يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

11.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60384

⸱

أكتوبر 4, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Northwestern University, 2National Center for Genetic Engineering and Biotechnology (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل الأساسي لبطانة الرحم البشرية الاوليه التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية والاحتفاظ بخصائص نسيج بطانة الرحم الأصلي. يصف هذا البروتوكول الطرق من اكتساب انسجه الرحم إلى المعالجة النسيجية لهيكل بطانة الرحم.

الملخص

بطانة الرحم البشرية هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه هرمونيا في الجسم وضروري لأقامه الحمل. هذا النسيج يمكن أيضا ان تصبح مريضه وتسبب الاعتلال وحتى الموت. واقتصرت النظم النموذجية لدراسة بيولوجيا بطانة الرحم البشرية علي نظم الاستزراع الأنبوبي لأنواع الخلايا المفردة. الاضافه إلى ذلك ، فان الخلايا الظهاريه ، واحده من أنواع الخلايا الرئيسية لبطانة الرحم ، لا تنتشر بشكل جيد أو الاحتفاظ بصفاتها الفسيولوجية في الثقافة ، التالي فهمنا لعلم الاحياء بطانة الرحم لا يزال محدودا. لقد ولدت ، للمرة الاولي ، الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. هذه العضوية لا تتطلب اي مواد سقالة الخارجية وتنظيم علي وجه التحديد بحيث الخلايا الظهاريه تشمل الهيكل الشبيه كروي وتصبح مستقطبه مع الخلايا اللحمية في المركز الذي ينتج وتفرز الكولاجين. يتم التعبير عن الاستروجين ، البروجسترون ومستقبلات الاندروجين في الخلايا الظهاريه واللحمية والعلاج مع المستويات الفسيولوجية من الاستروجين والتستوستيرون تعزيز تنظيم الهيكل التنظيمي. ويمكن استخدام هذا النظام نموذج جديد لدراسة البيولوجيا بطانة الرحم العادية والمرض بطرق لم تكن ممكنة من قبل.

المقدمة

بطانة الرحم البشرية التجويف الرحمي وتعمل كاول اتصال للجنين اثناء الغرس. وتتكون بطانة الرحم من الخلايا الظهاريه المضيءه والغديه ، والخلايا الليفية الداعمة للورم ، والخلية البطانية والخلايا المناعية. معا, هذه الأنواع الخلية تشكل انسجه بطانة الرحم التي هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه لهرمونات الستيرويد الجنس1. التغييرات التي تحدث خلال كل دوره الحيض ملفتة للنظر. مطلوب النمو المناسب وأعاده تشكيل بطانة الرحم للسماح لزرع الاجنه ان يحدث. الاستجابة الشاذة للاستروجين والبروجستيرون يمكن ان يؤدي إلى بطانة الرحم الحرارية التي لا تسمح للنجاح في إنشاء الحمل ويمكن ان يؤدي حتى في الامراض بما في ذلك أورام بطانة الرحم.

من أجل دراسة الاستجابات الهرمونية والتغييرات الاساسيه التي تحدث في بطانة الرحم ، تم نشر الخلايا من انسجه بطانة الرحم التي تم استئصالها من المرضي اثناء الجراحة أو خزعة بطانة الرحم في ثقافة الخلايا. تنتشر الخلايا اللحمية لبطانة الرحم بشكل تفضيلي وتنتشر بسهوله ، ويمكن تلخيص عمليه التمايز التي يسببها البروجسترون في المختبر. ونتيجة لذلك ، تم تعلم الكثير خلال عمليه التفريق هذه ، التي سميت ديسيدواليزيشن2،3. نوع الخلية الرئيسية الأخرى في بطانة الرحم ، والخلايا الظهاريه التلالؤ والغديه ، ومع ذلك ، لا تنمو بشكل جيد كما أحادي الطبقات التقليدية ، وفقدان القطبية ، وتصبح السكون ، ووجود إمكانات محدوده التكاثري. ونتيجة لذلك ، فان اقل ما يعرف عن علم الاحياء ودورها في بطانة الرحم البشرية. وبما ان العديد من الأورام تنشا من الخلايا الظهاريه ، تظل أليات المرتبطة بفرط التنسج أو التحول إلى الخلايا السرطانية محدده بالبالكامل. وعلاوة علي ذلك, وقد وضعت دراسات ان الاستجابة هرمون ينطوي علي الإجراءات الحميمة paracrine بين الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم4,5.

