نظام ميكروانجيكترودي لضخ المخدرات المشتركة والفيزيولوجيا الكهربية

وتستخدم علي نطاق واسع الفيزيولوجيا الكهربية وطرق حقن المخدرات في علم الأعصاب لدراسة النشاط العصبي والسلوك, في الجسم الآخر, في القوارض والرئيسيات. وعلي مدي العقود الثلاثة الماضية ، سمحت التحسينات التي أدخلت علي نماذج الإنجاز المبكر بتقنية أكثر دقه واقل توغلا ، والتسجيل المتزامن وحقن المخدرات في مواقع المخ المحددة^1،2،3. بالنسبة لرئيسيات علي وجه الخصوص ، القدرة علي تسليم كميات صغيره بدقه مع الحد الأدنى من تلف الانسجه أمر بالغ الاهميه إذا كانت هذه التقنية لاستخدامها لدراسة الوظائف المعرفية المتقدمة التي تتطلب الحيوانية المدربين تدريبا عاليا. وتشمل التطورات الاخيره القياسات الكهربية الفسيولوجية والكيميائية المزمنة بالاقتران مع التحفيز باستخدام المجسات المزروعة⁴، وتم مؤخرا تجريب التسجيل المشترك وتوصيل المخدرات ميكروفلويدريك في القوارض⁵. نظام injectrode الموصوفة هنا يسمح التسجيل الكهربي ، والتحفيز ، وتسليم المخدرات بدقه ، وقد تم بالفعل تنفيذها بنجاح في مختبرات متعددة الرئيسيات^6،7،8.

ان التوافر المتزايد لأجهزه الاستشعار الحساسة والمتخصصة ، مثل النانو^9،10 مع تطبيقات العلوم العصبية ، يتطلب طريقه موثوقه للحصول علي المسبار من خلال الام الجافية دون اتلاف الاجهزه النانويه الهشة أو نصائح القطب المجهري.

قمنا بتصميم نظام ميكرونجيكترودي الذي يتغلب علي التحديات التقنية للجمع بين هذه الطرق باستخدام المكونات المتاحة بسهوله ، والمنخفضة التكلفة ، ويسهل وظيفتين رئيسيتين: ' 1 ' القدرة علي وضع مسبار تجريبي هش ، مثل القطب المجهري أو نانونسياو ، من خلال الام الجافية والانسجه العصبية ، محمية من اي ضرر. تسمح هذه الوظيفة بوضع المسبار التجريبي في المواقع المستهدفة ، وتسليمه باستخدام الكانولا كدليل من خلال النسيج العصبي. ' 2 ' القدرة علي استخدام القطب المجهري لاجراء تجارب تجمع بين تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية والتحفيز الكهربائي وحقن المخدرات.

يستخدم نظامنا أنبوب دليل لاختراق الجافية ، جنبا إلى جانب مع قني الذي يعمل علي حد سواء لتسليم المخدرات (عند استخدام نظام الضخ المجهري) ويوفر حماية اضافيه للميكروقطب أو نانوسيسور (سواء عندما يمر من خلال الجافية الانسجه العصبية). هذا النظام يمكن بناؤها بسهوله مع المكونات المتاحة تجاريا علي نطاق واسع ، والتي هي غير مكلفه وسهله للعثور علي. نحن تقليل الضرر اختراق باستخدام قني قطر صغير (القطر الخارجي OD = 235 μm ، القطر الداخلي ID = 108 μm).

هنا نقدم تعليمات خطوه بخطوه لبناء microinjectrode والتكوين من النظام ميكروفلويديك. نحن نشرح الخطوات اللازمة لاستخدام microinjectrode ، اما بشكل مستقل أو بالاقتران مع نظام ميكروفلويدريك لحقن المخدرات. ويمكن تطبيق نهج مماثل مع اي مسبار تجريبي هش ، مثل نانوسينسياو^9،10. يمكن ان يكون المسبار الامامي أو الخلفي محملا في الكانولا (اعتمادا علي التصميم) ، سيتم حمايته من التلف عند اختراق الانسجه الجافية والعصبية. نحن نقدم مثال البيانات من تجربه في الجسم الخارجي مع الرئيسيات غير البشرية ، والتي استخدمناها القطب الصغير التنغستن لأداء التحفيز الكهربائي ، وبعد ذلك حقن muscimol في مجال العين الاماميه (FEF) في حين ان الحيوانية أداء الذاكرة الموجهة (MGS) مهمة.

