العزلة وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها الحديد-المحدودة المتفطره

ملخص

المتفطره السليه تظهر زيادة إنتاج وإطلاق الحويصلات خارج الخلية استجابه لظروف الحديد المنخفضة. هذا العمل تفاصيل بروتوكول لتوليد الشروط والأساليب منخفضه الحديد لتنقيه وتوصيف الحويصلات المتفطرات خارج الخلية التي صدرت استجابه لنقص الحديد.

الملخص

البكتيريا الفطرية ، بما في ذلك المتفطره السل (Mtb) ، العامل المسبب للسل البشري ، وبطبيعة الشكل الإفراج عن الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) التي تحتوي علي جزيئات نشطه من الناحية المناعية. المعرفة بشان أليات الجزيئية لتكوين الخلايا الحيوية ، ومحتوي الحويصلات ، ووظائفها في واجهه الممرض والمضيف محدوده جدا. ويتطلب التصدي لهذه المسائل إجراءات صارمة للعزل والتنقية والتحقق من صحة المركبات. في السابق ، تم العثور علي إنتاج حويصلة لتعزيز عندما تعرض m. السل لتقييد الحديد ، وهي حاله واجهتها Mtb في البيئة المضيفة. يقدم هنا بروتوكول كامل ومفصل لعزل وتنقيه المركبات الخاصة من المتفطره التي تعاني من نقص الحديد. يتم تطبيق الطرق الكمية والنوعية للتحقق من صحة المركبات الكترونيه المنقية.

المقدمة

المتفطرات الحويصلات الخارجة عن الخلية (الميمياس) هي جسيمات نانويه مرتبطة بالغشاء ، 60 − 300 نانومتر في الحجم ، والتي يطلقها بشكل طبيعي المتفطره السريعة والبطيءه النمو¹. ميقاف التي أطلقتها المتفطره المسببة للامراض تشكل اليه للتفاعل مع المضيف عن طريق البروتينات النشطة مناعيا ، والدهون ، و جليكوليبيد يفرز في طريقه مركزه ومحمية^2،3،4. لتوصيف المولود وفهم تكوينه الحيوي ووظائفه ، فان الطرق الصارمة والفعالة لتنقيه الحويصلة والتحقق منها حاسمه. حتى الآن ، تم عزل المولودين من الترشيحات الثقافية من المتفطره المزروعة في وسط غني بالحديد^{1،5،6،7،8}.

ومع ذلك ، أظهرت الاعمال السابقة ان الحد من الحديد يحفز إلى حد كبير الإفراج عن حويصلة في Mtb ، ربما للتقاط الحديد عن طريق المتفابط ، وهو فلكي يفرز في ميسيس⁹. وعلي الرغم من ان إجراءات عزل المولود من Mtb المستزرعة في وسط الحديد العالي قد وصفت ، فانه لم يتم الإبلاغ عن منهجيه فعاله للحصول علي المولودين من ثقافات الحديد المنخفضة. ولذلك ، فان الهدف من هذه الطريقة هو عزل وتنقيه وقياس الميس التي تم الحصول عليها من ثقافات الحديد المنخفضة بحيث يمكن استخدامها لاختبارات الكيمياء الحيوية والوظيفية ولتحليل المحددات الوراثية لإنتاج حويصلة في المتفطره.