في الاونه الاخيره ، تم تاسيس الثقافة العضوية ثلاثية الابعاد (3d) من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم من قبل مجموعتين مستقلتين6،7، والتي هي التقارير الاولي من العضوية التي تشكلت من انسجه بطانة الرحم. وتتالف هذه العضوية من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم جزءا لا يتجزا من مصفوفة البروتين (جدول المواد) ولم تشمل مقصوره استجابه الهامه هرمونيا من بطانة رحم بطانة الرحم ، والليفية اللحمية. كما يمكن ان تختلف البروتينات مصفوفة من الكثير إلى الكثير ، ويمكن ان تؤدي إلى مسارات الإشارات التي لا تحدث بالضرورة في الانسجه ، فانه سيكون من المثالي لاستبدال البروتينات مصفوفة مع مكونات بطانة الرحم. في الدراسة الحالية ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل العضوي الخالي من السقالات من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. وجود الخلايا اللحمية لا يوفر فقط الدعم للخلايا الظهاريه ولكنه يوفر أيضا الإجراءات الضرورية paracrine التي تم إنشاؤها لتكون مهمة لاستجابه هرمون بطانة الرحم4,8,9 .

العضوية الجديدة لبطانة الرحم متعددة الخلايا تقدم نظاما نموذجيا لبطانة الرحم التي هي بسيطه لتوليد والتي تتضمن كلا من الخلايا الظهاريه واللحمية. ويمكن استخدام هذه العضوية لدراسة التغيرات الهرمونية علي المدى الطويل والاحداث المبكرة من الامراض مثل التورم بسبب عدم التوازن الهرموني أو الشتائم الخارجية. ويمكن في نهاية المطاف توسيع تعقيد هذه الاشكال العضوية لتشمل أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية والمناعية مع الخلايا العضلية ربما إلى تقليد حقا فسيولوجيا الانسجه البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم جمع عينات بطانة الرحم من النساء قبل انقطاع الطمث التي خضعت لعمليه استئصال الرحم الروتينية لظروف رحميه حميده في مستشفي النساء بجامعه نورث وسترن ، وفقا لبروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية. وتم الحصول علي موافقه خطيه من جميع النساء المشمولات بالدراسة.

1. اعداد قوالب اجبرز

  1. قبل البدء في عزل الخلايا ، يلقي وتتوازن 1.5 ٪ القوالب الدقيقة الاغاروز (جدول المواد) لإيواء العضوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