واتبعت الإجراءات التجريبية الدليل الوطني للمعاهد الصحية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية وجمعيه المبادئ التوجيهية والسياسات المتعلقة بالعلوم العصبية. تمت الموافقة علي بروتوكولات الإجراءات التجريبية والسلوكية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه يوتا.

1-بناء ميكروانجيكترودي للتحفيز والتسجيل (الشكل 1ا)

1. قياس طول الكانولا والمسبار (في هذا المثال نانونسيور). يجب ان يكون المسبار أطول من الكانولا بالطول الذي يبرزه من طرف الكانولا (اعتمادا علي تصميم المسبار) بالاضافه إلى حوالي 2 سم.
2. تحت المكبر أو المجهر (~ 10x التكبير) ، وتحميل التحقيق في cannula. إذا كان ذلك ممكنا التحميل الخلفي هو الأفضل لحماية غيض من التحقيق.
   ملاحظه: هذه الخطوة ، التي تتم يدويا ، هي صعبه. فمن المستحسن لممارسه مع القطب الصغير تحت عدسه مكبره قبل محاولة مع مسبار التجريبية الفعلية.
3. تمرير قني (التي تحتوي علي المسبار) من خلال الطواده العليا ، T-تقاطع ، والطوير السفلي.
   1. إذا كان المسبار هو مجرد سلك واحد دون اي مرفقات ، العودة-تحميله في التفت وادراج التجميع في تقاطع T من الطواده السفلي. يجب وضع اعلي من قني (الجانب المسطح النهاية) في منتصف تقاطع T ، داخل الجزء السفلي ولكن ليس الطواده العليا. المسبار التجريبي أو الاستشعار الحيوي يجب ان يبرز فوق قمة الطواده العليا.
      ملاحظه: ويمكن أيضا صنع القواعد المخصصة من خلال حفر ثقب في المقابس الطوير باستخدام لقم الحفر الصغرى ، وحجم الحفرة التي تقوم علي القطر اللازم لتشديد قني إلى تقاطع T.
4. استخدام وجع الطواده لتشديد القواعد علي الجزء العلوي والسفلي من تقاطع T. لا الإفراط في تشديد. ويمكن أضافه قطعه صغيره من الأنابيب لتعزيز دعم القطب داخل الطواده العليا.
5. لحام الذهب دبابيس لكل من محطات التحقيق (اشاره ، الأرض ، وما إلى ذلك) ، وفقا للمواصفات التحقيق.
6. ضبط الوضع النسبي للتحقيق و cannula. قياس المسافة التي جاحظ المسبار من قني تحت التكبير ، وضبط يدويا من النهاية العليا (المسبار يمكن ان تنزلق بحريه داخل القواعد).
7. أضافه الغراء الايبوكسي بين دبابيس الذهب والطواق العلوي لنعلق التحقيق إلى الطواده.
8. فك المسمار العلوي لسحب المسبار داخل cannula. بصريا تاكيد ان التحقيق هو تماما داخل قني تحت التكبير.
9. ارفق الحقن بالمحرك الصغير.

2. بناء ميكروانجيكترودي لضخ المخدرات (الشكل 1ب)

1. نعلق "غير مشطوف" أو نهاية مسطحه من قني إلى الجزء السفلي من تقاطع T باستخدام الطواده. استخدام وجع الطواده لتشديد الطواده.
2. نعلق قطعه صغيره من الأنابيب الشعرية (~ 1.5 سم) إلى الجزء العلوي من تقاطع T عن طريق تمريرها من خلال الطواده القياسية. تشديد مع وجع الطواده.
3. الخلفي تحميل القطب الصغير من خلال أنابيب شعريه ، T-تقاطع ، قني والقواعد المقابلة.
4. تاكد من ان الجزء الخلفي من القطب يبرز اقل من 1 سم من الخلف من الأنابيب الشعرية ، وغيض من القطب يبرز من قني علي المسافة المطلوبة علي الجانب السفلي. يمكن تعديل موضع القطب يدويا من اعلي النهاية.
5. جندي دبوس الذهب إلى محطه ميكروالكترود.
6. أضافه الغراء الايبوكسي بين دبوس الذهب والطواق العلوي لإرفاق ميكروالكترود للطوير.
7. فك المسمار العلوي للتراجع عن المسبار داخل cannula. تاكد بصريا من ان القطب المجهري هو تراجع تماما في cannula.

