مقالة منهجية

قياس اثار البكتيريا والمواد الكيميائية علي نفاذيه المعوية من اليجان

DOI:

10.3791/60419

⸱

ديسمبر 3, 2019

 ,  ,  , 
1Gangneung Institute of Natural Products, Korea Institute of Science and Technology, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, Korea University of Science and Technology (UST)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كيفيه قياس نفاذيه المعوية من الايلي+آت Caenorhabditis. هذا الأسلوب مفيد للبحوث البيولوجية الاساسيه علي الصحة المعوية المتعلقة بالتفاعل بين البكتيريا المعوية والمضيفة وللكشف لتحديد عوامل بروبيوتيك والكيميائية لعلاج متلازمة الأمعاء المتسربة وامراض الأمعاء التهابيه.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الكائنات الحية ، فرط نفاذيه الأمعاء هو أحد الاعراض الخطيرة التي تؤدي إلى العديد من امراض الأمعاء التهابيه (IBDs). Caenorhabditis ايليتس هو نموذج الحيوانية غير الثدييات التي تستخدم علي نطاق واسع كنظام الفحص بسبب عمرها القصير ، والشفافية ، والفعالية من حيث التكلفة ، وعدم وجود قضايا الأخلاق الحيوانية. في هذه الدراسة, تم تطوير طريقه للتحقيق في اثار البكتيريا المختلفة و 3, 3 '-دييندوليلميميثان (خافت) علي نفاذيه الأمعاء من c. اليجانينات مع نظام تحليل الصور عاليه الانتاجيه. كانت الديدان مصابه ببكتيريا الأمعاء المختلفة أو cotreated مع DIM ل 48 h وتتغذي مع فلوريسئين ايزوثيسيانات (FITC)-ديكدكان بين عشيه وضحيها. ثم ، تم فحص نفاذيه الأمعاء عن طريق مقارنه الصور مضان وكثافة مضان داخل الهيئات دوده. قد يكون هذا الأسلوب أيضا القدرة علي تحديد بروبيوتيك والبكتيريا المعوية المسببة للامراض التي تؤثر علي نفاذيه الأمعاء في نموذج الحيوانية وفعاله لدراسة اثار المواد الكيميائية الضارة أو تعزيز الصحة علي نفاذيه الأمعاء والصحة المعوية. ومع ذلك ، فان هذا البروتوكول لديه أيضا بعض القيود الكبيرة علي المستوي الجيني ، وخاصه لتحديد الجينات التي يتم تغييرها للسيطرة علي المرض ، لان هذا الأسلوب يستخدم في الغالب لتحديد النمط الظاهري. الاضافه إلى ذلك ، يقتصر هذا الأسلوب لتحديد بالبالضبط اي المواد المسببة للامراض تسبب التهاب أو زيادة نفاذيه الأمعاء الديدان اثناء العدوى. ولذلك ، هناك حاجه إلى مزيد من الدراسات المتعمقة ، بما في ذلك التحقيق في اليه الوراثية الجزيئية باستخدام البكتيريا المتحولة والديدان الخيطية ، فضلا عن تحليل المكونات الكيميائية للبكتيريا ، لتقييم كامل وظيفة البكتيريا والمواد الكيميائية في تحديد نفاذيه الأمعاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعتبر نفاذيه الأمعاء واحده من الحواجز الرئيسية المتعلقة بالجراثيم المعوية والمناعة المخاطية ومن المرجح ان تتاثر بعوامل عديده ، مثل تعديلات الأمعاء الدقيقة ، والضعف الظهاريه ، أو تعديلات طبقه المخاط1. وقد أفادت الصحف الاخيره بروتوكولات فعاله لقياس نفاذيه الأمعاء من خلايا الأمعاء البشرية مثقف من خلال تحليل معدلات الجريان الفلورية عبر طبقه الخلايا المعوية2، ولكن عدد اقل من الأوراق البحثية تقديم اجراء مناسب لقياس نفاذيه الأمعاء في الديدان الخيطية ، وخاصه في c. اليجنيديس.