2. توليد الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم

  1. حصاد الخلايا اللحمية الاوليه والظهاره
    1. في خزانه السلامة الاحيائيه باستخدام تقنيه العقيم ، واعداد محلول الانزيم (2.5 ملغ/مل كولاجيناز نوع انا + 0.1 مغ/مل DNase انا في 10 مل من يوزع [500 وحدات]) في 37 درجه مئوية ، ومعقمه-تصفيه الحل باستخدام فلتر حقنه 0.2 μm في أنبوب مخروطي 15 مل.
    2. في خزانه السلامة الاحيائيه باستخدام تقنيه العقيم ، كشط بطانة الرحم من الخزعات الرحمية والنسيج المفروم تحت غطاء محرك الطريق إلى قطع صغيره جدا مع مشرط.
      ملاحظه: الانسجه بطانة الرحم التي هي علي الأقل 20 مم × 10 مم × 1 مم مطلوب لتوليد اعداد كافيه من العضوية.
    3. ضعي الانسجه المفرومة الطازجة في محلول الانزيم في أنبوب مخروطي الشكل بحجم 15 مل. إغلاق الغطاء والتفاف الأعلى مع فيلم الشمع (جدول المواد) لمنع التلوث.
    4. وضع الأنبوب مع الانسجه في حمام مائي أو حاضنه في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه مع اهتزاز لطيف (80 − 100 دوره في الدقيقة).
    5. كومه مصفاه الخلية 100 μm علي راس مصفاه الخلية 20 μm علي أنبوب مخروطي 50 mL. تصفيه الحل من خلال اثنين من المصافي ، ومن ثم شطف أنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل من محلول الملح هانك المتوازن (HBSS ؛ جدول المواد) ووضع الغسيل من خلال مصفاه لضمان جمع جميع الخلايا.
      ملاحظه: السائل تدفق من خلال يحتوي علي الخلايا اللحمية وخلايا الدم الحمراء (~ 20 مل المجموع). يتم جمع الخلايا الظهاريه علي مصفاه 20 μm. تبقي قطع من الانسجه غير مهضوم علي راس مصفاه 100 μm. تخلص من الانسجه غير المهضومة إلى حاويه نفايات المخاطر البيولوجية.
    6. عكس مصفاه الخلية 20 μm من الخطوة 2-1-5 علي أنبوب مخروطي جديد 50 mL وغسل الخلايا الظهاريه قباله مصفاه مع 20 مل من وسائل الاعلام organoid (جدول المواد) تستكمل مع 1 ٪ من القلم/بكتيريا.
    7. الطرد المركزي أنابيب مخروطيه من الخطوات 2-1-5 و 2-1-6 في 500 x g لمده 5 دقائق.
    8. مع الخلايا اللحمية التي تم جمعها ، وأزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه مع 10 مل من خليه الدم الحمراء تحلل العازلة.  احتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 − 15 دقيقه. الطرد المركزي أنبوب مخروطي في 500 x g لمده 5 دقائق ، وأزاله supernatant ، وأعاده تعليق بيليه مع 200 − 300 μl من وسائل الاعلام العضوية (انظر الخطوة 2-2-2 لمزيد من التعليمات).
    9. مع الخلايا الظهاريه التي تم جمعها ، وأزاله ماده طافي وأعاده التعليق مع 100 μl من وسائل الاعلام organoid (انظر الخطوة 2-2-2 لمزيد من التعليمات).
  2. خلايا البذر
    1. بعد تولد القوالب الاغاروز 1.5 ٪ في الآبار (1 العفن في بئر) من لوحه 24 بئر ، وأزاله وسائل الاعلام organoid علي الخارج من القوالب اجبرزت وأماله لوحه ثقافة الانسجه بحيث المتوسطة من غرفه البذر الخلية من الاطباق اجنشا يمكن أيضا ان تكون ازالتها بعناية.
    2. عرض الظهاريه (من الخطوة 2.1.9) واللحمية (من الخطوة 2-1-8) تعليق الخلية تحت المجهر.  أضافه المزيد من الوسائط العضوية إلى الخلية الظهاريه أو الخلايا اللحمية المعلقة 100 μL في وقت واحد ، بحيث تكون التعليقات متساوية تقريبا في الكثافة.
      ملاحظه: سوف تتجمع الخلايا الظهاريه معا ، وانه ليس من المستحسن لهضم/التريسيسيزي الخلايا الظهاريه في تعليق خليه واحده.
    3. الجمع بين 1 جزء من الخلايا اللحمية مع 3 أجزاء من الخلايا الظهاريه حسب الحجم.
    4. ماصه 50 μL (60,000 الخلايا) من تعليق الخلية مجتمعه في غرفه البذر الخلية من العفن اجبرزت.
    5. مره واحده يتم تعبئة قوالب الاغاروزها مع الخلايا ، أضافه بعناية 400 μl من وسائل الاعلام العضوية الطازجة في بئر من لوحه 24 بئر.
      ملاحظه: المتوسطة تصل فقط تحت سطح الاطباق اجنشا ولن يسبب الخلايا لتطفو من القوالب. بعد 2 − 3 أيام ، ستستقر الخلايا وتبدا في تشكيل الغدد العضوي.
    6. تغيير المتوسطة كل يوم الثاني مع 500 μL من وسائل الاعلام organoid.
    7. بعد 2-3 أيام ، تغيير المتوسطة إلى واحده التي تستكمل مع 0.1 nM استراديول (E) و 0.8 nM التستوستيرون (T) لتعزيز تنظيم الخلايا الظهاريه واللحمية.
      ملاحظه: علي الرغم من ان تنظيم الخلايا الظهاريه واللحمية يمكن ان تحدث مع أو بدون الهرمونات, وسوف تنظم أكثر organoids في وجود الهرمونات.