3-بناء حلبه ميكروفلويديك (الشكل 2)

1. وضع لوح الخبز علي سطح مستقر. وضع الصمامات 2 3 الطريقة موازيه لأطول الجانبين من لوح الخبز ، حوالي 6 في. وبصرف الفضل مع منفذ واحد (واحد الذي هو دائما مفتوحة) تواجه بعضها البعض. استخدام مسامير لإصلاح الصمامات إلى لوح الخبز.
2. وضع مسطره بجانب الصمامات (لقياس وتتبع حركه السوائل داخل الأنابيب الشعرية).
3. تحميل خليط من النفط اللزوجة المنخفضة 1:1 والغذاء التلوين (علامة) في حقنه gastight ومكان في مضخة ماركر. قطع قطعه واحده من الأنابيب الشعرية ، واستخدام القواعد القياسية و Luer-قفل الموصلات لتوصيل حقنه إلى واحده من الموانئ علي صمام الإدخال. هذا هو "خط العلامة".
4. قطع قطعه قصيرة من الأنابيب الشعرية ل "خط المسطرة". استخدام القواعد القياسية لتشديد علي الموانئ التي تواجه الصمامات.
5. قطع قطعتين أطول من الأنابيب الشعرية لتوصيل صمام الإخراج إلى microinjectrode ، وربط مضخة المخدرات إلى صمام الإدخال (استخدام القواعد القياسية).
   ملاحظه: طول هذين الخطين يعتمد علي الاعداد التجريبي ، يجب علي المرء ان يكون طويلا بما يكفي للوصول من جهاز ضخ إلى الحيوانية ، والاخر واحد من مضخة المخدرات إلى صمام الإدخال. استخدام حجر الكشط لقطع الأنابيب الشعرية.

4. تركيب Microinjectrode إلى Microdrive (الشكل 3)

1. تاكد من تراجع القطب المجهري/المسبار التجريبي في الكانولا قبل التركيب.
   ملاحظه: يجب ان يكون أنبوب دليل في موقف في microdrive.
2. إرفاق محول مخصصه الصنع إلى microinjectrode.
3. الأعلى-تحميل microinjectrode من خلال أنبوب دليل وتامينه للمحول باستخدام مسامير.
4. قياس موقف microdrive (العمق) الذي نتوء microinjectrode من أنبوب دليل ، ثم سحبه ~ 1 سم للتحضير للادراج.
5. لتجارب التسريب المجهري ، قم بتوصيل "خط الدماغ" إلى فتح تقاطع T غير المستخدمة من microinjectrode. استخدام الطواده القياسية وتشديد مع وجع الطواده.

5. تنظيف واعداد النظام ميكروفلويدريك

1. ضع القرص الصغير مع microinjectrode علي دورق النفايات.
2. تحميل الكلوركسيدين (علي سبيل المثال ، nolvasan ؛ يذوب في 20 غرام/لتر) في 1 مل حقنه gastight ووضعه في مضخة المخدرات. تحويل اتجاه تدفق الصمامات بحيث ينتقل السائل من ضخ المخدرات من خلال صمام لخط الصمام وخارج "خط الدماغ".
3. مسح الدائرة مع الكلوركسيدين باستخدام معدل تدفق منخفض (50-200 μL/min) لمده لا تقل عن 10 دقيقه. كرر الخطوات 5.2 من خلال 5.3 مع المحلول الملحي المعقم ومن ثم الهواء.
   ملاحظه: من المهم التحقق من وجود تسرب في هذه المرحلة. تطبيق بلطف مناديل خاليه من الوبر في التقاطعات للمساعدة في الكشف عن اي تسريبات السائل من خلال الطوير.
4. تحميل الدواء في حقنه gastight 500 μL ، ضغط الهواء ومن ثم وضع في مضخة المخدرات. تدفق في 50 μL/min حتى بضع قطرات تتدفق من microinjectrode.
5. نقع في أنبوب دليل في الكلورههيكسيدين (المذاب في 20 غرام/لتر) لمده 15 دقيقه.
6. أدر اتجاه صمام الإخراج نحو "خط التنظيف". تقدم مضخة ماركر حتى يتم ملاحظه حافه واضحة من اللون والزيت علي خط المسطرة. تاكد من ان هناك دائما النفط بين المخدرات واللون من أجل عدم مزج اثنين من المواد القابلة للذوبان في الماء وتفقد الحافة الحاده بينهما. وضع علامة بداية لهذا الخط النفط/صبغ (مع قطعه من الشريط أو علامة).
7. تحويل اتجاه صمام الإخراج نحو خط الدماغ.