هناك نوعان من البروتوكولات التمثيلية لقياس نفاذيه الأمعاء في c. اليجليفس باستخدام النيل الأحمر3 والصوديوم ايرغلولوسين (أو فحص الحوت)4,5. في هذا البروتوكول ، استخدمنا FITC-ديدكغان (متوسط الوزن الجزيئي 10,000) ، الذي لديه وزن جزيئي اعلي بكثير من النيل الأحمر (MW = 318.37) والصوديوم الثنائي (MW = 792.85). FITC-ديدكغان هو أكثر تشابها من النيل الأحمر أو الاصباغ الصوديوم الثنائية إلى المغذيات الجزيئات الفعلية مثل الكربوهيدرات ، والتي يتم امتصاصها من خلال طبقه الأمعاء. نفاذيه المعوية من c. التي تغذيها الصوديوم erioglaucine (الأزرق الحوت صبغ) يمكن تقييمها بسهوله دون المجهر مضان. ومع ذلك ، في فحص الحوت ، والتحليل الكمي من نفاذيه الأمعاء من الصعب بسبب عدم وجود توحيد وينبغي تقييم يدويا4،5. في حاله الفحص الأحمر النيلي ، بقع النيل الحمراء أيضا قطرات الدهون في الخلايا ، والتي قد تتداخل مع التحديد الدقيق لنفاذيه الأمعاء في c. ايلينز6. تتيح البروتوكولات الحالية تحليلا كميا سريعا ودقيقا لنفاذيه الأمعاء في العلاج بالبكتيريا المعوية المختلفة والمواد الكيميائية مع تجنب تلطيخ الدهون بشكل غير محدد.

C. اليجايليس هو نموذج نموذجي في المجالات البيولوجية نظرا لسعره في المتناول ، والتلاعب سهله ، وقضايا الأخلاق الحيوانية محدوده ، وعمر قصير ، وهو أمر مفيد للتجارب السريعة7. وعلي وجه الخصوص ، بعد نشر الجينوم بأكمله ، تم العثور علي ما يقرب من 40 في المائة من الجينات الموجودة في المجين البشري بالجينات التي تسبب الامراض التي تصيب الإنسان8. وعلاوة علي ذلك ، فان هيئه شفافة تسمح المراقبة داخل الكائن الحي ، وهو أمر مفيد للبحث عن الاحداث الخلوية والتطبيقات الفلورية في بيولوجيا الخلية ، علي سبيل المثال ، تلطيخ الخلايا الجذعية مع DAPI أو مناعي9. C. وغالبا ما يستخدم اليجان كالحيوانية التجريبية لدراسة التفاعل بين الجراثيم الأمعاء والمضيف; الاضافه إلى ذلك ، يستخدم c. اليجراns لشاشه الصحة المعززة بروبيوتيك البكتيريا10،11،12 فضلا عنالمواد الكيميائية الغذائية تعزيزالصحة المعوية 13 ،14.

الزائفة الزنجاريه والمكورات المعوية البرازيه هي بكتيريا الأمعاء المعروفة التي تؤثر سلبا علي نظام الجهاز الهضمي ، وخاصه الخلايا الظهاريه قولون من الأمعاء15،16. ولذلك ، فان قياس نفاذيه الأمعاء الناجمة عن هذه البكتيريا ضروري لفحص وتطوير الادويه الجديدة التي يمكن ان تستعيد وتقلل من الضرر الناجم عن التهاب البكتيري والعدوى. في هذا البروتوكول ، اختبرنا اثار هذه البكتيريا المعوية علي نفاذيه الأمعاء من c. اليجايليس.

ونحن أيضا الإبلاغ عن بروتوكول الأمثل لاختبار المواد الكيميائية علي نفاذيه الأمعاء من c. اليجليس. لهذا الغرض ، استخدمنا 3 ، 3 '-دييندوليلميميثان (خافت) كنموذج الكيميائية لان خافت هو مركب المستقلب النشطة بيولوجيا المستمدة من indole-3-carbinol ، والتي هي موجودة في النباتات الغذائية براسيكا ، وقد أفيد ان لها اثار علاجيه علي ibd في الفئران17،18. الاضافه إلى ذلك ، اكتشفنا مؤخرا ان خافت يحسن الخلل الوظيفي نفاذيه الأمعاء في كل من خلايا الأمعاء البشرية مثقف ، فضلا عن نموذج الديدان الخيطية c. اليجايليس19.

