يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الثقافات Organoid البروستاتا كاداات لترجمه الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية إلى الاستجابات الدوائية

9.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60346

⸱

أكتوبر 24, 2019

 ,  ,  , 
1Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Howard Hughes Medical Institute

في هذه المقالة

ملخص

المقدمة هنا هو بروتوكول لدراسة الاستجابات الدوائية في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. العضوية تشبه بشكل وثيق في علم الاحياء الحيوي وتلخيص علم الوراثة المريض ، مما يجعلها نظم نموذج جذابة. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من البروستات البرية ، ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة.

الملخص

المعروض هنا هو بروتوكول لدراسة دوائي ، والخلايا الجذعية المحتملة ، والتمايز السرطان في البروستاتا الظهاريه الغدد العضوي. البروستاتا العضوي هي الاندروجين استجابه ، ثلاثية الابعاد (3D) الثقافات المزروعة في المتوسطة المحددة التي تشبه ظهاره البروستاتا. يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من النوع البري ونماذج الماوس المهندسة وراثيا ، والانسجه البشرية حميده ، وسرطان البروستاتا المتقدمة. الأهم من ذلك ، المريض العضوي المشتقة يشبه بشكل وثيق الأورام في علم الوراثة والبيولوجيا الورم الجسم الحيوي. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان يكون التلاعب العضوي وراثيا باستخدام CRISPR/كاس 9 ونظم شرانا. هذه الوراثة الخاضعة للرقابة تجعل الثقافة العضوية جذابة كمنصة للاختبار السريع لأثار الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية علي الاستجابات الدوائية. ومع ذلك ، يجب ان تتكيف البروتوكولات التجريبية علي وجه التحديد مع الطبيعة ثلاثية الابعاد للثقافات العضوية للحصول علي نتائج قابله للتكرار. الموصوفة هنا هي بروتوكولات مفصله لأداء اختبارات البذر لتحديد قدره تشكيل العضوية. وفي وقت لاحق ، يظهر هذا التقرير كيفيه اجراء العلاجات الدوائية وتحليل الاستجابة الصيدلانية عن طريق قياسات القدرة علي البقاء ، وعزل البروتين ، وعزل الجيش النيبالي الريبي. وأخيرا ، يصف البروتوكول كيفيه تحضير العضو العضوي لتطعيم الجسم وبعد ذلك في اختبارات النمو المجرية باستخدام التطعيم تحت الجلد. وتسفر هذه البروتوكولات عن بيانات عاليه الاستنساخ وتنطبق علي نطاق واسع علي نظم الثقافة ثلاثية الابعاد.

المقدمة

مقاومه المخدرات هي واحده من المشاكل السريرية الرئيسية في علاج السرطان. ويوجه العلاج سرطان البروستاتا المنتشر (PCa) في المقام الأول علي محور الإشارات الاندروجين. الجيل التالي من العلاجات المضادة للالاندروجين (علي سبيل المثال ، enzalutamide و abiraterone) وقد أظهرت نجاحا كبيرا السريرية ، ولكن تقريبا جميع الانيسول الخماسي الكلور في نهاية المطاف تتقدم نحو دوله مستقله الاندروجين ، أو التطهير البروستات المقاوم للسرطان (CRPC).

