Method Article

التعبير ، وتنقيه ، وملزمه ليبوسوم من الخميرة الناشئة SNX-شريط مغاير

DOI:

10.3791/60413

⸱

December 6th, 2019

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Yale School of Medicine, 2Department of Biological Sciences, University of North Carolina at Charlotte

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، ونحن نقدم سير العمل للتعبير ، وتنقيه وربط الشحمية من SNX-شريط المغايرة في الخميرة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات SNX-بار هي فئة المحافظة التطورية من غشاء أعاده عرض البروتينات التي تلعب أدوارا رئيسيه في الفرز والاتجار في البروتين والدهون اثناء كثرة المحببات ، والفرز داخل النظام الداخلي ، والاوتوهاغي. المركزية ل SNX-شريط وظيفة البروتين هو القدرة علي تشكيل المنازل المتماثلة أو المغايرة التي تربط الاغشيه باستخدام المحفوظة للغاية phox-homology (PX) وبار (بن/البرمائيات/Rvs) المجالات. الاضافه إلى ذلك ، يمكن ان القلة من الدمامل SNX-بار علي الاغشيه انتزاع تشكيل الأنابيب الغشائية والحويصلات ويعتقد هذا النشاط لتعكس وظائفها كما البروتينات معطف لشركات النقل المستمدة من التنظير الباطني. وقد استخدم الباحثون لفتره طويلة في دراسات ملزمه المختبر باستخدام المؤتلف SNX-بار البروتينات علي الدهنيات الاصطناعية أو الحويصلات العملاقة يونيلاميلار (GUVs) للكشف عن ماكياج دقيق من الدهون اللازمة لدفع أعاده عرض الغشاء ، التالي الكشف عن أليتها للعمل. ومع ذلك ، نظرا للتحديات التقنية مع أنظمه التعبير المزدوج ، وسميه التعبير البروتين SNX-بار في البكتيريا ، وضعف الذوبان من البروتينات SNX-بار الفردية ، وقد درست معظم الدراسات حتى الآن المتماثلات SNX-بار ، بما في ذلك الدمامل غير الفسيولوجية التي تشكل اثناء التعبير في الاونه الاخيره ، قمنا بتحسين بروتوكول للتغلب علي أوجه القصور الرئيسية لنظام التعبير البكتيري النموذجي. باستخدام سير العمل هذا ، ونحن شرح كيفيه التعبير بنجاح وتنقيه كميات كبيره من التباينات SNX-بار وكيفيه أعاده تشكيلها علي الدهنيات الاصطناعية لاختبارات ملزمه والأنابيب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتكون الاغشيه العضوية المرتبطة بالغشاء مثل غشاء البلازما ، والشبكية الاندوبلازميه ، وجهاز غولجي ، وليسوسوم (خميرة فجوه) ، والتنظير الباطني من نظام اندومومبرن للخلية النواة. معظم العضيات لديها القدرة علي التواصل وتبادل المواد مع العضيات أخرى من خلال ناقلات النقل حويصلة. كيف تنسق الخلية التعبئة والتغليف وتشكيل ناقلات النقل فيسيل داخل نظام اندوممبراني ليست مفهومه جيدا. ومع ذلك ، فان البروتينات والدهون التي تشكل جزءا كبيرا من نظام اندومبراني معروفه بأنها تنشا من الحويصلات الباطنية الداخلية من غشاء البلازما (PM). التنظير الباطني هو العضو الأول العضوي لهذه الحويصلات ويتكون من مجموعات مترابطة متعددة من الأرغن الأنبوبي. وتتمثل الوظيفة الرئيسية للتنظير الباطني في تسهيل اكتساب المغذيات ، وتنظيم دوران البروتين والدهون ، والحماية من العدوى المسببة للمرض ، والعمل كمصدر أساسي لتغذيه الدهون في غشاء البلازما. وبما ان التنظير الباطني يتلقى الجزء الأكبر من بروتينات البضائع والدهون من غشاء البلازما ، فانه يعمل كحجره فرز عن طريق عزل الشحنات في ناقلات النقل الانبوبيه الباطنية (ETCs). اي البروتينات التي لا يتم عزلها في ETCs متروكة لتكون المتدهورة عن طريق نظام اندو-lysosomal مال. يمكن ان يؤدي خلل الفرز البضائع إلى etcs إلى فقدان امتصاص المواد الغذائية ، ودوران البروتين أو التوازن الدهون ، مما ادي إلى العديد من الأيض ، والنمو ، والاضطرابات العصبية1،2. ومع ذلك ، علي الرغم من الدور المركزي لشركه ETCs في التنظير الباطني ، فان اليه الاساسيه لكيفيه تنسيق التنظير الباطني بشكل انتقائي لتعبئة العديد من الشحنات غير المتجانسة في ناقلات أنبوبيه غير معروفه.

