المقابلة) وحدد OK.
13. حدد مجموعه العينات مره أخرى ، انقر بزر الماوس الأيمن ، عرض ك> القناات.
14. حدد جميع قنوات السير من الأيض غير الموسومة للمعايير ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عمليه.
15. تحقق من مربع العملية واختر استخدام أسلوب معالجه محدد. حدد طريقه المعالجة المناسبة ثم انقر فوق موافق.
16. حدد قنوات السير لجميع نواتج الأيض غير الموسومة للعينات ، انقر بزر الماوس الأيمن وحدد عمليه.
17. تحقق من مربع العملية ، وحدد استخدام أسلوب معالجه محدد ، واختر طريقه المعالجة التي تم حفظها للتو. أيضا التحقق من تصدير مربع ، حدد استخدام طريقه التصدير المحددة واختيار طريقه التصدير المحفوظة التي تم إنشاؤها في وقت سابق. انقر فوق موافق.
18. قياس الأيض غير الموسومة مع المنحني القياسي وتصدير النتائج إلى ملف نصي إلى الدليل المحدد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كدليل علي المفهوم ، استخدمنا البروتوكول لقياس نواتج الأيض في نظام CFPS القائم علي كولاي الذي يعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (gfp). وكان رد فعل CFPS (14 μL) مروي و deبروتينيه مع الايثانول. ثم تم المفتاحية عينه CFPS مع ¹²ج-الانيلين, في حين تم الموسومة المعايير مع ¹³ج-الانيلين. ثم جمعت العينة المعلمة والمعايير وحقنت في LC/MS (الشكل 1). وقد كشف البروتوكول و40 نواتج الأيض المستخدمة في استقلاب الكربون المركزي والطاقة باستخدام المعايير الداخلية ، في حين تم أيضا وضع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنظمه خاليه من الخلايا ليس لديها جدار الخلية ، التالي هناك امكانيه الوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون الحاجة إلى اعداد عينه معقده. غير انه لم ينجز سوي القليل جدا من العمل لوضع بروتوكولات شامله وقويه لاجراء الاستجواب الكمي لنظم رد الفعل الخالي من الخلايا. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير طريقه سريعة وقويه لقياس الأيض في مخاليط التفاعل الخالي من الخلايا وربما في مقتطفات الخلايا الكاملة. التحديد الكمي الفردي لنواتج الأيض في الخلائط المعقدة ، مثل تلك الموجودة في ردود الفعل الخالية من الخلايا ، أو مقتطفات الخلايا الكاملة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل الموصوف من قبل المركز علي فيزياء استقلاب السرطان من خلال الجائزة رقم 1U54CA210184-01 من المعهد الوطني للسرطان (https://www.cancer.gov/). المحتوي هو فقط مسؤوليه المؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة. ولم يكن لدي الممولين اي دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، واتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو اعدادها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
12C أنيلين	سيجما ألدريتش	242284	أنيلين 12C
13C أنيلين يسمى	سيجما ألدريتش	485797	أنيلين 13C6
3-حمض الفوسفوجليسيريك	سيجما ألدريتش	P8877	3PG
حمض الخليك	فيشر AC222140010 ساينتفيك		أسيتونيتريل
، LCMS	JT BAKER	9829-03	ACN
أستيل أنزيم A	سيجما ألدريتش	A2056	ACA
Acquity UPLC BEH C18 1.7 & mu ؛ م ، 2.1 × 150 مم عمود	المياه	186002353	عمود
ثنائي فوسفات الأدينوزين	سيجما ألدريتش	A2754	ADP