6. أداء التسجيل أو تجربه ضخ

ملاحظه: ستختلف خطوات مناوله الماشية حسب المعمل والتجربة. يتم تنفيذ الخطوات التالية بعد العملية الجراحية اللازمة وقد تم التحضير للكشف عن الجافية. وبعد التجربة ، يجب تنفيذ جميع الخطوات اللازمة لما بعد الإجراءات وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا.

1. إرفاق microdrive إلى غرفه التسجيل. خفض أنبوب دليل لاختراق الجافية.
   ملاحظه: يجب ان أنبوب دليل لا تخترق اي ابعد من الجافية من أجل تجنب اتلاف القشرة.
2. خفض microinjectrode إلى حوالي 2 مم فوق الموقع للتسجيل/الحقن في الدماغ.
3. تشديد الطواده العلوي (جاحظ القطب المجهري/biosensor) وربط دبابيس الذهب إلى نظام التسجيل. الحفاظ علي التقدم في microinjectrode إلى الموقع المستهدف.
   ملاحظه: تذكر ان تشمل المسافة التي يمتد القطب الصغير إلى ما بعد قني في الحسابات.
4. لتجارب التسريب ، استخدم مضخة الحقن المجهرية اليدوية لتحريك عمود الزيت بمقدار 1 سم كل 3 دقائق (~ 60 nL/min). بمجرد ان يتم غرس الحجم المطلوب ، قم بتبديل صمام الإخراج باتجاه خط التنظيف.
   ملاحظه: وسوف تختلف حجم غرست استنادا إلى الأنواع النموذجية ومنطقه الدماغ المستهدفة. قد تضر معدلات التدفق الأسرع الانسجه العصبية.
5. عندما تكون التجارب كامله ، والتراجع microinjectrode داخل أنبوب دليل (ترك المسبار نتوء). ثم قم بازاله microdrive لتنظيف. مسح النظام ميكروفلويديك كما هو موضح في الخطوات 5.1-5.5. للاستعداد لأعاده الاستخدام.
   ملاحظه: في تجربتنا ، فان microinjectrode سوف تستمر لعده استخدامات إذا تم اتخاذ الرعاية المناسبة. جوده التسجيل الكهربية تنخفض بشكل أسرع من القدرة علي الحقن.

أجرينا حقن ناهض GABAa (muscimol) لتنشيط عكسها من حقل العين الجبهي (FEF) ، في حين ان الحيوانية أداء الذاكرة الموجهة saccade المهمة11. في هذه المهمة ، يتم تقديم المثبتات الحيوانية وهدف البصرية الطرفية. الحيوانية يحافظ علي التثبيت في حين تذكر الموقع المستهدف ، وبمجرد ان تختفي نقطه التثبيت ، ينفذ حركه العين الرمشه إلى موقع تذكرت للحصول علي مكافاه. تم بناء microinjectrode وفقا للتعليمات الواردة في الشكل 1ب. وكان حجم التسريب للتجربة المثال 850 nL. ويظهر الأداء السلوكي علي الذاكرة الموجهة المهمة (MGS) في مواقع مختلفه والأوقات النسبية لضخ muscimol في الشكل 4. لوحظ العجز أكبر أداء في 2 إلى 3 ح بعد التسريب.