كشفت الجينوم الحديثة والتنميط الناسخ من CRPC هناك ثلاث أليات عامه للمقاومة في سرطان البروستاتا: 1) تنشيط الطفرات الناتجة عن استعاده مستقبلات الاندروجين (AR) يشير1; 2) تفعيل الإشارات التفافيه ، كما هو مثال في نموذج ما قبل السريرية للجيل القادم المضادة للمقاومة الاندروجين المقاومة التي تنشيط مستقبلات جلوكورتيكويد (GR) يمكن ان تعوض عن فقدان الإشارات AR2؛ و 3) العملية التي تم التعرف عليها مؤخرا من اللدونة السلالة ، التي الخلايا السرطانية الحصول علي المقاومة عن طريق تحويل السلالات من نوع الخلية تعتمد علي الهدف المخدرات إلى نوع آخر من الخلايا التي لا تعتمد علي هذا (والتي ، في الانيسول الخماسي الكلور ، ويتم تمثيل السلبية و/أو مرض الغدد الصماء العصبية [nepc])3،4. ومع ذلك ، فان أليات الجزيئية التي تسبب مقاومه المخدرات ليست مفهومه. وعلاوة علي ذلك, المقاومة المكتسبة الاندروجين المضادة قد يؤدي إلى نقاط الضعف العلاجية التي يمكن استغلالها. ولذلك ، من الضروري تقييم الاستجابات الدوائية في النظم النموذجية التي تحاكي الأنماط الظاهرية للمرضي والأنماط الجينية.

البروستاتا العضوي هي ثقافات التنميط العضوي المزروعة في مصفوفة بروتين ثلاثي الابعاد مع متوسط محدد. الأهم من ذلك ، يمكن تاسيس البروستاتا العضوية من الانسجه الحميدة والسرطانية من murine أو الأصل البشري ، وانها تحتفظ السمات الظاهرية والجينية الميزات الموجودة في فيفو5،6. الأهم من ذلك ، يتم تمثيل كل من الخلايا الحساسة المضادة للالاندروجين و CRPC في الخلاصة الحالية للارغيدات. وعلاوة علي ذلك ، يتم التلاعب العضوي البروستاتا بسهوله وراثيا باستخدام CRISPR/كاس 9 و شرينا5. وهكذا ، organoids البروستاتا هي نظام نموذجي مناسب لاختبار الاستجابات المخدرات وتوضيح أليات المقاومة. هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لاجراء اختبار المخدرات وتحليل الاستجابات الدوائية باستخدام organoids البروستاتا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم القيام بجميع الاعمال الموصوفة في هذا البروتوكول مع الهيكل العضوي المنشا سابقا والعضوية المشتقة من المريض. تم تنفيذ جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للبحوث مركز الموارد الحيوانية من النصب التذكاري سلون كيتيرنج مركز السرطان (IACUC: 06-07-012). تم جمع جميع الانسجه المستمدة من المرضي وفقا للقواعد والانظمه الخاصة بمركز السرطان التذكاري سلون كيتيرنج (الهجرة: 12001).

1. الاعداد المتوسطة والعازلة

  1. ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي (علي سبيل المثال ، الحاكم) في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها قبل بدء التجربة. يبقيه علي الجليد اثناء الاستخدام.
  2. وضع لوحات الثقافة في 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة قبل التجارب. وهذا سوف يساعد علي قبة مصفوفة غشاء الطابق السفلي (يشار اليها فيما بعد بالقبة المصفوفة) لتتبلمر. ويوصف الطلاء العضوي في الخطوة 2-1-2.
  3. اعداد المتوسطة organoid وفقا للبروتوكول المعمول به5.
  4. اعداد المتوسطة organoid دون أضافه عامل نمو البشرة (EGF ؛ انظر جدول المواد للمكونات). EGF يقمع الإنتاج العابر لل AR ويضفي مقاومه ضد الاندروجين5.
  5. جهزوا النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) بمصل بقري جنيني بنسبه 10%.
    ملاحظه: يتم استخدام هذه الوسائط لمنع الهضم الانزيمي مع استبدال التريبسين في الأقسام 2-4.
  6. اعداد حلول المخدرات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ل enzalutamide/mdv3100 (يشار اليها فيما بعد باسم الجيل الثاني المضادة للالاندروجين) ، واعداد حل الأسهم من 100 μM في ثنائي ميثيل سولفوكسيد (DMSO). يمكن تخزين المخزون في-20 درجه مئوية لمده تصل إلى 6 أشهر وليس من الضرورة ان تكون طازجه.