الفرز nexin (snx) الاسره هي فئة المحافظة التطورية من البروتينات التي تم العثور علي ان تكون حاسمه بالنسبة للعديد من ردود الفعل النقل حويصلة في الخلية3,4,5. يتم تعيين nexins الفرز إلى غشاء التنظير الباطني والمعونة في التقاط البضائع عن طريق النطاق المميز phox الخاصة بهم (PX) ، والذي يربط فوسفتيدلينوستول-3-مونوفوسفات (PtdIns (3) P) ، وهو الدهون المخصب علي غشاء التنظير الباطني. الثدييات ترميز 33 SNX البروتينات ، والتي يمكن تقسيمها إلى عائلات فرعيه متعددة ، وفقا لوجود مجالات أخرى1. وعلي وجه الخصوص ، فان العائلة الفرعية snx-BAR هي أكبر عائله فرعيه تتكون من اثني عشر في الإنسان ، بينما في الخميرة الناشئة ، ساكاروميسز سيريفيسياي، يتم تقليل العائلة الفرعية إلى سبعه أشرطه snx فقط. البروتينات SNX-بار لديها كل من مجال PX والمجال بن البرمائيات-Rvs (شريط) الذي يحفز الخزانات الدهون لربط الاغشيه انحناء ايجابيه. التالي ، فان SNX-بار الاسره لديها تقارب الطبيعية لل التنظير الباطني ويمكن التوسط تشكيل ETC عبر الغشاء قدراتهم أعاده عرض. في المختبر ، وأعاده عرض خصائص SNX-الحانات يمكن ان يكون مستحثا باضافه SNX المنقي القضبان إلى الدهنيات الاصطناعية وتشكيل اللاحقة من الأنابيب المغلفة الضيقة ، يمكن تصورها بواسطة المجهر الكتروني. باستخدام هذه الأساليب ، وقد قرر الباحثون ان كلا من تركيز القلة وقوه انقباض يبدو ان تختلف بين الاسره SNX-بار مما يوحي بأنها يمكن ان تساعد في تشكيل والانشقاق من ETCs.

يمكن تصنيف الاشرطه SNX بحسب خصائصها الحصرية. وقد أثبتت الاختبارات الملزمة في المختبر والدراسات الهيكلية ان البروتينات SNX-BAR يمكن ان تشكل فقط المنازل الخاصة أو المتغايرة. لذلك ، من حيث المبدا ، يمكن لكل المحتملة SNX-بار dimer-اوليغمير توفير معطف توبولي لمسار الاتجار بالبضائع محدده المثل ، وتقييد القلة من الآخرين SNX-بار بروتومرات ، يمكن أيضا تحديد مسارات التصدير متميزة. ومع ذلك ، نظرا للعدد الكبير من القضبان SNX والتنوع داخل الاسره SNX ، واحده الفرز nexin-واحد فرضيه البضائع من غير المحتمل جدا. بدلا من ذلك الجهد المنسق باستخدام العديد من العوامل مثل القضبان SNX ، والبضائع ، وخصوصية الدهون وغيرها من التبعيات أكثر احتمالا. المثل ، كشفت الدراسات الاخيره من الخميرة SNX4 الاسره الادله علي خصوصية اضافيه الدهون ، وخارج PtdIns (3) ف ، لتحفيز ناقلات النقل الباطني6. في هذه الدراسة ، تم تنقيه SNX-بار homodimer Mvp1-Mvp1 من البكتيريا والاصليه غير المتجانسة Snx4-Atg20 وتم التعبير عن Vps5 وتنقيتها في الغلة العالية من الخميرة ، في حين تم العثور فقط Vps17-Snx4 لربط بشكل تفضيلي فسفاتيديل (PS) وتشكيل ضيق أنبوب مثل الهياكل في الدراسات ملزمه ليبوسوم6. في حين ان البعض الآخر في الميدان قد كشفت عن خصائص هامه من القضبان snx-باستخدام ريكومبينانتلي تنقيه snx-شريط الhomodimers من البكتيريا ، والسمية المرتبطة بالتعبير عن snx-شريط التباينات في نظم مماثله أعاقت توصيف الأصلي7،8،9،10. ولذلك ، من دون نظام موثوق به للحصول علي ريكومبينانتلي نقيه الاصليه التي أعرب عنها ، يجب علي الباحثين التخلي عن هذه الخطوط من التحقيق. في الشكل 1، نقدم سير عمل من أربعه أجزاء إلى 1) بناء سلاله الخميرة overodimers snx-بار لتنقيه تقارب ترادفي ، 2) التعبير عن وتنقيه الأصلي snx-شريط مغاير ، 3) اعداد الدهنيات الاصطناعية اونياميلار ، و 4) اعداد الأنابيب الشحمية أو مقايسة الترسبات ، وتوفير أداه حيوية للباحثين للتحقيق في الكتالوج المتزايد من الفرز nexins وجدت في الطبيعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الخميرة سلاله البناء