الشكل 1: خطوه بخطوه تلفيق ميكروانجيكترودي. (ا) التكوين للاستخدام بشكل مستقل عن نظام ميكروفلويدريك. يتم قياس cannula والمسبار من أجل التاكد من ان غيض من المسبار يمكن ان تبرز في الطول المطلوب (علي سبيل المثال ، 150 μm). المسبار الامامي محمل في المصنع يتم تمرير قني من خلال تقاطع t وتعلق علي الجانب السفلي ، مع نهاية مسطحه في منتصف تقاطع t ؛ النهاية الخلفية لمسبار يستمر من خلال الطواده العليا. يتم الانتهاء من microinjectrode من قبل دبابيس الذهب لحام علي كل من محطات التحقيق وأضافه الغراء بينهما والطوير الأعلى للاستقرار. يعتمد توصيل إلى الاكتساب نظامه علي التصميم من التحقيق. في هذا المثال ، المسبار الخاص بنا هو نانوسينسياو مع ثلاثه خيوط. (ب) التكوين للاستخدام مع نظام ميكروفلويدريك. للزوجين microinjectrode إلى النظام ميكروفلويديك ، يتم استخدام قطعه من الأنابيب الشعرية للجانب العلوي من تقاطع T. يمكن ان يكون المسبار الامامي أو الخلفي تحميل. ثم يتم توصيل خط ميكروفلويديك إلى افتتاح تقاطع T الثالث. في هذا المثال استخدمنا ميكروالكترود. انظر الصورة المكبرة لغيض من قني الذي نتوء القطب الصغير من خلال تشديد الطواده العليا. انظر جدول المواد للاطلاع علي قائمه بالأصناف المستخدمة في البناء. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: نظام ميكروفلويدريك. يسمح تكوين الصمامين بالتحكم في اتجاه التدفق نحو microinjectrode أو نحو خط التنظيف لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. الدائرة تعتمد علي اثنين من 3-ميناء الصمامات المتصلة باستخدام أنابيب الشعرية والقواعد القياسية. وتستخدم المحاقن gastight لحمل وحقن المخدرات التسريب وعلامة. مضخة حقنه قابله للبرمجة يسمح لتنظيف التلقائي للنظام وتحميل المخدرات. مضخة ميكرومحقنه يدوية تسمح بالحقن المتحكم به والتصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تركيب microinjectrode إلى ميكرودرايف هيدروليكي مع وبدون قدره الحقن. الخطوة 4.1: محول مخصص الصنع يسمح للمرفق ميكرونجيكترودي إلى microdrive. برغي واحد يربط المحول إلى microdrive. اثنين من مسامير الأمن ميكرونجيكترودي إلى المحول. يجب ان يكون الطواق العلوي غير ثمل علي الأقل 2 يتحول من أجل حماية غيض من القطب المجهري/المسبار التجريبي عند تحميل microinjectrode في أنبوب دليل من microelectrode. الخطوة 4.3: ادراج ميكروانجيكترودي في أنبوب دليل من الأعلى. الخطوة 4.4: إذا كنت تقوم بالضخ المجهري ، قم بتوصيل خط المخدرات بفتحه التقاطع T الثالثة باستخدام الطواده البلاستيكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الذاكرة الموجهة المهمة saccade خلال ضخ muscimol في FEF. (ا) وضع الحقن المجهري في النصف الأيمن من الكره الارضيه ، منطقه الاتحاد. (ب) الأداء السلوكي اثناء مهمة MGS التي يتم فيها وضع ثمانيه أهداف محيطيا. ركضنا 4 كتل من المهمة MGS ، قبل وفي ثلاث مرات بعد الحقن. المؤامرة القطبية يظهر الأداء (الانحراف) في كل من هذه الأوقات (اللون) ، لمواقع مختلفه بالنسبة لنقطه التثبيت (زاوية علي المؤامرة القطبية). انخفاض الأداء بوضوح في اليسار hemifield البصرية 2 ح بعد الحقن (الأزرق تتبع ، النصف الأيسر من المؤامرة القطبية). (c) اثار saccade ل 8 مواقع الذاكرة الطرفية قبل (اليسار) وبعد حقن muscimol في fef (الحق ، 1 و 3 ح بعد التسريب). وانخفضت دقه saccade في hemifield البصرية اليسرى (النصف الأيسر من المؤامرات القطبية) بعد حقن muscimol. المقياس بدرجات الزاوية البصرية (dva). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

اي.