في هذه الدراسة ، استخدمنا ثلاثه ظروف تجريبية مختلفه. أولا ، قمنا بقياس اثار البكتيريا المختلفة ، p. الزنجاريه و e. faecalis ، علي نفاذيه الأمعاء (الشكل 1). ثانيا ، قمنا بقياس تاثيرات الزنجاريه الحية والحرارية علي نفاذيه الأمعاء (الشكل 2). ثالثا ، قمنا بقياس اثار DIM (نموذج الكيميائية) علي نفاذيه المعوية من c. اليجان الفيدرالية مع الزنجاريه (الشكل 3).

وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير البروتوكولات الأمثل التي تقيس نفاذيه الأمعاء من c. اليجليس، والتي يتم تغييرها عن طريق العلاج مع البكتيريا المعوية المختلفة وكذلك مع المواد الكيميائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. اعداد الزنجاريه PAO1 و القولونية OP50 الثقافة

  1. اعداد 500 مل من المتوسطة المعقمة للوريا-بيرتاني (LB) (الجدول 1) وتطعيم مستعمره واحده من الزنجاريه في الوسط. احتضان الثقافة ل 14 إلى 15 ح في 37 درجه مئوية مع سرعه اهتزاز 150 دوره في الدقيقة.
  2. بالتساوي توزيع الثقافة البكتيرية في أنابيب الطرد المركزي 2 500 mL والطرد المركزي أنابيب في 3,220 x ز في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
  3. أزاله ماده طافي حتى حجم هو 50 mL (واحد عشر من حجم الاولي) وأعاده تعليق بيليه البكتيرية.
  4. تخزين الثقافة البكتيرية المركزة في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام. فتره تخزين الزنجاريه الثقافة يمكن ان تصل إلى 1 شهر ، ولكن الثقافة الطازجة هي أفضل للحث علي الاضرار المعوية.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. بالاضافه إلى البكتيريا الحية كلها ، يمكن استخدام ماده طافي من الثقافة البكتيرية لاختبار اثار البكتيريا المعوية19.
  5. لاعداد e. كولاي OP50 ، الثقافة e. كولاي OP50 في المتوسطة Dyt (الجدول 1) ومن ثم تطبيق خطوات مماثله لتلك المذكورة أعلاه ولكن إنقاص حجم إلى سدس حجم الأصلي. علي سبيل المثال ، إذا كان حجم الاوليه 500 mL ، بعد أزاله supernatant ، وحده التخزين المتبقية تقريبا 83 mL.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. اعداد المكورات المعوية البرازيه kctc 3206 الثقافة

  1. اعداد 500 مل من ضخ القلب تعقيم الدماغ (BHI) مرق (الجدول 1).
  2. تطعيم مستعمره واحده في 500 مل من مرق BHI واحتضان الثقافة ل 14-15 ح في حاضنه تهتز في 37 درجه مئوية و 150 دوره في الدقيقة.
  3. بالتساوي توزيع الثقافة البكتيرية في أنابيب الطرد المركزي 2 500 mL والطرد المركزي أنابيب في 3,220 x ز في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
  4. أزاله ماده طافي حتى حجم هو 50 mL (واحد عشر من حجم الاولي) وأعاده تعليق بيليه.
  5. تخزين الثقافة البكتيرية المركزة في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام. الثقافة الطازجة هو أفضل لاختبار الآثار علي نفاذيه الأمعاء.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

3. اعداد الحرارة المنشط ه. القولونية OP50 والحرارة المعطلة الزنجاريه PAO1 الثقافات