  1. تبدا مع TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: Hisg prc1Δ:: HIS3)11 كسلاله الام. هذه السلالة غير كافيه فاكولار بروتياسيس, التي تسهم في غالبيه تدهور البروتين بعد تحلل الخلية, التالي يسمح لتنقيه أنظف وأكثر كفاءه.
  2. تصميم الإشعال12 ودمج ترادفية التقارب تنقيه (TAP) العلامة في C-المحطة من ATG20 (snx-بار ORF 1) باستخدام أعاده دمج المتماثل. استخدم تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) لتاكيد عمليات التكامل (الشكل 2).
  3. اجراء لطخه الغربية من محلله الخلية ضد العلامة TAP لتاكيد التكامل السليم13.
    ملاحظه: ونحن نوصي الحصاد 3 OD (1 OD ≈ 1 × 107 خلايا) من الخلايا ل SDS-الصفحة والتحقق من وصمه عار الغربية. لاحظ انه يجب ان يحدث تكامل العلامة TAP قبل استبدال المروجين الذاتية مع المروج GAL1 للسماح أسهل التحقق من علامة TAP عبر لطخه الغربية.
  4. استبدال Snx4 الذاتية (SNX-BAR ORF1) و Atg20 (SNX-BAR ORF 2) المروجين مع المروج GAL1 غير الموسومة باستخدام متسلسلة التماثل الذاتي وخطوات التحول من كل فرد ORF14.
  5. استخدام الإشعال الجانبية خارج مواقع التكامل إلى PCR تاكيد عمليات التكامل الناجحة (الشكل 2). وهذا سيؤدي إلى النمط الظاهري الصفري لأشرطه SNX المستهدفة في غياب الغالاكتوز في وسط النمو.

2. الحث الخميرة و SNX-بار تنقيه Dimer

ملاحظه: ويمكن نشر خلايا الخميرة علي YPD القياسية (استخراج الخميرة ، peptone ، و 2 ٪ الجلوكوز) لوحات أجار كما التعديلات كروموسوميا متكاملة.