البروتوكول

1. اعداد الحديد المنضب المتوسطة المحددة

1. اعداد 1 لتر من الحد الأدنى المتوسطة (مم) عن طريق تذويب 5 غرام من KH₂بو₄، 5 غرام من L-اسباراجين ، 20 مل من الجلسرين ، و 2 غرام من سكر العنب في 900 مل من الماء منزوع الأيونات في وعاء من البلاستيك. تجنب الزجاج لمنع تلوث الحديد. ضبط درجه الحموضة إلى 6.8 مع 5 N NaOH وحجم إلى 1 لتر مع الماء.
2. أضف 50 جرام من الراتنج المعدني (MCR) وحرك برفق باستخدام شريط التحريك المغناطيسي لمده 24 ساعة عند درجه حرارة 4 درجات مئوية. تعقيم وأزاله MCR عن طريق الترشيح من خلال وحده تصفيه 0.22 μm مع جهاز استقبال من البلاستيك. لتسريع الترشيح ومنع انسداد فلتر ، والسماح للراتنج الرواسب لمده 30 دقيقه قبل الترشيح.
   ملاحظه: تحتوي هذه الوسيطة علي اقل من 2 μM من الحديد المتبقي ، كما هو محدد بواسطة الطيف الطيفي للامتصاص الذري.
3. ملحق مم مع 0.5 ملغ/لتر من ZnCl₂, 40 Mg/l من mgso₄, و 0.1 ملغم/لتر من mnso₄. بشكل منفصل, اعداد المخزونات المركزة (1, 000x) من كل من المكملات المعدنية في الماء منزوع الأيونات وتعقيم عن طريق الترشيح قبل مكملات MM. الحديد المنضب ، والمعادن المكملة مم سيشار هنا كما منخفضه مم الحديد (LIMM).
4. من 50 mM المخزون من الخصوبة₃ الذائبة في 10 مم حمض الهيدروكلوريك ، أضافه 1 مل إلى 1 لتر من limm (50 μM التركيز النهائي) لاعداد عاليه مم الحديد (himm).

2. تزايد المتفطره في الحديد-الشروط المحدودة

1. ذوبان 50 μL من المجمدة 15 ٪ الجلسرين الأسهم من Mtb وخط لوحه أجار تستكمل مع 10 ٪ الإثراء ADN (5 غرام/لتر الزلال ، 2 غرام/لتر سكر العنب ، و 0.85 g/L كلوريد الصوديوم ، 0.2 ٪ الجلسرين و 0.05 ٪ توين-80)¹⁰. احتضان اللوحة عند 37 درجه مئوية حتى تصبح المستعمرات مرئية.
2. تطعيم مستعمره واحده من Mtb¹⁰ في 2 مل من مرق المتفطرات المتوسطة (جدول المواد) تستكمل مع التخصيب ADN. احتضان مع الانفعالات في 37 درجه مئوية.
3. السماح للثقافة Mtb تنمو إلى المرحلة اللوغاريتمية المتاخره (OD₅₄₀ هو ~ 0.8). للتحقق من ذلك ، قياس OD₅₄₀ باستخدام مقياس طيفي.
4. انتشار 200 μL من الثقافة اللوغاريتمية المتاخره علي لوحات أجار المتفطرات (جدول المواد) تستكمل مع 0.2 ٪ الجلسرين ، 0.05 ٪ توين-80 ، و ADN. تطعيم 5 لوحات علي الأقل. احتضان لوحات في 37 درجه مئوية حتى النمو البكتيري مرئية كطبقه متموج. هذا ياخذ ~ 1 أسبوع ل Mtb.
5. بلل مسحه قطنية معقمه في LIMM. استخدام هذه المسحة لجمع البكتيريا من لوحات أجار وتطعيم 100 مل من LIMM لاعداد تعليق البكتيرية المركزة مع OD₅₄₀ من ~ 1.0.
6. تمييع هذا التعليق 10 مرات إلى 1 لتر مع LIMM وتقسيمه إلى اثنين ، 2 لتر من الزجاجات البلاستيكية المعقمة ، كل واحده تحتوي علي 500 مل من الثقافة.
7. إخراج 2 مل من الثقافة ونقله إلى أنبوب ثقافة 5 مل. أضافه 10 μL من 10 ٪ المجلد/المجلد tyloxapol.
8. احتضان الثقافات في 37 درجه مئوية واقفا لمده 14 يوما.

3-مجموعه المولودين

1. قياس OD₅₄₀ للثقافة 2 مل في وقت جمع. جعل المخففات التسلسلية 1:10 من الثقافة ولوحه 100 μL من كل تخفيف علي لوحات أجار مع ADN و 0.05% توين-80.
2. نقل الثقافة إلى 5 225 mL أنابيب الطرد المركزي المخروطية وأجهزه الطرد المركزي في 2,850 x g ل 7 دقيقه في 20 ° c.
3. جمع الثقافة ماده طافي مع ماصه 50 mL وتصفيه تعقيمها من خلال وحده تصفيه 0.22 μm.