2. العزلة ، والهضم الانزيمي ، وإنشاء الهيكل العضوي

  1. عزل البروستاتا العضوي من الماوس أو الانسجه البشرية وفقا للبروتوكولات التي سبق إنشاؤها5،7. ويرد أدناه وصف موجز لذلك.
    1. المفروم والانزيمي هضم انسجه البروستاتا لإنتاج تعليق خليه واحده. في هذه التجربة ، تم استخدام 1 مل من 5 ملغ/مل كولاجيناز النوع الثاني في ADMEM/F12 لهضم 50 ملغ من انسجه البروستاتا.
    2. جمع الخلايا عن طريق طرد في 300 x ز ل 5 دقيقه ، عد الخلايا ، وأعاده التعليق عليها في مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، ولوحه في كثافة المناسبة5،7 في القباب مصفوفة علي لوحات الثقافة العضوية قبل حرارة (الطلاء يتم عرض الأسلوب في الشكل 1ا).
    3. السماح لقباب لترسيخ وأضافه وسائل الاعلام علي قمم القباب بحيث يتم تغطيتها بالبالكامل.
  2. تنمو organoids إلى الكمية المطلوبة للتطبيقات المصب. يمكن تحديد رقم الخلية بواسطة أساليب العد القياسية. راجع المقطع الخاص بالتطبيق الخاص بالبروتوكول للحصول علي تفاصيل اضافيه حول الكثافة.
  3. باستخدام ماصه P1000 ، ارسم المتوسطة والماصة للأعلى وللاسفل لتعطيلها. عندما يتم تعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي تماما ، نقل تعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لا تضع أكثر من 10 القباب لكل واحد 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  4. رسم قباله ماده طافي وغسل بيليه الخلية مع 5 مل من تلفزيوني. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  5. رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 4 مل من استبدال التريبسين. هضم ل 5-10 دقيقه مع اهتزاز في 37 درجه مئوية. أضف كميه متساوية من المتوسط العضوي + 10% لمنع استبدال التريبسين. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  6. رسم قباله ماده طافي وأعاده التعليق في 1 مل من تلفزيوني.
  7. تصفيه التعليق مع فلتر 40 μm لضمان تعليق خليه واحده. تحديد رقم الخلية باستخدام مقياس الكريات الدموية أو جهاز العد المكافئ.
    ملاحظه: إذا كان الحصول علي خلايا واحده قابله للحياة من الصعب استخدام الفرز تدفق للحصول علي حل خليه واحده.

3. تقييم قدره التشكيل العضوي

ملاحظه: لتحديد النسبة المئوية للخلايا التي يمكن ان تولد organoid ، يمكن اجراء فحص بذر كوكيل لإمكانات الجذعية/السلف. وتعتبر قدره التشكيل العضوي مهمة أيضا لتحديد رقم الخلية البذر لاختبارات الجدوى.

  1. تمييع تعليق الخلية التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.7 إلى 100 خلايا لكل 10 μL من التعليق باستخدام المتوسطة organoid التي تحتوي علي 10 μM رو كيناز المثبط Y-27632.
  2. نقل 1,100 الخلايا (110 μL من تعليق) إلى أنبوب مخروطي جديد.
  3. أضافه 285 μL من مصفوفة غشاء الطابق السفلي وأعاده تعليق الخلايا. وهذا سوف يؤدي إلى ~ 70 ٪ تركيز مصفوفة.
    ملاحظه: التخفيف من مصفوفة غشاء الطابق السفلي اثناء البذر يقلل إلى حد كبير من الاختلاف في حجم القبه ، الناجمة عن اللزوجة من مصفوفة البروتين.
  4. خلايا البذور في 35 μL من القباب مصفوفة في درجه حرارة 24 جيدا لوحه ، مما ادي إلى 200 الخلايا/جيدا. لوحه 3-5 نسخ متماثلة لكل عينه (انظر أيضا طريقه الطلاء في الشكل 1ا والخطوة 2-1-2).
  5. لضمان بقاء الخلايا داخل قبة المصفوفة ، اقلب الصفيحة ووضعها في حاضنه الخلايا لترسيخ مصفوفة غشاء القبو.
  6. بعد 10 دقيقه ، وأزاله لوحه من الحاضنة وأضافه المتوسطة التي تحتوي علي المثبط رو كيناز.
  7. تحديث المتوسطة كل يومين. بعد 7 أيام ، وقياس عدد من العضوية. الحفاظ علي مثبطات رو كيناز في وسائل الاعلام في جميع انحاء التجربة.
  8. عد عدد من العضوية التي أنشئت في القبه وحساب النسبة المئوية من العضوية التي تشكلت من العدد الإجمالي للخلايا مطلي (200 خلايا).
    ملاحظه: تختلف نسب التاسيس العضوي من 3%-60% اعتمادا علي نوع الخلية والنمط الجيني.

4. تحديد الاستجابات الدوائية من organoids

  1. الاستمرار من الخطوة 2.7 ، البذور 1000-10000 الخلايا في قبة مصفوفة. استخدام كفاءه تشكيل organoid وسرعه النمو كوكيل لتحديد رقم الخلية النهائية.
    ملاحظه: يتم توفير أرقام الخلايا الموصي بها في الجدول 1. استخدم ثلاثه إلى خمس نسخ متماثلة لكل حاله لكل تحليل. استخدام التركيز النهائي من 70 ٪ مصفوفة غشاء الطابق السفلي للحد من الأخطاء التي تسببها اللزوجة.
  2. البذور 35 μL من القباب مصفوفة في لوحه 24 جيدا والسماح لقباب يصلب كمافعلت في القسم 3 (انظر أيضا طريقه الطلاء في الشكل 1ا والخطوة 2-1-2). أضافه المتوسطة التي تحتوي علي المثبط رو كيناز والمخدرات المفضلة. ويمكن تطبيق هذه الطريقة علي جميع الادويه ، ولكن في هذا البروتوكول ، ويستخدم الجيل الثاني لمكافحه الاندروجين في 10 μM علي سبيل المثال. لتحديد نصف تركيز المثبطة القصوى (IC50), تنفيذ log10 تزايدي, وكعنصر تحكم, استخدام السيارة التي تم حل المخدرات.
  3. تحديث المتوسطة كل يومين أو ثلاثه أيام وتحليل organoids في اليوم 7 لتحديد الاستجابة الدوائية للدواء. قد تختلف النقاط الزمنيه بين اختيار التجربة والمخدرات.
    ملاحظه: لا يجب ان تكون الorganoids لاجراء هذه الاختبارات.
  4. للحفاظ علي الهيكل العضوي سليما ، وذلك باستخدام ماصه P1000 ، ورسم المتوسطة وماصه صعودا وهبوطا لتعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
  5. عندما يتم تعطيل مصفوفة غشاء الطابق السفلي تماما ، نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لا نقل أكثر من 10 القباب مصفوفة لكل 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  6. الطرد المركزي في 300 x ز لمده 5 دقائق. رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من تلفزيوني.
  7. أعاده التعليق العضوي في 1 مل من تلفزيوني وتعطيل العضوية باستخدام تريلوريشن وماصه الزجاج باستور.
  8. قياس عدد الأجزاء العضوية. البذور 5 ونسخ متماثلة تحتوي علي 100 أجزاء organoid كما هو موضح في الخطوة 2-1-2.
  9. اجراء فحص جدوى الخلية علي النحو المبين أدناه في القسم 7.

5. الحمض الريبي النيبالي العزلة من organoids

ملاحظه: الأساليب المتاحة تجاريا المستندة إلى العمود الغلة كميه جيده ونوعيه الحمض الريبي النيبالي. لضمان كميه جيده RNA ، استخدم الحد الأدنى من قبة واحده لكل عينه ؛ ومع ذلك ، ينصح باستخدام ثلاث قباب ، والتي يمكن المصنفة في بئر واحده من 12 لوحه جيدا.

  1. أضافه [يس-مركبتوايثانول] (1%) إلى الجلوتاثيون تحلل العازلة في مجموعه العزل RNA.
  2. رسم قباله المتوسطة من القباب غشاء الطابق السفلي التي تحتوي علي organoids وأضافه 750 μL من هذا المخزن المؤقت. ماصه للأعلى وللاسفل باستخدام ماصه P1000. تاكد من ان كل مصفوفة غشاء القبو قد تم حلها
  3. أضافه 750 μL من 70 ٪ الايثانول وتخلط عن طريق التنضيد. نقل في وقت لاحق 700 μL من الخليط إلى العمود ، الطرد المركزي في 12,000 x ز لمده دقيقه واحده ، وتكرار مع ما تبقي من lysate.
  4. اجراء يغسل وعلي العمود العلاج DNase وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. Elute RNA في 30-50 μL من المياه RNAse خاليه.
  5. قياس التركيزات باستخدام فلوميتر في OD = 260 نانومتر و 280 نانومتر وتخزين في-80 درجه مئوية أو الاستمرار في التطبيقات المصب.

6. عزل البروتين من organoids

ملاحظه: لعزل البروتين ، واعداد العازلة ريبا القياسية التي تحتوي علي مثبطات الفوسفاتيز والانزيم البروتيني (جدول المواد). ويوصي باستخدام ما لا يقل عن ثلاث قباب ، والتي يمكن المصنفة في واحده 12 جيدا.

  1. باستخدام ماصه P1000 ، ارسم الوسط من الخلية مع قباب الغشاء السفلي التي تحتوي علي الهيكل العضوي والماصة للأعلى والأسفل لتعطيل مصفوفة غشاء القبو.
  2. عندما تتعطل تماما ، نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  3. رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من الجليد الباردة. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  4. رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 4 مل من استبدال التريبسين. هضم ل 5-10 دقيقه في حين تهتز في 37 درجه مئوية.
  5. أضافه حجم متساو من المتوسطة organoid + 10 ٪ FCS لمنع استبدال التريبسين. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
    ملاحظه: ما بعد طرد ، لا يجب ان تكون مصفوفة غشاء القبو مرئية في بيليه.
  6. رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من الجليد الباردة. رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 300 μl من المخزن المؤقت تحلل باستخدام pipet P1000 ، ثم نقل إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL.
  7. احتضان علي الجليد لمده 10 دقيقه وبعد ذلك سوكاتي 2x ل 30 ثانيه كل في المياه المبردة مع درجه حرارة 4 درجه مئوية. وضع الأنبوب مره أخرى علي الجليد واجراء كميات البروتين باستخدام الأساليب القياسية.
  8. البروتين عن طريق أضافه كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) التي تحتوي علي صبغ التحميل ويغلي لمده 5 دقائق في 95 درجه مئوية. تخزين لست] في-80 درجه مئوية أو متابعه التطبيقات المتلقية للمعلومات.

7. فحص سلامه الخلايا مع العضوية

ملاحظه: يمكن تقييم قابليه الخلية للبقاء باستخدام مجموعه الفحص المتاحة تجاريا ومقياس الاناره. اعداد المخازن المؤقتة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. ويوصي بخمس نسخ متماثلة لكل حاله: واحد النسخ المتماثل يتكون من 1 35 μL الطابق السفلي غشاء قبة مصفوفة في بئر واحده من لوحه 24 جيدا.

  1. رسم قباله الوسط من الثقافة العضوية ، وتوخي الحذر لترك القباب مصفوفة سليمه.
  2. أضافه 65 μL من الاذاعه التلفزيونية وماصه صعودا وهبوطا لتعطيل قبة المصفوفة.
  3. أضافه 100 μL من الخلية المخزن المؤقت مجموعه الفحص السلامة وأعاده التعليق عن طريق التنضيد.
  4. احتضان في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 10 دقيقه مع الاهتزاز.
  5. نقل 100 μL من الخليط إلى لوحه غير شفافة مناسبه لمقياس الاناره وأداء القراءة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لفحص سلامه الخلية عده.

8. تحضير العضو العضوي لتطعيم الدهون

ملاحظه: Organoids هي أيضا قابله لتطعيم تحت الجلد في كل من الكائنات المناعية المعرضة للخطر ، وكذلك ، الفئران ايروني. لضمان ان تكون العضوية المحقونة مميزه في الجسم العضوي ، والتسمية العضوية مع التعبير الدستوري عن فلوكوفيري5. فمن المستحسن اجراء تجربه تجريبية لتطعيم باستخدام 5 × 105 خلايا إلى 2 × 106 خلايا لكل حقنه ، مع زيادات من 5 x 106 خلايا ، وكفاءه التطعيم يختلف بين خطوط organoid.

  1. باستخدام ماصه P1000 ، ارسم المتوسط والماصة للأعلى وللاسفل لتعطيل مصفوفة غشاء القبو. عندما تتعطل تماما ، نقل التعليق إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
    ملاحظه: لا تقم بنقل أكثر من 10 قباب مصفوفة لكل أنبوب مخروطي 15 مل.
  2. رسم قباله ماده طافي ويغسل مع 5 مل من تلفزيوني. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  3. رسم قباله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 4 مل من استبدال التريبسين. هضم ل 5-10 دقيقه في حين تهتز في 37 درجه مئوية.
  4. أضف حجما متساويا من المتوسط العضوي + 10% لمنع استبدال التريبسين. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  5. رسم قباله ماده طافي وأعاده التعليق في 1 مل من تلفزيوني. تصفيه التعليق مع فلتر 40 μm لضمان تعليق خليه واحده. قياس الخلايا باستخدام الأساليب القياسية.
  6. تدور وأعاده تعليق الخلايا في المثبطات التلفزيونية + رو إلى تركيز 2 × 106 خلايا لكل 100 μl (انظر الجدول 2 للخلايا تركيزات ورقم الخلية المطلقة اللازمة لتركيزات متفاوتة). استخدام كميه متساوية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتوليد تعليق 1:1. ضع التعليق علي الثلج.
  7. حقن الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية ورصد نمو الطعم باستخدام الأساليب القياسية8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كفاءه البذر
يتم تحديد القدرة علي تشكيل organoid من النمط الظاهري والنمط الجيني. البرية من نوع (WT) وأظهرت الخلايا القاعدية البروستاتا متفوقة تكوين العضوية القدرة (30 ٪-40 ٪) مقارنه بخلايا الاناره (3%) (الشكل 1ا). بعد التاسيس العضوي ، زادت قدره التشكيل بشكل جذري. عاده ، 25 ٪-30 ٪ من الخلايا المستمدة من organoid WT يمكن ان تشكل organoid جديده (الشكل 1ب). وأديت الخسارة الناجمة عن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

فهم أليات الجزيئية الكامنة وراء مقاومه الاندروجين المضادة واكتشاف الثغرات العلاجية المحتملة يتطلب اختبار الاستجابات الدوائية في أنظمه نموذجيه محاكاة سرطان البروستاتا. وصف هنا هو بروتوكول مفصل لتحليل موثوق بها من الاستجابات الدوائية في البروستاتا المستمدة من المريض والمهندسة وراثيا واعداد هذه العينات organoids للتطبيقات المصب.

وهناك خطوتان حاسما الاهميه في هذا البروتوكول. الأول هو تحديد كفاءه البذر ومعدل النمو من العضوي. تختلف سرعه النمو organoid بشكل كبير. وهذا يعتمد علي الأنواع ، كما ينمو اله...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعمل في مجلس أداره شركه نوفارتس. هو المؤسس المشارك للمستحضرات الصيدلانية والمخترع المساعد ل enzalutamide و apalutamide. هو مستشار العلوم إلى اجيوس ، Beigene ، مخطط ، مجموعه العمود ، Foghorn ، منزل فارما ، Nextech ، KSQ ، البتراء ، و PMV ؛ وهو مؤسس المشارك Seragon ، التي تم شراؤها من قبل Genentech/Roche في 2014. W.R.K. هو المخترع المشارك وصاحب براءات الاختراع من التكنولوجيا organoid.