  1. تطعيم مسحه كبيره من الخلايا إلى 50 مل من معيار يب (استخراج الخميرة و peptone) المتوسطة مع 2 ٪ raffinose و 0.1 ٪ الجلوكوز كمصدر الكربون في قارورة علي الأقل 4x حجم الثقافة وتنمو بين عشيه وضحيها في 30 درجه مئوية شاكر للسماح التهوية السليمة. نتوقع ان النمو في هذه الوسيلة سيكون إبطا بالمقارنة مع YPD القياسية.
  2. في صباح اليوم التالي ، استخدم الزراعة الاوليه 50 mL لتطعيم إلى 1 لتر من المتوسطة يب القياسية مع 2 ٪ raffinose و 0.1 ٪ الجلوكوز وتنمو ل 4-5 ح في 30 درجه مئوية شاكر.
    ملاحظه: ويمكن تعديل حجم الزراعة الاوليه المستخدمة لتطعيم ثقافة 1 لتر اعتمادا علي600 OD من الزراعة التي تسبق الاستزراع. ال [اد]600 من ال 1 [ل] ثقافة بعد تلقيح سوفت كنت حوالي 0.2 ان يسمح ل علي الأقل اثنان [دوونغس] اثناء ال 4-5 [ه] حاله نمو.
    1. استخدام قارورة فرنباخ حيره للنمو للسماح التهوية السليمة ، وقارورة حجم 2.8 L كافيه. قد يؤدي اقل التهوية في تباطؤ النمو وأصغر بيليه الخلية عند الحصاد.
  3. تحقق OD600 للتاكد من الثقافة في مرحله السجل (0.5-1) بعد 4-5 h من النمو. اعتمادا علي نمو السلالة ، واجراء تعديلات علي وقت النمو للسماح لاثنين من الازدواجية علي الأقل. يضاف إلى 2 ٪ من الجلاكتوز وينمو بين عشيه وضحيها في 30 درجه مئوية شاكر.
    ملاحظه: و OD600 بعد النمو بين عشيه وضحيها قد تختلف ولكن ينبغي ان تكون مشبعه الثقافة. لاحظ ان الخلايا لا تحتاج إلى ازالتها من 0.1% الجلوكوز قبل أضافه 2% لبن لهذا البروتوكول النمو. نوصي الحصاد 3 OD من الخلايا غير المستحثة والمستحثة في هذه الخطوة ل SDS-PAGE ولطخه الغربية للتحقق (الشكل 3ا ، ب، لين 1-2).
  4. حصاد الخلايا بواسطة طرد في 4500 x g لمده 15 دقيقه. يمكن استخدام دوار الجرافة المتارجح الذي يستوعب ثقافة الحجم 1 لتر هنا.
  5. نقل بيليه الخميرة إلى أنبوب مخروطي 50 mL; قد يتم تنفيذ خطوه طرد ثانيه حسب الحاجة. ستكون الخلية بيليه عموما حول 10-15 mL في حجم كما تقاس بعلامات التخرج ويمكن استخدامها علي الفور أو تخزينها في-80 درجه مئوية.
    1. أعاده التعليق بيليه في 15 مل العازلة تنقيه (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.4 ، 300 mM كلوريد الصوديوم ، 1.5 مم MgCl2، 1 ملم Dithiothreitol (dtt) ، الانزيم البروتيني مثبطات كوكتيل) لجعل حجم النهائي حول 30 مل.
  6. البرد الخالط 4 درجه مئوية قبل الاستخدام وتتوازن مع العازلة تنقيه. خلايا lyse باستخدام اختلال الخلية الميكانيكية أو الخالط. تحميل العينة في الخالط و lyse في 20000-25000 psi لطلقات 2-3. لاحظ انه كخلايا تصبح lysed ، مطلوب ضغط المزيد من المدخلات للحفاظ علي 20000-25000 psi. جمع محلله الخلية في أنبوب مخروطي 50 mL علي الجليد.