4. عزل المولود

1. نقل الترشيح الثقافة في نظام الترشيح الفائق للخلايا التي وضعت في 4 درجه مئوية وتصفيه التركيز في < 50 رطل من خلال 100 كده غشاء قطع ل ~ 50 mL.
2. الطرد المركزي الترشيح الثقافة المركزة في 15,000 x g ل 15 دقيقه في 4 °c وجمع supernatant.
3. أجهزه الطرد المركزي الترشيح الثقافة في أنابيب البولي نبذ حلول في 100,000 x g ل 2 ح في 4 ° c.
4. أعاده تعليق الكريات غشائي في ما مجموعه 1 مل من الفوسفات معقمه مخزنه المالحة (تلفزيوني) بواسطة الأنابيب لطيف.
5. مزيج 0.5 mL من التعليق بيليه الحصول عليها في الخطوة 4.4 مع 1.5 mL من الحل إيوديكسانول 60 ٪ ، مما أسفر عن تركيز إيوديكسانول النهائي من 45 ٪ wt/vol. الاستغناء عن هذا المزيج في الجزء السفلي من 13 مم x 51 مم البولي بروبيلين الأنابيب رقيقه الجدران الانبوبه.
6. تراكب إيوديكسانول التعليق 45 ٪ مع 1 مل من 40 ٪ ، 35 ٪ ، 30 ٪ ، 25 ٪ ، و 20 ٪ (المجلد/المجلد في تلفزيوني) إيوديكسانول الحلول و 1 مل من تلفزيوني في الجزء العلوي.
7. جهاز الطرد المركزي في 100,000 x g ل 18 ح في 4 ° c.
8. جمع 1 مل كسور التدرج الكثافة بدءا من اعلي باستخدام حقنه هاميلتون 1 مل.
9. تمييع كل كسر جمعها إلى 20 مل مع تلفزيوني وأجهزه الطرد المركزي في 100,000 x g ل 2 ح في 4 ° c.
10. أزاله ماده طافي وتعليق بيليه في 0.5 mL من تلفزيوني. تخزين هذا بيليه في 4 درجه مئوية.

5. القياس الكمي للميق

1. قياس تركيز البروتين في كل كسر من قبل الفحص برادفورد (جدول المواد) ، وفقا للمبادئ التوجيهية للشركة المصنعة.
2. اجراء تحليل الدهون الغشاء.
   1. احتضان 10 μL من كل كسر التدرج مع مسبار الغشاء الفلوري 1-(4-تريميثيلامونيومفينيل) -6-فينيل-1 ، 3 ، 5-هيكاتريين ف-تولوينيسولفوناتي (تي ان تي-DPH) في التركيز النهائي من 1 ميكروغرام/مل في النهائي 50 μL حجم من برنامجتلفزيوني في 96 الأسود بشكل جيد لوحات.
   2. احتضان لوحات في 33 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
   3. قياس الفلوري في 360 nm الاثاره و 430 nm الانبعاثات.

6. التحليل النوعي للمياس

1. أداء البروتين الكهربائي.
   1. خلط ما يقرب من 1 ميكروغرام من عينات MEV في 16 μL مع 4 μL من المخزن المؤقت عينه 5x (10 ٪ ث/الخامس SDS ، 10 ملم dithiothreitol ، 20 ٪ v/v الجلسرين 0.2 M تريس-HCl ، pH 6.8 0.05 ٪ ث/الخامس بروموفينول الأزرق) والحرارة العينات في ال85 مخزن
   2. تحميل في 10 ٪ تريس/الجليسين SDS-بولياكرياميد هلام¹¹ وتشغيل في 10 V/سم في تشغيل العازلة (25 ملم تريس قاعده ، 190 mm الجليسين ، 0.1 ٪ SDS) حتى الجبهة صبغه زرقاء تصل إلى الجزء السفلي من هلام.
   3. وصمه عار الهلام مع محلول تلطيخ البروتين بالموجات فوق الصوتية (جدول المواد).
2. تنفيذ لطخه نقطه.
   1. تحميل 2 μl من التعليق ميقاف مع تركيز حوالي 0.5 ميكروغرام/μl ، والمخففات التسلسلية مزدوجة علي غشاء النيتروسليلوز وعمليه للطخه نقطه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. استخدام مصل المضادة التي أثيرت في الفئران ضد اعداد الميس في التخفيف من 1:5000 كالاجسام المضادة الاساسيه والماعز مكافحه الماوس إلى جانب الفجل البيروكسيديز (النظام الصحي العام) في 1:10000 التخفيف كالاجسام المضادة الثانوية. الكشف عن المجمعات مستضد الأجسام المضادة مع الركيزة المناسبة الشكل الصحيح للكشف عن الكشف الكاشف ونظام التصوير.
3. أداء تلطيخ السلبية والمجهر الكترون.
   1. إصلاح 250 μL من ميقاف مع 2 ٪ غلوتارالدهيد في 0.1 M cacodylate في درجه حرارة الغرفة لمده 2 ساعة واحتضان بين عشيه وضحيها في 4 ٪ الفورمالديهايد ، 1 ٪ غلوتارالديهيد ، و 0.1 ٪ تلفزيوني.
   2. وصمه عار عينات ثابته مع 2 ٪ الاوزميوم أكسيد لمده 90 دقيقه.
   3. ديهيدرات العينة في الايثانول وتضمينها في الراتنج الايبوكسي في سبوير.
   4. مراقبه المولود تحت مجهر الكترون الإرسال.

النتائج

تم تنقيه الميس بواسطة الترسب التفاضلي في تدرج الكثافة (الشكل 1، الشكل 2). وببموجب الشروط الموصوفة ، يفصل المولود في الغالب في الجزء المتدرج 3 (F3) ، الذي يقابل 25 في المائة إيوديكسانول. ويستند هذا الاستنتاج علي الكشف عن البروتين ، والدهون الغشاء ، والتصور المجهري للمواس سليمه ، وتوزيع حجم الجسيمات متناهي ، والتفاعل الإيجابي مع مضاد للمصل انتيفيسيليس (الشكل 2، الشكل 3). ا...

المناقشة

وقد تم تطوير أساليب متعددة لتنقيه الخلايا المشتقة النواة الخلوية¹². وعلي النقيض من ذلك ، هناك معلومات محدوده عن الطرق الفعالة لتنقيه البكتيريا المشتقة من المركبات⁷. العزلة الفعالة للمركبات المركبة التي تستمد من Mtb تحتاج إلى النظر في الصعوبات المتاصله في زراعه هذه المتفطره المسببة للامراض. Mtb لديه وقت انقسام طويل (~ 24 ساعة) وينبغي التعامل معها في السلامة البيولوجية مستوي ثلاثه (BSL-3) الظروف. ولذلك ، فمن المهم لتحسين كفاءه أساليب العزل MEV. لان المتفطره الإفراج عن غليكولي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خلية Amicon المقلوبة موديل 108	EMD Milipore	UFSC40001	نظام الترشيح الفائق للخلايا
BD Polypropilene 225 مل أنابيب مخروطية	فيشر	05-538-61	أنابيب الطرد المركزي المخروطية Biomax
100 kDa غشاء الترشيح الفائق المقطوع	EMD Milipore	PBHK07610	غشاء الترشيح الفائق
Chelex-100 راتنج	Bio-Rad	142-2842	معدن راتنج مخلب
Middlebrook 7H10 Agar	BD Difco	262710	ألواح أجار الفطرية
Middlebrook 7H9 Broth	BD Difco	271310	مرق البكتيريا الفطرية
متوسط غشاء نشاف السليلوز	نيترو GE Healthcare	10600001	غشاء النشاف
Optiprep	Sigma	D1556	Iodixanol
الطرد المركزي الفائق أنابيب 25 مم × 89 مم	بيكمان كولتر	355618	أنابيب الطرد المركزي الفائقة من البولي كربونات 25 مم × 89 مم
أنبوب طرد مركزي رقيق الجدران من البولي بروبيلين 13 مم × 15 مم	بيكمان كولتر	344059	أنبوب طرد مركزي رقيق الجدران من مادة البولي بروبيلين 13 مم × 15 مم
صبغة فحص البروتين	BioRad	5000006	تلطيخ بروتين
SYPRO روبي	مجسات جزيئية	S12000	صبغة البروتين فائقة الحساسية
TMA-DPH	المجسات الجزيئية	T204	1- (4-Trimethylammoniumphenyl) -6-Phenyl-1،3،5-Hexatriene p< / em>-Toluenesulfonate
قوارير الترشيح الفراغي	CellPro	V50022	التصفية