شكر وتقدير

ويدعم ك من قبل المعاهد القومية للصحة 1F32CA236126-01. C.L.S. التي تدعمها المذكرة ؛ CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; وستار السرطان كونسورتيوم. W.R.K. معتمد من قبل مؤسسه السرطان الهولندية/KWF Buit 2015-7545 ومؤسسه سرطان البروستاتا PCF 17YOUN10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A83-01Tocris2939مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 200 نانومتر
تقنيات ADMEM / F12Gibco / Life12634028المكون العضوي المتوسط
B27Gibco / Life تقنيات17504-044عضوية متوسطة
لوحات زراعة الخلايافيشر657185
خلية Titer GloPromegaG7571
DHTSigma-AldrichD-073مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 1 نانومتر
DMSOFisherBP231-100
EGFPeprotech315-09مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 50 نانوغرام / مل للفأر ، 5 نانوغرام / نيولتر للإنسان
FGF10Peprotech100-26مكون وسيط عضوي خاص بالإنسان: التركيز النهائي 10 نانوغرام / مل
FGF2Peprotech100-18Bمكون عضوي محدد للإنسان المتوسط: التركيز النهائي 5 نانوغرام / مل
تقنيات GlutamaxGibco / Life35050079مكون عضوي متوسط
HEPESمصنوع داخلياN / Aمكون متوسط عضوي: التركيز النهائي 10 ملي
مولار Matrigel (انخفاض عامل النمو & خالي من الفينول الأحمر)CorningCB-40230Cمكون عضوي متوسط
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165مكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 1.25 ملي مولار
نيكوتيناميدسيجما-ألدريتشN0636مكون وسيط عضوي خاص بالإنسان: التركيز النهائي 10 ملي مولار
NOGGINPeprotech أو خلايا 293 طن مستقرة مع بنية Noggin (Karthaus et al. 2014)120-10Cمكون عضوي متوسط: التركيز النهائي 10٪ وسط مكيف أو 100 نانوغرام / مل
البنسلين / الستربتافيدينالجوزاء المنتجات الحيوية400-109
مثبطات الفوسباتازالمكون ميرك ميليبور524629
البروستاجلاندين E2توكرس3632464
مثبطات البروتيازميرك ميليبور539131
R-SPONDINPeprotech أو خلايا مستقرة منقولة 293 طن مع بنية R-Spondin1 (Karthaus et al. 2014)120-38مكون متوسط عضوي: التركيز النهائي 10٪ وسط مكيف أو 500 نانوغرام / مل
RIPA عازلةMerck20-188
RNA-easy minikitQiagen74104
SB202190Sigma-Aldrich152121-30-7< / أ>متوسط عضوي خاص بالإنسان: التركيز النهائي 10 & mu ؛ M
TryplEThermoFisher12605036
Y-27632SelleckchemS1049المكون العضوي المتوسط: التركيز النهائي 10 & mu ؛ م
مكونات العضوية المتوسطة مكون

المراجع

  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454(2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  3. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  4. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  5. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  6. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  8. Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
  9. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  10. Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
  11. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404(2018).
  12. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  13. Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891(2019).
  14. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  15. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  18. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  19. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  20. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  21. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  22. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

زراعة العضوانياتالاستجابة الفارماكولوجيةتحليل النمط الجينيالعلاج الدوائيمقايسة الحيويةعزل البروتينعزل الحمض النووي الريبوزيمقايسة الطعم الغريبCRISPR-Cas9
الثقافات Organoid البروستاتا كاداات لترجمه الأنماط الجينية والتشكيلات الجانبية إلى الاستجابات الدوائية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.