الأدينوسين أحادي الفوسفات	سيجما ألدريتش	A1752	أمبير
أدينوزين ثلاثي الفوسفات	سيجما ألدريتش	A2383	ATP
ألفا كيتوجلوتارات	سيجما ألدريتش	K1128	aKG
سترات	سيجما ألدريتش	251275	CIT
سيتيدين ثنائي فوسفات	سيجما ألدريتش	C9755	CDP
سيتيدين أحادي الفوسفات	سيجما ألدريتش	C1006	CMP
سيتيدين ثلاثي الفوسفات	سيجما ألدريتش	C9274	CTP
D-glyceraldehyde 3-فوسفات	سيجما ألدريتش	39705	جاب
إريثروز 4-فوسفات	سيجما ألدريتش	E0377	E4P
الإيثانول	سيجما ألدريتش	EX0276	EtOH
فيشر العلمي أكوسبين مايكرو 17 الطرد المركزي	فيشر الطرد المركزي العلمي
فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد	سيجما ألدريتش	F6625	FAD
الفركتوز 1،6-ثنائي الفوسفات	سيجما ألدريتش	F6803	F16P
الفركتوز 6-الفوسفات	سيجما ألدريتش	F3627	F6P
فومارات	سيجما ألدريتش	F8509	FUM
غلوكونات 6-فوسفات	سيجما ألدريتش	P7877	6PG
الجلوكوز	سيجما ألدريتش	G8270	GLC
الجلوكوز 6-فوسفات	سيجما ألدريتش	G7879	G6P
الجلسرين 3-فوسفات	سيجما ألدريتش	G7886	Gly3P
فوسفات الجوانوزين	سيجما ألدريتش	G7127	الناتج المحلي الإجمالي
أحادي فوسفات الجوانوزين	سيجما ألدريتش	G8377	GMP
جوانوزين ثلاثي الفوسفات	سيجما ألدريتش	G8877	GTP
حمض الهيدروكلوريك	سيجما ألدريتش	258148	هيدروكلوريك هيدروكلوريك
	سيجما ألدريتش	I1252	ICIT
لاكتات	سيجما ألدريتش	L1750	لاك
مالات	سيجما ألدريتش	02288	مل
myTXTL - سيجما 70 ماستر ميكس كيت	أربور بوسيساينسز	507024	تخليق البروتين الخالي من الخلايا
N- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) -N & برايم ؛ -إيثيل كاربوديميد هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش	03449	EDC
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد	سيجما ألدريتش	43410	NAD
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات	سيجما ألدريتش	N5755	NADP
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات مختزل	سيجما ألدريتش	481973	NADPH
نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد المخفض	سيجما ألدريتش	N8129	NADH
أوكساليسيتات	سيجما ألدريتش	O4126	OAA
فوسفوينول بيروفات	سيجما ألدريتش	P0564	PEP
بيروفات	سيجما ألدريتش	P5280	PYR
ريبوز 5 فوسفات	سيجما ألدريتش	R7750	R5P
ريبولوز 5-فوسفات	كربو سينث	MR45852	RL5P
سيدوهيبتولوز 7 فوسفات	كاربوسينث	MS07457	S7P
سكسينات	سيجما ألدريتش	S3674	SUCC
Tributylamine	Sigma-Aldrich	90780	TBA
Triethylamine	FisherScientific	O4884	TEA
مياه فائقة النقاء	فيشر Scientific	10977-015	ماء
يوريدين ثنائي فوسفات	سيجما ألدريتش	U4125
UDP أوريدين أحادي فوسفات	سيجما ألدريتش	U6375	UMP
يوريدين ثلاثي الفوسفات	سيجما ألدريتش	U6625	UTP
VWR الثقيلة دوامة	VWR		دوامة
المياه ، LCMS	JT BAKER	9831-03
مياه المياه Acquity H UPLC فئة الرباعي مدير المذيبات	المياه LCMS
المياه Acquity H UPLC فئة مدير عينة FTN	Waters		LCMS
كاشف أكويتي كيو دي إيه	للمياه المياه		LCMS
المياه إمباور 3	برامج
المياه LCMS إجمالي الاسترداد قارورة		المياه 186000384c	LCMS قارورة

ثنائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012(2017).
Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LC MS

التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة