Method Article

طريقة ثابتة ذاتية التوجيه لتوليد الأعضاء الدماغية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

DOI:

10.3791/60379

⸱

March 4th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Stem Cell Center, Yale University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء هذا البروتوكول كوسيلة لإنتاج organoids الدماغ بطريقة مبسطة ومنخفضة التكلفة دون عوامل النمو الخارجية أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع الحفاظ على تنوع أنواع خلايا الدماغ والعديد من ميزات التنظيم الخلوي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر أجهزة الدماغ المميزة عن الخلايا الجذعية الجنينية فرصة فريدة لدراسة التفاعلات المعقدة لأنواع الخلايا المتعددة في نظام ثلاثي الأبعاد. هنا نقدم طريقة واضحة نسبيا وغير مكلفة أن تسفر عن organoids الدماغ. في هذا البروتوكول يتم تقسيم الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات صغيرة بدلاً من الخلايا المفردة وتزرع في الوسائط الأساسية دون مصفوفة غشاء الطابق السفلي غير المغايرة أو عوامل النمو الخارجية ، مما يسمح للإشارات التنموية الجوهرية لتشكيل نمو العضوي. هذا النظام البسيط ينتج مجموعة متنوعة من أنواع خلايا الدماغ بما في ذلك الخلايا الدبقية والدقيقة، والخلايا الجذعية، والخلايا العصبية من الدماغ الأمامي، منتصف الدماغ، والدماغ الخلفي. Organoids ولدت من هذا البروتوكول أيضا عرض السمات المميزة للتنظيم المناسب الزمانية والمكانية التي أظهرتها الصور brightfield ، الأنسجة ، الفلور المناعي والوقت الحقيقي الكمية عكس النسخ البوليميراز تفاعل سلسلة ( qRT-PCR). لأن هذه الاعضاء تحتوي على أنواع الخلايا من أجزاء مختلفة من الدماغ، ويمكن استخدامها لدراسة العديد من الأمراض. على سبيل المثال، في ورقة حديثة أظهرنا استخدام الأورجادات الاعضاء المتولدة من هذا البروتوكول لدراسة آثار نقص الأكسجة على الدماغ البشري. يمكن استخدام هذا النهج للتحقيق في مجموعة من الحالات التي يصعب دراستها مثل الإعاقات العصبية النمائية والاضطرابات الوراثية والأمراض العصبية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بسبب عدد لا يحصى من القيود العملية والأخلاقية، كان هناك قدر كبير من الصعوبة في دراسة الدماغ البشري. في حين أن الدراسات التي تستخدم القوارض كانت حاسمة لفهمنا للدماغ البشري ، فإن دماغ الفأر لديه العديد من أوجه الاختلاف1،2. ومن المثير للاهتمام أن الفئران لديها كثافة عصبية أقل بـ 7 مرات على الأقل من دماغ الرئيسيات3و4. على الرغم من أن الرئيسيات أقرب إلى البشر من القوارض من وجهة نظر تطورية ، إلا أنه ليس من العملي لمعظم الباحثين العمل معهم. وكان الغرض من هذا البروتوكول لتلخيص العديد من السمات الهامة للدماغ البشري باستخدام طريقة مبسطة وأقل تكلفة دون الحاجة إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي غير مغاير أو عوامل النمو الخارجية مع الحفاظ على تنوع خلايا الدماغ والتنظيم الخلوي.

استخدم العمل التكويني من مختبر Sasai الثقافة الحرة للخلايا الجنينية (SFEBq) لتوليد أنواع الخلايا العصبية ثنائية وثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)5،6. وقد اتبعت العديد من أساليب الأعضاء في الدماغ البشري مسارا مماثلا نسبيا من ESCs الإشارات7،8. في المقابل ، يبدأ هذا البروتوكول مع مجموعات من ESCs البشرية المنفصلة (hESCs) ، على غرار الخطوات الأولية للعمل المنوي لمختبرات طومسون وتشانغ قبل خطوات الطلاء9،10 وكذلك الخطوة الأولية لبروتوكول الجهاز في الدماغ من مختبر باسكا قبل إضافة عوامل النمو الخارجية11. وقد استخدمت مصفوفات غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، matrigel) في العديد من بروتوكولات الأجهزة الدماغية، وقد ثبت أن تكون سقالة فعالة8. ومع ذلك ، فإن مصفوفات غشاء الطابق السفلي الأكثر استخدامًا لا تأتي دون مضاعفات لأنها تشارك في تنقية كميات غير معروفة من عوامل النمو مع تقلب الدفعة أثناء الإنتاج12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه المصفوفات تعقيد التصوير ، وزيادة خطر التلوث والتكلفة.

في حين يمكن استخدام الأجهزة الاعضاء في الدماغ البشري للإجابة على العديد من الأسئلة، وهناك بعض القيود التي يجب أن تضع في اعتبارها. لأحد، بدءا من الخلايا الجذعية الجنينية، وorganoids تشبه بشكل وثيق العقول غير ناضجة من العقول القديمة وعلى هذا النحو قد لا تكون نماذج مثالية للأمراض التي تحدث في سن الشيخوخة، مثل مرض الزهايمر. ثانيا، في حين أن بروتوكولنا وجدت علامات من الدماغ الأمامي، منتصف الدماغ وتطور الدماغ الخلفي التي هي مفيدة لدراسة تأثير العلاج أو المرض على الخلايا من مناطق الدماغ متعددة في الحفل، يمكن اتباع بروتوكولات أخرى للتركيز على مناطق الدماغ محددة13،14. وأخيرا ، فإن هناك قيدا آخر من النماذج organoid هو أن من الحجم ، في حين أن متوسط طول الدماغ البشري ما يقرب من 167 ملم ، organoids الدماغ المصنوعة باستخدام التحريض تنمو تصل إلى 4 ملم8 وorganoids التي شكلتها هذا البروتوكول تنمو إلى 1-2 ملم من قبل 10 أسابيع. ومع ذلك، يوفر هذا البروتوكول أداة هامة لدراسة أنسجة الدماغ البشري والتفاعل بين أنواع الخلايا المتعددة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. صيانة الخلايا الجذعية

  1. الحفاظ على H9 hESCs على طبقة من عامل النمو انخفاض مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد، من الآن فصاعدا ببساطة يشار إليها باسم مصفوفة) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    1. لمعطف واحد لوحة 6-جيدا أو واحد طبق 10 سم، والجمع بين 100 ميكرولتر من المصفوفة مع 5.9 مل من الجليد الباردة دولبيكو في المتوسط النسر المعدلة (DMEM)/F12 وسائل الإعلام. التفاف لوحات في فيلم البارافين وتخزينها بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. استخدامها في اليوم التالي لتمرير الخلايا بعد أن يتم استنشاق المصفوفة الزائدة / وسائل الإعلام.
  2. ثقافة الخلايا من الأسبوع إلى الأسبوع بنسبة انقسام 1:12 تقريبًا كل 7 أيام. الحفاظ على الخلايا باستخدام الوسائط mTESR-1 في 37 درجة مئوية، حاضنة الأكسجين منخفضة (5٪ O2،5٪ CO2). تحديث الوسائط يوميًا. التّفزّزب الخلايا من الثقافة بين ممرات يستعمل زجاج أدوات.
  3. وينبغي أن تمر خلايا H9 قبل أربعة إلى ستة أيام من استخدامها لإنتاج organoids. وينبغي أن تكون الخلايا التي تم تمريرها في ما يقرب من 1:8 نسبة من مجموعات الخلايا. للقيام بذلك، تبدأ بشطف الخلايا مع وسائط DMEM F12 وفصلها الخلايا مع بروتياز محايدة (على سبيل المثال، dispase، يشار إليها من الآن فصاعدا ببساطة كما بروتياز)، شطف مع DMEM/F-12، ولوحة كما 30-60 مجموعات الخلية عبر 4 لوحات (6-جيدا أو 10 سم) في التقاء ~ 20٪. قبل يومين من الحصاد ، انتقل إلى حاضنة منتظمة (21٪ O2، 5٪ CO2). وينبغي أن تصل لوحات ~ 80٪ التقاء عند بدء تشكيل organoid.

2. تفكك hESCs للثقافة الأورجانية

  1. Aliquot حل الأسهم البروتياز (5 U / mL).
    ملاحظة: نحن عادة تجميد أسفل 1 مل aliquots في -20 درجة مئوية للاستخدام على مدى عدة أشهر.
  2. تمييع محلول مخزون البروتياز إلى تركيز العمل عن طريق إضافة 1 مل من محلول المخزون بالإضافة إلى 5 مل من DMEM/F12 لكل صفيحة 6-well أو 10 سم من hESCs.
  3. استثير وإزالة وسائط ثقافة الخلية، ثم تغطية hESCs مع حل البروتياز. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 10-15 دقيقة أو حتى حواف المستعمرات الجولة والبدء في فصل من المصفوفة.
  4. إمالة لوحة، يستنشق حل البروتياز، وغسل بلطف الخلايا مع DMEM/F12 ثلاث مرات. استخدم 2 مل/جيد لكل غسلة عند استخدام لوحة 6-well و 6 مل عند استخدام لوحة 10 سم. تأكد من بقاء المستعمرات متصلة بالمصفوفة عند تنفيذ هذه الخطوة.
  5. إضافة مرة أخرى حوالي 1.5 مل من وسائل الإعلام mTESR الطازجة إلى كل بئر (أو 5 مل للوحة 10 سم) وطرد الخلايا قبالة لوحة باستخدام pipetting لطيف.
  6. باستخدام 10 مل ماصة، يستنشق بلطف والاستغناء عن hESC داخل لوحة حتى تصل إلى ما يقرب من 1/30th من حجمها الأصلي. يجب أن تشبه مجموعات المستعمرات ~ 250-350 ميكرومتر مربع ة الحجم عند الانتهاء من هذه الخطوات.

3. جيل من organoids

  1. نقل الخلايا إلى واحد جدا منخفضة المرفق T75 قارورة تحتوي على 30 مل من وسائل الإعلام mTESR دون عامل نمو الليفية الأساسية (bFGF).
  2. في اليوم التالي، إمالة قارورة (s) بحيث تجمع الخلايا الحية في الزاوية (وهذا قد يستغرق 5-10 دقيقة في اليوم الأول، ولكن سوف تحصل على أسرع كما تحصل على مجموعات أكبر).
    ملاحظة: إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا التي انضمت إلى الجزء السفلي من القارورة في هذه الخطوة أو أي خطوات لاحقة، نقل الخلايا إلى قارورة جديدة. من الطبيعي أن يكون عدد الخلايا الميتة مرتفعًا خلال اليومين الأولين. عند إجراء تغييرات الوسائط، تأكد من إزالة أكبر قدر ممكن من حطام الخلية.
  3. وبمجرد أن تستقر الخلايا، تستنشق وسائل الإعلام والخلايا الميتة تاركة حوالي 10 مل من الوسائط التي تحتوي على الخلايا الحية.
  4. أضف ~ 20 مل من وسائل الإعلام bFGF منخفضة (DMEM/F12 تكملها 1x N2, 1x B27, 1x L-الجلوتامين, 1x NEAA, 0.05% بوملين مصل البقر (BSA), و 0.1 m m monothioglycerol (MTG) تكملها مع 30 نانوغرام / مل bFGF).
  5. تحقق من الخلايا في اليوم 2. إذا كانت معظم الخلايا تبدو صحية ومشرقة، ليست هناك حاجة للقيام بأي شيء. ومع ذلك، إذا كان أكثر من ثلث الخلايا تظهر مظلمة، استبدال الوسائط (باستخدام نفس تقنية الميل كما هو الحال في الخطوة 3.2) مع ~ 20 مل من وسائل الإعلام bFGF منخفضة تكملها 20 نانوغرام / مل bFGF.
  6. في اليوم 3، استبدال نصف وسائل الإعلام (باستخدام تقنية إمالة في الخطوة 3.2) مع 20 مل من وسائل الإعلام bFGF منخفضة تكملها مع 10 نانوغرام / مل bFGF.
  7. في اليوم 5، استبدل نصف المتوسط (باستخدام تقنية الإمالة في الخطوة 3.2) بـ 20 مل من الوسائط التعريفية العصبية (NIM: DMEM/F12، 1x N2 الملحق، 0.1 m MEM NEAA، 2 ميكروغرام/مل الهيبارين).
    ملاحظة: إذا كان هناك أي مجموعات كبيرة من الخلايا أو organoids التي هي أكبر بكثير من الآخرين، يجب إزالتها من الثقافة. ويقدر حجم من قبل ظهور تحت المجهر; على سبيل المثال، باستخدام العدسة مع شبين. غالبية الاعضاء هي مماثلة الحجم (حوالي 100 ± 20 ميكرون). أزلنا الأجزاء الاعضاء التي كانت تقريبا 2x أصغر أو أكبر من غيرها.
  8. استبدل نصف المتوسط (~ 15 مل) (باستخدام تقنية الإمالة) مع NIM كل يومين.
  9. بعد 3 أسابيع في الثقافة، إضافة 100x البنسلين/ ستريبتومسين إلى وسائل الإعلام (NIM: DMEM/F12، 1x N2 الملحق، 0.1 m M MEM NEAA، 2 ميكروغرام/مل الهيبارين) في تركيز نهائي من 1x إذا رغبت في ذلك. تحديث وسائل الإعلام كل يومين.
    ملاحظة: بهذه الطريقة، حافظنا على organoids لمدة تصل إلى 6 أشهر في الثقافة.

4. استخراج الحمض النووي الريبي وإعداد

  1. استخراج بلطف ما يقرب من 15 organoids (اعتمادا على حجم) من قارورة باستخدام ماصة 10 مل ووضعها في أنبوب 1.5 مل.
    1. بيليه بلطف organoids في جهاز الطرد المركزي (200 × ز لمدة 1 دقيقة)، وشطف مع 1x دالبيكو في برنامج تلفزيوني (DPBS) ثلاث مرات.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام نظام أو بروتوكول معتمد (على سبيل المثال، مجموعة RNeasy).
  3. قياس قيمة الكثافة البصرية لكل عينة في 260 و 280 نانومتر.
  4. إعداد cDNA باستخدام نظام أو بروتوكول تم التحقق من صحته (على سبيل المثال، مجموعة توليف iScript cDNA).
  5. قم بإجراء qRT-PCR باستخدام الكبريرز التي تم التحقق من صحتها مسبقًا(الجدول 1)بما في ذلك جين واحد على الأقل من جينات التدبير المنزلي.

5- الكيمياء الهيستوكيميائية المناعية

  1. تثبيت
    1. إعداد محلول بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ (PFA) ووضعه عند 4 درجات مئوية.
    2. باستخدام شفرة حلاقة معقمة، قطع تلميح قبالة ماصة نقل معقمة.
    3. استخراج الاعضاء بلطف باستخدام ماصة نقل قطع، كما أنها يمكن أن تكون مقسمة بسهولة، وخصوصا عندما تنمو كبيرة، ووضعها في لوحة 6-جيدا مع وسائل الإعلام إضافية أو DPBS.
    4. إمالة لوحة، يستنشق وسائل الإعلام، واستبدال مع 1x DPBS. شطف الخلايا مع 1x DPBS مرتين إضافية.
    5. استبدال DPBS مع 4٪ PFA الحل ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: في حين أننا ثابتة لمدة 2 أيام (للorganoids الصغيرة) إلى 7 أيام (للorganoids > 3 أشهر)، أوقات أقصر (على سبيل المثال، 16-24 ح) قد يكون من الممكن أيضا.
    6. إعداد 30٪، 20٪ و 10٪ حلول السكروز في DPBS.
    7. بعد التثبيت في PFA، استبدال مع محلول السكروز 10٪ ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    8. استبدال السكروز 10٪ مع 20٪ السكروز ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
    9. استبدال السكروز 20٪ مع 30٪ السكروز ووضع على شاكر في 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  2. المقاطع المجمدة
    1. إعداد طبقة مسطحة من الجليد الجاف ووضع قالب من البلاستيك المسمى على أعلى من ذلك.
    2. صب طبقة رقيقة من المتوسط درجة الحرارة خفض الأمثل (أكتوبر) في القالب والسماح لها تبدأ في تصلب (في غضون ثوان قليلة).
    3. وضع عدد قليل من organoids على الجزء العلوي من أكتوبر في القالب باستخدام ماصة نقل مع تلميح قطع وإيلاء اهتمام وثيق لموقع organoids.
    4. إضافة ببطء في أكتوبر حتى القالب هو كامل ويتم تغطية organoids. السماح لها تصلب تماما لمدة 10 دقيقة إضافية.
      ملاحظة: في حين أن تجميد أكثر من 10 دقيقة يساعد على ضمان الموضع النسبي المثالي للorganoids متعددة للقسم، فمن الممكن استخدام مزيج الجليد الجاف الإيثانول أو النيتروجين السائل لتجميد بسرعة أكبر.
    5. وضع علامة على الموقع النسبي للorganoids مع علامة لجعله أسهل للعثور عليهم عند القطع.
    6. ضع القوالب في كيس أو صندوق واخزنها عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة لقطع المقاطع.
    7. باستخدام cryostat، شريحة 10 ميكرون المقاطع ووضع الأنسجة على المسمى، الشرائح المشحونة إيجابيا.
  3. تلطيخ
    1. إعداد حل الحجب (0.3٪ تريتون X-100، 4٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني).
    2. استخدام القلم باب مسعور لرسم حول محيط الأنسجة.
    3. شطف الشرائح مع برنامج تلفزيوني 3 مرات لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
    4. استبدال برنامج تلفزيوني مع حل حظر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    5. استبدال محلول الحجب مع محلول الأجسام المضادة (الأجسام المضادة في التركيز المناسب، 0.1٪ تريتون X-100، 4٪ مصل حمار عادي في برنامج تلفزيوني) في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    6. في اليوم التالي، اغسل الشريحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
    7. استبدال PBS مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (في التركيز المناسب) المخفف في محلول الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    8. شطف 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة مع 1x PBS.
    9. تطبيق 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وصمة عار وشطف ثلاث مرات لمدة 10 دقيقة مع كل 1x PBS.
    10. الصق القسائم إلى الجزء الأمامي من الشرائح مع حل متصاعد، واسمحوا الجافة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، وتخزينها في الظلام في 4 درجة مئوية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 صور ًا تمثيلية لحقل مشرق لعدة نقاط زمنية لإظهار شكل الخلايا/الأجهزة الاعضاء في جميع مراحل البروتوكول المختلفة. تمت إزالة hESCs من لوحة زراعة الأنسجة ، وتقسيمها إلى قطع صغيرة ، ووضعها في قارورة مرفق منخفضة للغاية T75 حيث شكلت المجالات. من المهم ملاحظة أن الخلايا تبدو مشرقة ومتشابهة في الحجم ، دون خلايا مظلمة ومظلمة في مراكز هذه المجموعات. تم فلل الخلايا تدريجيا قبالة bFGF. في اليوم الخامس، تم وضعها في وسائل الإعلام التعريفي العصبية وبقيت في هذه الوسائط طوال فترة الثقافة. على الر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على غرار النماذج الاعضاء الأخرى، وهذا هو نظام اصطناعي الذي يأتي مع العديد من المحاذير. على الرغم من أنه كان هناك القليل دفعة إلى دفعة الاختلاف من حيث مستويات التعبير العام، organoids الفردية لم تظهر الاختلافات. على سبيل المثال ، لم يكن موقع المناطق الإيجابية Sox-2 متطابقًا في كل عضو(الشكل 3). في حين أن qPCR مناسب للبحث عن التغييرات الشاملة في دفعات من الخلايا ، سيتم استخدام تقنيات إضافية مثل RNAseq الخلية الواحدة في الدراسات المستقبلية لجمع المزيد من المعلومات على أساس كل خلية على حدة. قيود أخرى لهذا الن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.G.K. هو عضو ساب لDansar تكنولوجيا المعلومات وجين في الخلية.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر نواة الخلايا الجذعية في جامعة ييل (YSCC) ومركز ييل للسرطان (YCC) على المساعدة. نشكر الدكتور جونغ كيم على استعراضه لعلم الأمراض العصبية. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي في ولاية كونيتيكت، ومارس من الدايمات، وNHLBI R01HL131793 (S.G.K.)، ومركز ييل للسرطان وبرنامج ييل للتدريب على بيولوجيا السرطان NCI CA193200 (E.B.) وهدية سخية غير مقيدة من جوزيف و لوسيل مادري

