المقدمة هنا هو بروتوكول لدراسة الاستجابات الدوائية في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. العضوية تشبه بشكل وثيق في علم الاحياء الحيوي وتلخيص علم الوراثة المريض ، مما يجعلها نظم نموذج جذابة. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من البروستات البرية ، ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الثقافات Organoid البروستاتا كاداات لترجمه الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية إلى الاستجابات الدوائية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المعروض هنا هو بروتوكول لدراسة دوائي ، والخلايا الجذعية المحتملة ، والتمايز السرطان في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. البروستاتا العضوي هي الاندروجين استجابه ، ثلاثية الابعاد (3D) الثقافات المزروعة في المتوسطة المحددة التي تشبه ظهاره البروستاتا. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من النوع البري ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة. الأهم من ذلك ، المريض العضوي المشتقة يشبه بشكل وثيق الأورام في علم الوراثة والبيولوجيا الورم الجسم الحيوي. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان يكون التلاعب العضوي وراثيا باستخدام CRISPR/كاس 9 ونظم شرانا. هذه الوراثة الخاضعة للرقابة تجعل الثقافة العضوية جذابة كمنصة للاختبار السريع لأثار الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية علي الاستجابات الدوائية. ومع ذلك ، يجب ان تتكيف البروتوكولات التجريبية علي وجه التحديد مع الطبيعة ثلاثية الابعاد للثقافات العضوية للحصول علي نتائج قابله للتكرار. الموصوفة هنا هي بروتوكولات مفصله لأداء اختبارات البذر لتحديد قدره تشكيل العضوية. وفي وقت لاحق ، يظهر هذا التقرير كيفيه اجراء العلاجات الدوائية وتحليل الاستجابة الصيدلانية عن طريق قياسات القدرة علي البقاء ، وعزل البروتين ، وعزل الجيش النيبالي الريبي. وأخيرا ، يصف البروتوكول كيفيه تحضير العضو العضوي لتطعيم الجسم وبعد ذلك في اختبارات النمو المجرية باستخدام التطعيم تحت الجلد. وتسفر هذه البروتوكولات عن بيانات عاليه الاستنساخ وتنطبق علي نطاق واسع علي نظم الثقافة ثلاثية الابعاد.
المقدمة
مقاومه المخدرات هي واحده من المشاكل السريرية الرئيسية في علاج السرطان. ويوجه العلاج سرطان البروستاتا المنتشر (PCa) في المقام الأول علي محور الإشارات الاندروجين. الجيل التالي من العلاجات المضادة للالاندروجين (علي سبيل المثال ، enzalutamide و abiraterone) وقد أظهرت نجاحا كبيرا السريرية ، ولكن تقريبا جميع الانيسول الخماسي الكلور في نهاية المطاف تتقدم نحو دوله مستقله الاندروجين ، أو التطهير البروستات المقاوم للسرطان (CRPC).
كشفت الجينوم الحديثة والتنميط الناسخ من CRPC هناك ثلاث أليات عامه للمقاومة في سرطان البروستاتا: 1) تنشيط الطفرات الناتجة عن استعاده مستقبلات الاندروجين (AR) يشير1; 2) تفعيل الإشارات التفافيه ، كما هو ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم القيام بجميع الاعمال الموصوفة في هذا البروتوكول مع الهيكل العضوي المنشا سابقا والعضوية المشتقة من المريض. تم تنفيذ جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للبحوث مركز الموارد الحيوانية من النصب التذكاري سلون كيتيرنج مركز السرطان (IACUC: 06-07-012). تم جمع جميع الانسجه المستمدة من المرضي وفقا للقواعد والانظمه الخاصة بمركز السرطان التذكاري سلون كيتيرنج (الهجرة: 12001).
1. الاعداد المتوسطة والعازلة
- ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي (علي سبيل المثال ، الحاكم) في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها قبل بدء التجربة. يبقيه علي الجليد اثناء الاستخدام.