    ملاحظه: إذا عينات اضافيه تحتاج إلى ان تكون lysed ، يجب تنظيف الخالط تماما ومعايرتها قبل تحميل العينة التالية. ابق كل الخلايا علي الثلج
  7. مسح علي الفور الخلية محلله في 35,000 x g ل 1 ح في 4 ° c. نقل بعناية ماده طافي إلى أنبوب جديد. لاحظ ان الدهون من تحلل الخلية سوف تطفو إلى الأعلى خلال طرد ولن تؤثر علي تنقيه.
    ملاحظه: نوصي بتوفير 0.5-1 ٪ من محلله وبيليه لعينات SDS-PAGE. عاده ، لا تلاحظ اختلافات كبيره ويمكن القيام به وصمه عار الغربية اضافيه لتاكيد الذوبان البروتين الحنفية (الشكل 4، الممرات 1 و 2 ، علي التوالي).
  8. تتوازن 300 μL من مفتش الخرز سينشا مع العازلة تنقيه. أضف إلى الخلية الممسوحة وحضن لمده 2 ساعة ، بالتناوب عند درجه حرارة 4 درجات مئوية.
  9. جمع الخرز في عمود اللوني 10 مل والسماح محلله غير منضم للتدفق من خلال.
  10. غسل الخرز باستخدام 10 مل من العازلة غسل (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.4 ، 300 mM كلوريد الصوديوم ، 1.5 مم MgCl2، 1 مم dtt) ، مضيفا 1 مل في وقت واحد والسماح لها بالتدفق من خلال تماما.
    ملاحظه: ونحن نوصي بتوفير 2 ٪ من الخرز ملزمه-مفتش ل SDS-صفحه العينة. عاده ، نلاحظ أربعه العصابات الرئيسية ؛ اثنين SNX-بار البروتينات والسلاسل الثقيلة والخفيفة مفتش (الشكل 4، لين 3). نوصي بتوفير كميات مكافئه من ' التملص ' و ' مفتش الخرز بعد TEV ' للمقارنة لكفاءة الانقسام TEV.
  11. جمع الخرز ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي. أضافه إلى 500 μL من الحجم الكلي مع المخزن المؤقت غسل الطازجة و 2 μL من 10 ملغ/مل TEV البروتيني واحتضان بين عشيه وضحيها, الدورية في 4 ° c.
  12. في صباح اليوم التالي ، وأزاله ماده طافي تماما باستخدام ابره 27 G وتقييم نقاء البروتين بنسبه 10 ٪ بولياكرياميد SDS-الصفحة (الشكل 4، لين 4).
    ملاحظه: نحن عاده الحصول علي 500 μL من 0.5-1 مغ/مل من 95 ٪ الصرفة النقية (الشكل 4، لين 4). ويمكن أيضا تنقيه اضافيه باستخدام الراتنج كالموديولين يمكن القيام به ، ولكن نحن عاده نري انخفاضا كبيرا في الغلة ويوصي وقف هنا إذا كان النقاء هو > 90 ٪. Tev لا تتداخل مع اختبارات ملزمه الشحمية ، علي الرغم من ان tev يمكن ازالتها باستخدام الخرز Ni-NTA الاغاروز15.
  13. للتركيز ، نقل العينة إلى فلتر الطرد المركزي 0.5 mL مع 10 كده قطع والطرد المركزي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ل 50 μL أو اقل. قياس البروتينات المركزة باستخدام فحص البروتين برادفورد. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية ويستخدم خلال أسبوع واحد.