3. حصاد الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم للتجارب

ملاحظه: بعد الانتهاء من التجربة ، يمكن معالجه organoids بطانة الرحم لتحليل الانسجه أو الحمض الريبي النيبالي. تصف الخطوات التالية كيفيه معالجه العضو العضوي.

  1. انسجه
    1. ذوبت 1.5% [اغبرز] في فوسفات-مخزن ملحيه ([ببس]) ب يغلي. السماح للسائل السائل لتبرد إلى حوالي 50 درجه مئوية.
    2. تحت المجهر تشريح ، أماله الصفيحة 24 جيدا وماصه بعناية خارج الوسط من خارج العفن اجبرزت. ماصه بعناية خارج الوسط من الداخل من العفن اجبرزت لتجنب تعطيل الهيكل العضوي.
    3. تحت المجهر تشريح ، ماصه بعناية 70-75 μL من الدافئة (50 درجه مئوية) 1.5 ٪ اجنشا في غرفه الطبق اغبرز. احرص علي عدم إزعاج العضو العضوي.
    4. السماح لتبرد في 4 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
    5. أضافه 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA) في كل بئر من 24 لوحه جيدا وإصلاح كامل العفن المختومة التي تحتوي علي organoids بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. ثم تخزين في 70 ٪ الايثانول في 4 درجه مئوية حتى علي استعداد لعمليه لتضمين البارافين.
  2. [رنا] عزل
    1. تحت المجهر تشريح ، أماله لوحه 24 جيدا وماصه بعناية خارج الوسط من غرفه العفن اجبرزت.
    2. ماصه بالقوة 1 مل من المتوسطة العضوية الطازجة مباشره في العفن اجنشا بحيث يتم مسح الهيكل العضوي للخروج من ميكروويلس. يجب الحرص علي عدم خلق فقاعات كثيره جدا.
    3. كرر الأنابيب مره أخرى بنفس الوسط من الخطوة 3-2-2.
    4. جمع كل المتوسطة التي تحتوي علي organoids. أجهزه الطرد المركزي في السرعة القصوى لجمع organoids والمضي قدما إلى استخراج RNA.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي للبروتوكول. تم الحصول علي انسجه الرحم من الجراحة بعد فحصها من قبل اخصائيي الامراض. وفصل بطانة الرحم من الورم العضلي عن طريق الكشط وتم هضم انسجه بطانة الرحم انزيمي إلى الخلايا كما هو موضح في البروتوكول. وأضيفت الخلايا الظهاريه واللحمية إلى ميكروويلس في قوالب اجبرز. بعد 7 أيام في الثقافة ، عولجت العضوية مع E و T لمده 7 − 14 يوما اضافيه.