  1. الثقافة وحصاد البكتيريا كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.1 – 1.3).
  2. الحرارة --inactivate OP50 أو p. aeruginosa PAO1 الثقافة كما هو موضح سابقا20،21،22. لتنشيط الحرارة ، احتضان البكتيريا المعاد تعليقها في 65 درجه مئوية (حمام المياه) لمده 30 دقيقه.
  3. تبريد الثقافة البكتيرية المركزة إلى درجه حرارة الغرفة وتخزينها في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام. يمكن ان تصل فتره التخزين إلى شهر واحد.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

4. اعداد الديدان الخيطية المتوسطة النمو (NGM) لوحات لاختبار اثار البكتيريا المختلفة علي نفاذيه الأمعاء من c. ايلينجس

  1. مكان 1.25 غرام من peptone ، 1.5 غرام من كلوريد الصوديوم ، 8.5 غرام من أجار ، والسرج المغناطيسي و 487.5 مل من الماء المقطر في زجاجه 500 mL الزجاج (الجدول 1).
  2. تخلط الخليط جيدا ، الاوتوكلاف الخليط لمده 15 دقيقه في 121 درجه مئوية وتبرد الخليط إلى 55 درجه مئوية في حمام مائي لمده 30 دقيقه.
  3. أزاله المتوسطة من حمام المياه ، أضافه مكونات (0.5 mL من 1 M CaCl2، 0.5 ml من الكوليسترول ، 0.5 Ml من mgso4، 12.5 ml من kpo4) (الجدول 1) إلى ngm ، وتخلط جيدا.
    ملاحظه: يجب ان تكون جميع المكونات الفردية معقمه باستثناء الكوليسترول (المذاب في الايثانول المطلق) ، ويجب ان يتم كل خطوه تجريبية علي مقاعد البدلاء نظيفه.
  4. توزيع 20 مل من NGM لكل 90 x 15 مم طبق بيتري والسماح أجار ليصلب علي مقاعد البدلاء نظيفه في درجه حرارة الغرفة (حوالي 20 درجه مئوية). يمكن تخزين لوحات NGM لمده تصل إلى شهر واحد في 4 درجه مئوية.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. وقد أعدت لوحات NGM المستخدمة لتلطيخ FITC-ديكسكان بنفس الاجراء (من الخطوات 4.1-4.3). تم توزيع 10 مل من NGM إلى كل 60 x 15 مم طبق بيتري ويسمح ليصلب علي مقاعد البدلاء نظيفه في درجه حرارة الغرفة (حوالي 20 درجه مئوية).
  5. أزاله الثقافة البكتيرية من الثلاجة 4 درجات مئوية ودوامه الثقافة جيدا قبل نشر الثقافة علي لوحات NGM.
  6. أضافه ما مجموعه 800 μL من الثقافة البكتيرية لكل لوحه NGM الطازجة ، والسماح للوحات لتجف في حاضنه 20 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
    ملاحظه: للتجربة الاولي (الشكل 1) ، وقد أعدت لوحات ngm اثنين مع e. القولونية OP50 ، واحده لوحه ngm مع الزنجاريه PAO1 ، ولوحه ngm واحده مع e. البرازيه KCTC3206. للتجربة الثانية (الشكل 2) ، وقد أعدت لوحات ngm اثنين مع الحية e. القولونية OP50 ، واحده لوحه ngm مع الزنجاريه PAO1 الحية ، ولوحه ngm واحده مع الحرارة المعطل الزنجاريه PAO1.

5. اعداد لوحات NGM لاختبار اثار المواد الكيميائية (خافت) علي نفاذيه الأمعاء من c. الزنجاريه الفيدرالية مع p..