3. اعداد الليليسوم

  1. شراء الدهون المتاحة تجاريا: فوسفاتيديلسيرين (PS), PI3P, ergosterol, و فوسفاتيديلكولين (PC). إذا لزم الأمر ، أعاده التعليق في المذيبات الموصي بها لجعل الأسهم الدهون.
    ملاحظه: يتم أعاده تعليق الدهون في خليط الميثانول/كلوروفورم لكل توصيات الشركة المصنعة. تاكد من ان الأسهم الدهنية واضحة واستعدت لدرجه حرارة الغرفة قبل استخدامها. يمكن تخزين الدهون المعاد تعليقها تحت غاز الارجون ومختومه باستخدام فيلم الشمع (أو ما يعادلها) في-20 درجه مئوية لمده 6-12 أشهر أو حتى لوحظ فقدان النشاط.
  2. احسب حجم الكمية المطلوبة من كل سهم من الدهون لإنشاء خليط بالتركيبة الدهنية المطلوبة (انظر الجدول 1). تفترض ما مجموعه 1 الخلد من الدهون في خليط الدهون.
  3. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الدخان الكيميائية. المحاقن الزجاجية النظيفة عن طريق رسم حجم حقنه كامله من كلوروفورم والتخلص منه في حاويه نفايات. كرر مرتين أخريين. عند نقل كلوروفورم ، استخدم فقط المحاقن الزجاجية أو الماصات. عند وضع كلوروفورم ، سحب علي سداده ببطء لمنع إدخال فقاعات الغاز في الحقنه.
  4. استخدام المحاقن الزجاجية لنقل الدهون الأسهم كما هو محسوب في أنبوب ثقافة الزجاج نظيفه لجعل خليط الدهون النهائي من 1 ٪ PI3P ، 20 ٪ ergosterol ، 30 ٪ PS ، PC (الجدول 1). اعتمادا علي المذيبات يتم أعاده تعليق كل الدهون في, قد يتحول الخليط غائم عند أضافه كل الدهون.
    ملاحظه: لتغيير تركيزات PS (0-30 ٪) ، وضبط وحدات التخزين وفقا لذلك وتعويض مع مختلف PC (الجدول 1).
  5. جفف بعناية خليط الدهون باستخدام غاز النيتروجين الموجه إلى خليط الدهون في حركه دائريه لتجفيف الدهون بشكل موحد. استخدام تدفق الغاز منخفضه للحفاظ علي الدهون في الجزء السفلي من أنبوب زجاجي اثناء عمليه التجفيف. التفاف أنبوب ثقافة الزجاج مع إحباط ، وترك فتح كشف ، وكذلك ديهيدرات في فراغ لمده 1 ساعة.
  6. أضافه 400 μL من العازلة ملزمه (50 mM تريس الأس الهيدروجيني 7.4 ، 300 mM كلوريد الصوديوم ، 1 مم MgCl2) لأزاله الدهون تماما لجعل تركيز الشحمية النهائية من 2.5 mm.
    ملاحظه: يمكن تعديل تركيز الشحمية النهائي عن طريق أضافه أكثر أو اقل العازلة ملزمه. علي سبيل المثال ، يمكن أضافه المخزن المؤقت للربط μL 200 لإنتاج تركيز الشحمية من 5 مم إذا لزم الأمر (انظر أدناه).
    1. أعاده تعليق الدهون عن طريق الاهتزاز علي سرعه متوسطه علي دوامه في درجه حرارة الغرفة لمده 30 دقيقه. يجب ان تظهر العازلة غائما كما يتم أعاده تعليق الدهون.
  7. نقل الشحمية أعاده تعليق إلى أنبوب الطرد المركزي الصغير. ومن هذه النقطة ، يمكن استخدام نصائح الماصة البلاستيكية لان الدهون لم تعد معلقه في كلوروفورم. لاحظ ان الحل الشحمية يجب ان تبدو غائمة.
  8. تجميد-ذوبان الدهون الشحمية سبعه إلى ثماني مرات من خلال دمج أنبوب الطرد المركزي الاولي في النيتروجين السائل ، ثم في 37 درجه مئوية حمام المياه. يجب ان يظهر خليط الشحمية المجمدة تماما والصلبة بالعين قبل ذوبان.
  9. تنفيذ الخطوات التي تنطوي علي كلوروفورم في غطاء الدخان الكيميائي. تنظيف اثنين من المحاقن الزجاجية 1 مل عن طريق وضع ونبذ كميات كامله من المحاقن كلوروفورم ، ثلاث مرات لكل منهما ، لأزاله اي الدهون المتبقية. تتوازن كل حقنه زجاجيه مع الماء نقاء من خلال وضع اثنين من وحدات التخزين حقنه ، ثم تتوازن مع العازلة ملزمه عن طريق وضع اثنين من حجم الحقنه.
  10. تجميع مصغره الطارد وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. تتوازن 1 200 nm غشاء وقطعتين من مرشح يدعم (انظر جدول المواد) عن طريق دمج كل في المخزن المؤقت ملزمه.
  11. ساندويتش الغشاء بين مرشح يدعم ومكان في مصغره الطارد. للحد من حجم القتلى في تجميعها مصغره الطارد والتاكد من ان التجمع هو الهواء ضيق ، تمرير حجم العازلة ملزمه مماثله لحجم الخليط الشحمي من خلال مصغره الطارد باستخدام المحاقن الزجاجية 1 مل.
  12. استخدم واحده من المحاقن الزجاجية 1 مل وارسم خليط الليلينوم. عكس أنبوب الطرد المركزي لجمع آخر من خليط الدهنية في غطاء أنبوب لرسم حتى في حقنه زجاجيه.
  13. البثق الشحمية عن طريق تمرير من خلال 200 nm غشاء 19-21 مرات. جمع الجسيمات الشحمية مقذوف في أنبوب الطرد المركزي الجديد.
    ملاحظه: يجب ان تظهر الدهنيات مقذوف اقل غائم من الدهنية قبل قذف. وينبغي ان تستخدم الجسيمات الشحمية في نفس اليوم وتخزينها علي الجليد. القذف الأخير يجب ان يضع الشحمية في الحقنه المعاكسة لتلك التي بدات فيها.