- وضع لوحات الثقافة في 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة قبل التجارب. وهذا سوف يساع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
كفاءه البذر
يتم تحديد القدرة علي تشكيل organoid من النمط الظاهري والنمط الجيني. البرية من نوع (WT) وأظهرت الخلايا القاعدية البروستاتا متفوقة تكوين العضوية القدرة (30 ٪-40 ٪) مقارنه بخلايا الاناره (3%) (الشكل 1ا). بعد التاسيس العضوي ، زادت قدره التشكيل بشكل جذري. عاده ، 25 ٪-30 ٪ من الخلايا المستمدة من organoid WT يمكن ان تشكل organoid جديده (الشكل 1ب). وأديت الخسارة الناجمة عن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
فهم أليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومه الاندروجين المضادة واكتشاف الثغرات العلاجية المحتملة يتطلب اختبار الاستجابات الدوائية في أنظمه نموذجيه محاكاة سرطان البروستاتا. وصف هنا هو بروتوكول مفصل لتحليل موثوق بها من الاستجابات الدوائية في البروستاتا المستمدة من المريض والمهندسة وراثيا واعداد هذه العينات organoids للتطبيقات المصب.
وهناك خطوتان حاسما الاهميه في هذا البروتوكول. الأول هو تحديد كفاءه البذر ومعدل النمو من العضوي. تختلف سرعه النمو organoid بشكل كبير. وهذا يعتمد علي الأنواع ، كما ينمو اله.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعمل في مجلس أداره شركه نوفارتس. هو المؤسس المشارك للمستحضرات الصيدلانية والمخترع المساعد ل enzalutamide و apalutamide. هو مستشار العلوم إلى اجيوس ، Beigene ، مخطط ، مجموعه العمود ، Foghorn ، منزل فارما ، Nextech ، KSQ ، البتراء ، و PMV ؛ وهو مؤسس المشارك Seragon ، التي تم شراؤها من قبل Genentech/Roche في 2014. W.R.K. هو المخترع المشارك وصاحب براءات الاختراع من التكنولوجيا organoid.
شكر وتقدير
ويدعم ك من قبل المعاهد القومية للصحة 1F32CA236126-01. C.L.S. التي تدعمها المذكرة ؛ CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; وستار السرطان كونسورتيوم. W.R.K. معتمد من قبل مؤسسه السرطان الهولندية/KWF Buit 2015-7545 ومؤسسه سرطان البروستاتا PCF 17YOUN10.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| A83-01 | Tocris | 2939 | مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 200 نانومتر |
| تقنيات ADMEM / F12 | Gibco / Life | 12634028 | المكون العضوي المتوسط |
| B27 | Gibco / Life تقنيات | 17504-044 | عضوية متوسطة |
| لوحات زراعة الخلايا | فيشر | 657185 | |
| خلية Titer Glo | Promega | G7571 | |
| DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 1 نانومتر |
| DMSO | Fisher | BP231-100 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل للفأر ، 5 نانوغرام / نيولتر للإنسان |
| FGF10 | Peprotech | 100-26 | مكون وسيط عضوي خاص بالإنسان: التركيز النهائي 10 نانوغرام / مل |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | مكون عضوي محدد للإنسان المتوسط: التركيز النهائي 5 نانوغرام / مل |
| تقنيات Glutamax | Gibco / Life | 35050079 | مكون عضوي متوسط |
| HEPES | مصنوع داخليا | N / A | مكون متوسط عضوي: التركيز النهائي 10 ملي |
| مولار Matrigel (انخفاض عامل النمو & خالي من الفينول الأحمر) | Corning | CB-40230C | مكون عضوي متوسط |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 1.25 ملي مولار |
| نيكوتيناميد | سيجما-ألدريتش | N0636 | مكون وسيط عضوي خاص بالإنسان: التركيز النهائي 10 ملي مولار |
| NOGGIN | Peprotech أو خلايا 293 طن مستقرة مع بنية Noggin (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 10٪ وسط مكيف أو 100 نانوغرام / مل |
| البنسلين / الستربتافيدين | الجوزاء المنتجات الحيوية | 400-109 | |
| مثبطات الفوسباتاز | المكون ميرك ميليبور | 524629 | |
| البروستاجلاندين E2 | توكرس | 3632464 | |
| مثبطات البروتياز | ميرك ميليبور | 539131 | |
| R-SPONDIN | Peprotech أو خلايا مستقرة منقولة 293 طن مع بنية R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | مكون متوسط عضوي: التركيز النهائي 10٪ وسط مكيف أو 500 نانوغرام / مل |
| RIPA عازلة | Merck | 20-188 | |
| RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7< / أ> | متوسط عضوي خاص بالإنسان: التركيز النهائي 10 & mu ؛ M |
| TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 | المكون العضوي المتوسط: التركيز النهائي 10 & mu ؛ م |
المراجع
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
- Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