  1. أضافه 0.5 غرام من peptone ، 0.6 غرام من كلوريد الصوديوم ، 195 مل من الماء المقطر ، والسرج المغناطيسي ، و 6.8 غرام من أجار إلى زجاجه 500 mL الزجاج (أجار NGM).
  2. أضافه 0.5 غرام من peptone ، 0.6 غرام من كلوريد الصوديوم ، 195 مل من الماء المقطر ، والركاب المغناطيسي دون أجار إلى آخر زجاجه 500 mL الزجاج (مرق NGM).
  3. الاوتوكلاف زجاجتين (من الخطوات 5.1-5.2) ، واحده فارغه زجاجه 100 mL الزجاج ، وزجاجه واحده فارغه 500 mL الزجاج لمده 15 دقيقه في 121 درجه مئوية. ثم ، اسمحوا المتوسطة التي تحتوي علي زجاجات لتبرد إلى 55 درجه مئوية في حمام المياه لمده 30 دقيقه. الحفاظ علي المتوسط أجار في حمام المياه وأزاله الزجاجة التي تحتوي علي مرق (من الخطوة 5.2) للخطوة التالية.
  4. أضافه المواد الكيميائية المضافة إلى مرق NGM: 0.4 mL من 1 M CaCl2، 0.4 ml من الكوليسترول في الايثانول (مل) ، 0.4 مل من 1 م mgso4 و 10 مل من 1 م kpo4 (يجب تعقيم جميع هذه المكونات وبصرف الكلي عن الكولسترول في الايثانول). ثم ، يحرك الخليط جيدا مع الركاب المغناطيسي في 55 درجه مئوية.
  5. تسميه الزجاجة الزجاجية 500 ml معقمه فارغه مع سلفوكسيد ثنائي الميثيل (dmso) ومعقمه فارغه 100 ml زجاجه مع خافت.
  6. نقل 50 مل من مرق NGM في زجاجه خافت المسمي 100 mL. أضافه 500 μL من 20 مم DIM الأسهم في زجاجه وتخلط جيدا.
    ملاحظه: يتم حل خافت في DMSO (20 مم DIM الأسهم).
  7. بسرعة أزاله NGM أجار المتوسطة من حمام المياه ، أضافه 50 mL من المتوسط أجار NGM في زجاجه خافت المسمي وتخلط جيدا.
  8. ضعي 20 مل من السائل الذي يحتوي علي المتوسط NGM في كل 90 مم × 15 ملم من طبق بيتري. يمكن اجراء ما يقرب من خمس لوحات NGM التي تحتوي علي خافت من هذه الخطوة.
    ملاحظه: التركيز النهائي من خافت في كل لوحه NGM سيكون 100 μM.
  9. لاعداد لوحه NGM المحتوية علي DMSO ، نقل 150 مل من مرق NGM في زجاجه 500 mL DMSO المسمي. أضافه 1.5 مل من DMSO إلى الزجاجة وتخلط جيدا.
  10. أضافه 150 mL من المتوسط أجار NGM إلى زجاجه DMSO-المسمي وتخلط جيدا.
  11. ضعي 20 مل من السائل المتوسط المحتوي عليه من DMSO في كل 90 مم × 15 مم من طبق بيتري. يمكن اجراء حوالي خمسه عشر لوحات NGM التي تحتوي علي DMSO من هذه الخطوة.
    ملاحظه: سيكون التركيز النهائي لل DMSO في كل لوحه NGM 0.5 ٪.
  12. يقوي الصفائح في درجه حرارة الغرفة لمده 3 ساعات علي الأقل ويخزنها عند 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  13. أزاله e. القولونية OP50 أو p. الزنجاريه PAO1 الثقافة من 4 درجه مئوية الثلاجة (من الخطوة 1.4) ودوامه الثقافة بشكل صحيح قبل الانتشار علي لوحات ngm.
  14. وضع 800 μL من e. القولونية OP50 أو p. الزنجاريه PAO1 ثقافة بكتيرية علي كل لوحه أجار ngm الطازجة والسماح للوحات لتجف في حاضنه 20 ° c بين عشيه وضحيها.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. بالنسبة للتجربة الثالثة (الشكل 3) ، تم اعداد لوحين ngm المحتوية علي dmso المغلفة مع الحية e. القولونية OP50 ، واحده dmso التي تحتوي علي لوحه ngm المغلفة مع الزنجاريه PAO1 الحية ، وواحده خافته التي تحتوي علي لوحه ngm المغلفة مع الزنجاريه PAO1.