بالنسبة للمعالجة النسيجية ، تم إغلاق القوالب التي تحتوي علي الهيكل العضوي لبطانة الرحم مع الاغثار متبوعه ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد ولدت لدينا الإنسان العضوي بطانة الرحم تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة الخارجية. في حين انه قد تم بالفعل تبين ان الخلايا الظهاريه بطانة الرحم الاوليه يمكن ان تشكل organoids6,7, وقد تم تضمين هذه الخلايا في مصفوفة الجيلاتين من البروتينات التي تفرزها خلايا ساركوما الفار (انظر جدول المواد) للمساعدة تشكيل هياكل تشبه كروي. الاضافه إلى ذلك ، كانت الخلايا اللحمية لبطانة الرحم غائبه. ونحن التكهن بان الخلايا اللح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIHS/المعاهد القومية للصحة/NCATS UG3 غرانت (ES029073) وشمال غرب مدرسه Feinberg كليه الطب جسر الصندوق (JJK). نود ان نعترف بالمرفق الأساسي لعلم الامراض الشمالية الغربية لمعالجه العضوية الثابتة لتضمين البارافين. نود ان نعترف بالفريق UG3 بأكمله بما في ذلك وودروف ، Burdette ، ومختبرات اوربريك للمناقشات الثاقبة والتعاون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Agarose HS ، درجة البيولوجيا الجزيئيةDenville ScientificCA3510-6
قوالب الاغاروزSigma-AldrichZ764043(https://www.microtissues.com/)
كلوريد الأمونيوم (NH 4< / sub>Cl)Amresco0621
& beta ؛ -EstradiolSigma-AldrichE2257
كولاجيناز ، النوع الثاني ، مسحوقثيرمو فيشر 17101015
بين كورنينج354235
DNase ISigma-AldrichD4513
EDTAFisher ScientificBP120-1
Eosin StainVWR95057-848
مستقبلات هرمون الاستروجين (SP1) ، الجسم المضاد أحادي النسيلة للأرانبThermo Fisher ScientificRM-9101-S
Fluoroshield مع DAPI ، وسط تركيب الأنسجةSigma-AldrichF6057
الملح المتوازن من Hank (HBSS)Corning21-022-CV1x بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول
بقع الهيماتوكسيلينThermo Fisher Scientific3530-32تركيبة هاريس المعدلة ، محلول الهيبارين الخالي من الزئبق
تقنيات STEMCELLتمت إضافة 07980إلى MammoCult
media حل مخزون الهيدروكورتيزونSTEMCELL Technologies07925تمت إضافته إلى MammoCult media
Organoid media - MammocultSTEMCELL Technologies05620مكملة ب 2 & micro ؛ لتر / مل الهيبارين و 5 & ميكرو ؛ لتر / مل هيدروكورتيزون
بارافورمالديهايد ، محلول 16٪علوم المجهر الإلكتروني15710
البنسلين الستربتومايسينالحراري فيشر العلمي15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، درجة الحموضة 7.4سيجما ألدريتشP3813
مستقبلات البروجسترون ، PgR 1294 ، غير مترافق ، طافي مزرعةAgilent TechnologiesM356801-2
مصفوفة البروتين - MatrigelBD Biosciences356231
الفأر المنقى المضاد للجسم المضاد للإي كاديرينBD Biociences610181استنساخ 36
الجسم المضاد المؤتلف المضاد للفيمنتين [EPR3776]Abcamab92547
طقم تحلل وعزل الحمض النووي الريبيZymo ResearchR2060
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>)سيجما ألدريتشS6014
التستوستيرونسيجما ألدريتش86500
ثلاثي الألوان صبغةAbcamab150686
فيلم شمع - بارافيلمVWR52858-000
الفرق محلول الأحمر محلول

المراجع

  1. Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. The endocrine and paracrine control of menstruation. Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).
  2. Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).
  3. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).
  4. Li, Q., et al. The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2. Science. 331 (6019), 912-916 (2011).
  5. Wetendorf, M., DeMayo, F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).
  6. Boretto, M., et al. Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability. Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).
  7. Turco, M. Y., et al. Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  8. Kurita, T., et al. Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis. Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).
  9. Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer. Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).
  10. Bui, H. N., et al. Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay. Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).
  11. Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. , (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.