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأرThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةA11029
Alexa Fluor 546 الماعز المضاد للأرانبThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةA11035
B27 SupplementGibco ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية17504-044
bFGFLife Technologies ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةPHG0263
BSAسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةA9647
BX43 مجهرأوليمبوس ، شينجوكو ، طوكيو ، اليابان
DAPI stainThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةD1306
DispaseSTEMCELL Technologies ، فانكوفر ، كندا07913
DMEM / F12Thermo Fisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية11330-032
DPBSجيبكو ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية10010023< / a>
FluroSaveMilliporeSigma ، Burlington ، MA345789
GFAP الأجسام المضادةNeuroMab ، ديفيس ، CAN206A / 8
النمو المخفض Matrigel (Matrix)كورنينج ، كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية356231
H9 hESCsWiCell ، ماديسون ، ويسكونسن ، الولايات المتحدة الأمريكيةWA09
HeparinSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية9041-08-1
iQ SYBR Green SupermixBio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية1708880
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية1708891
L-glutamineGibco ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية25030-081
MonothioglycerolSigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةM6145
mTESR mediaSTEMCELL Technologies ، فانكوفر ، كندا85850
N2 NeuroPlexGemini Bio Products ، West Sacramento ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية400-163
NanodropThermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةND-2000
NEAAGibco ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية11140-050
مصل الحمار العادي (NDS)ImmunoResearch Laboratories Inc. ، ويست جروف ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةa href = "https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target = "_blank" >017-000-121< / a>
أكتوبرساكورا فينيتيك ، تورانس ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية25608-930
PFAعلوم المجهر الإلكتروني ، هاتفيلد ، بنسلفانياRT15710
آلة qPCRBio-Rad ، CFX96 ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية1855196
مجموعة RNeasyQiagen ، هيلدن ، ألمانيا74104
Sox2MilliporeSigma ، برلنغتون ، MAAB5603
مجهر TMS-Fنيكون ، ميلفيل ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية
Triton X-100Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT8787-100ML
قوارير T75 مرفقة منخفضة للغايةكورنينج ، كورنينج ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية3814
عامل <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
  2. Roth, G. The Long Evolution of Brains and Minds. , Springer Netherlands. (2013).
  3. Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31(2009).
  4. Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
  5. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
  6. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
  7. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  8. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  9. Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
  10. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
  11. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  12. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  13. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  14. Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  15. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  16. Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325(2019).
  17. Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
  18. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
  19. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
  20. Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Brain OrganoidsHuman Embryonic Stem CellsNeural Induction MediaQuantitative RT PCRImmunofluorescenceGene Expression AnalysisNeural DifferentiationForebrain Marker Foxg1Glial Marker GFAPStem Cell Marker Sox2

Related Articles