4. SNX-شريط ليبوسوم ملزمه والأنابيب

  1. البروتين المنقي preclear في 100,000 x g في القصبة الطاردة لمده 20 دقيقه في 4 درجه مئوية قبل اجراء الاختبارات ملزمه الدهنية والترسيب. أزاله ماده طافي ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد. لا تخل بيليه إذا كان هناك واحد.
  2. لاجراء اختبارات ملزمه الشحمية والأنابيب ، احتضان 4 μM تنقيه Snx4-Atg20 و 2.5 mM الدهنية في حجم التفاعل الكلي من 20 μL ، متفاوتة في حجم الجسيمات الشحمية المضافة.
    ملاحظه: في نفس التجربة ، يجب استخدام نفس حجم الدهون الشحمية.
  3. احتضان رد الفعل في 30 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
    ملاحظه: نقترح تعظيم كميه 2.5 mM الشحمية المضافة إلى كل رد فعل باستخدام ما لا يقل عن 10 μL الدهنية للسماح للتصور اثناء الترسيب. إذا تم استخدام 10 μL من 2.5 mM الجسيمات الشحمية في رد فعل 20 μL ، سيكون التركيز النهائي من الدهنية 1.25 mM. إذا كانت البروتينات المنقية مخففه والمزيد من الحجم مطلوب للبروتين 4 μM ، قد يتم أعاده تعليق الدهون في 200 μL خلال خطوه الاماهه لمضاعفه تركيز الشحمية (انظر الخطوة 3.6) ؛ ومع ذلك, وهذا يتطلب معرفه تركيز البروتين قبل صنع الشحمية.
  4. تصور وكميه الأنبوب الشحمي.
    1. معالجه التفاعلات الدهنية ملزمه علي الفور لتحليل المجهر الكترون. عينات بقعه علي شبكه النحاس المغلفة بالكربون ووصمه عار السلبية باستخدام 1 ٪ اليورانيل خلات (الشكل 5ب)16.
    2. تحليل العينات علي المجهر الكترون الإرسال (200 kV).
    3. استخدام برنامج تحليل الصور لقياس وتحديد قطر البولي. للقياس الكمي الدقيق لقطر البولية الواحدة ، خذ ثلاثه قياسات قطرها طول الأنبوب والمتوسط (الشكل 5ب).
      ملاحظه: واستخدم تحليل التباين في الاتجاهين لتحديد الاهميه الاحصائيه (الشكل 5(ه)). خلات اليورانيل علي حد سواء المشعة والسامة. مطلوب شهادة سلامه المختبر السليم لتنفيذ هذه الخطوة.
  5. التصاق الشحمي والترسيب.
    1. نقل رد الفعل (20 μl ، من الخطوة 4.3) إلى أنبوب الطرد المركزي البولي واستخدام الدوار متوافقة لتدور في 100,000 x g في اولتراسينتريفوجي لمده 20 دقيقه في 4 درجه مئوية. بعناية أزاله ماده طافي ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد. لاحظ ان بيليه يجب ان تبقي سليمه.
    2. أعاده تعليق بيليه في SDS-صفحه 40 μL من المخزن المؤقت عينه ونقل إلى أنبوب الطرد المركزي الجديد. أضافه 20 μL من المخزن المؤقت عينه إلى supernatant. تحميل كميات مكافئه من بيليه و ماده طافي في 10 ٪ بولياكرياميد SDS-صفحه هلام وأداء تلطيخ كوماسي لتصور snx-قضبان منضمة إلى الدهنية (الشكل 5ا).
    3. لتحديد كميه المركب SNX-بار في الجزء بيليه ، قياس كثافة النطاق باستخدام قياس الكثافة وقياس نسبه البروتينات SNX-بار في كسر بيليه.
      ملاحظه: واستخدم تحليل التباين في الاتجاهين لتحديد الاهميه الاحصائيه (الشكل 5(ج)).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقه للإنتاج وإنتاج قوي من الخميرة الذاتية SNX-بار المجمعات التي يمكن استخدامها لأعاده عرض الغشاء المصب الاختبارات (الشكل 1). بناء سلاله الخميرة المستخدمة لتنقيه يستفيد من كفاءه أعاده الدمج المتماثل في الخميرة الناشئة ، مما يسمح للتعديلات في مكاني الجينوم من القضبان snx المستهدفة (الشكل 2). هذا التصميم له ميزتين ، (ط) كما لا يلزم الاختيار للحفاظ علي التعديلات ، ويمكن استخدام المتوسطة يب القياسية ، مما يسمح للن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، ونحن نظهر سير العمل الأمثل لتنقيه الدمامل SNX-بار في الخميرة واثنين من المقايسات لتقييم خصائصها الفيزيائية الحيوية علي الدهنيات الاصطناعية. الميزة الرئيسية علي التعبير البروتين المؤتلف نموذجيه في القولونية أو غيرها من النظم هو القدرة علي التعبير بالتساوي SNX-بار البروتينات في المضيف الأصلي ، التالي تجنب المشاكل السمية وعدم الذوبان الموجودة في تنقيه snx-القضبان في أنظمه أخرى. ومن الجدير بالتنويه أيضا ان نظامنا لا يتطلب الاستنساخ الجزيئي أو إيواء ناقلات التعبير المتعددة17. لدينا سلالا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم GM060221 وجزءا من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية يدعم البحوث الواردة في هذا المنشور. الصحة تحت رقم الجائزة T32GM007223. وقد تم دعم المخيم جزئيا من قبل برنامج المنح البحثية لكليه قياده الجامعة شارلوت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 & m أغشية الكمبيوترAvanti610006
10 مل عمود كروماتوغرافيا Poly-Prep (Bio-Rad)Bio-Rad731-1550
27 G إبرةBD Biosciences301629
Amicon Ultra Ultra الطرد المركزي مع قطع 10KAmiconUFC501024
Avestin EmulsiFlex-C3 الخالطAvestinEF-C3
BCAبيرس23225
بيكمان أوبتيما ماكس-إكس بي الطرد المركزي الفائقبيكمان كولتر393315
كوكتيل كامل مثبط البروتيازروش4693116001
DOPCأفانتي850375
DOPSأفانتي840035
إرغوستيرول (سيجما)مجموعة الطارد سيجما47130-U
مع بلوك 0.2 & L / 1 ملAvanti610000
FEI Tecnai F20 مجهر إلكتروني ناقل الحركة (200 كيلو فولت)
أنابيب ثقافة زجاجيةVWR47729-570
IgG حبات سيفاروز (GE Healthcare)GE Healthcare17-0969-01
محاقن زجاجية ميكرولترهاميلتون7637-01
نيو برونزويك إكسيلا E25إيبندورفM1353-0000أو ما يعادلها اهتزاز 30 درجة ؛ C
Ni-NTA خرز الاغاروز المغناطيسيبيرس78605
Optima XE-90 جهاز طرد مركزي فائقبيكمان كولترA94516
Parafilm MVWR52858-076
PI3PEchelonP-3016أو ما يعادل Echelon
تجميع زجاجة البوليكربونات بيكمانكولتر 355622
TLA-100 بزاوية ثابتة الدواربيكمان كولتر343840
نوع 45 Ti الدواربيكمان كولتر
فراغ المجفف ، أسفل وغطاء مع صمام المقبسVWR75871-436
مضخة فراغ الكاتيل (باسكال 2005 C1) A& J فراغPN07050
دوامة مع حامل رغوةVWR10153-838
VWR KIT MICROTUBEVWR12620-880

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
  2. Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79(2018).
  3. Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
  4. Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
  5. Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
  6. Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
  7. van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
  8. Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
  9. Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
  10. Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
  11. Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
  12. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  13. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  14. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  15. Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
  16. Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
  17. Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

SNX BAR HeterodimersYeast ExpressionProtein PurificationLiposome BindingMembrane RemodelingTransmission Electron MicroscopyUltracentrifugationLipid SpecificityProtein QuantificationExtruder Assembly

Related Articles