6. التحضير للعمر--المتزامنة c. اليجس

  1. تنمو الديدان علي لوحه NGM الصلبة وإطعامهم مع e. القولونية OP50 حتى يتم التوصل إلى السكان المطلوبين.
  2. مزامنة البيض باستخدام اما طريقه وضع البيض موقوتة أو علاج التبييض الحل كما هو موضح سابقا20،23،24.

7. علاج البكتيريا أو التغذية الخافتة والfitc-ديكسكان

  1. احتضان البيض متزامنة مع العمر في 20 درجه مئوية ل 64 h علي لوحات NGM تستكمل مع العيش e. كولاي OP50 as الغذاء.
  2. اغسل اليرقة L4 المتزامنة مع العمر مع S-العازلة ونقلها (أكثر من حوالي 500 الديدان) إلى لوحات NGM العلاج التي تحتوي علي البكتيريا والمواد الكيميائية المختلفة (الموصوفة في ملاحظه الخطوة التالية 4.6 و 5.14 ،). احتضان لهم في 20 درجه مئوية ل 48 h.
    ملاحظه: يمكن ان تتراوح مده العلاج من 24 إلى 72 ساعة ، وفقا للبكتيريا والمواد الكيميائية المستخدمة. يمكن أيضا تقييم التاثير العلاجي أو الوقائي من DIM عن طريق المعالجة المسبقة لديدان مع مسببات الامراض ومن ثم علاج الديدان مع خافت (التاثير العلاجي) أو عن طريق المعالجة المسبقة لديدان مع خافت ومن ثم علاج مع مسببات الامراض (التاثير الوقائي)19.
  3. لاعداد لوحات FITC-ديديكسان المكملة ، مزيج 2 مل من الحرارة المنشطة e. القولونية OP50 مع 4 ملغ من fitc-ديكستين. ثم, تقسيم 100 μL من FITC-ديكسكان و e. القولونية OP50 الخليط إلى عشرين لوحات أجار ngm الطازجة (60 مم × 15 مم) والسماح للوحات لتجف ل 1 ح علي مقاعد البدلاء نظيفه.
    ملاحظه: سيكون التركيز النهائي لل FITC-ديدككان في كل لوحه NGM 20 ميكروغرام/مل.
  4. اعداد خمسه e. القولونية OP50-التي تحتوي علي لوحات ngm دون fitc-ديكسكان لعلاج التحكم في السيارة. لهذا الغرض ، تقسيم 100 μL الحرارة المعطلة e. القولونية OP50 إلى كل جديد ngm أجار لوحات (60 مم × 15 ملم) والسماح للوحات لتجف ل 1 ح علي مقعد نظيف.
    ملاحظه: بالنسبة لكل تجربه مستقله ، هناك حاجه إلى خمسه عشر لوحا من ألواح NGM المكملة لكل من الطرازين و 5 لوحات NGM بدون FITC-ديكسان.
  5. بعد 48 h من العلاج (من الخطوة 7.2) ، وغسل الديدان مع S-العازلة ، ونقل الديدان إلى اللوحات FITC-ديكسكان تكمله ولوحات NGM دون FITC-ديكسكان ، واحتضان لوحات بين عشيه وضحيها (14-15 ح).
    ملاحظه: لكل مجموعه العلاج ، مطلوب 5 نسخ متماثلة من تلطيخ FITC-ديكسكان (أو التغذية التحكم في السيارة).
  6. غسل الديدان مع S-العازلة والسماح لهم الزحف في لوحه أجار NGM الطازجة ل 1 ح.
    ملاحظه: لكل تجربه مستقله ، هناك حاجه إلى ما مجموعه 20 لوحات NGM الطازجة. في هذه الخطوة ، يمكنك استخدام لوحه NGM تستكمل دون أو مع e. كولاي OP50.
  7. أضافه 50 μL من محلول الفورمالديهايد 4 ٪ لكل بئر من اسود 96-بئر مسطحه أسفل لوحه. نقل ما يقرب من 50 الديدان من كل لوحه NGM في كل بئر لقياسات مضان. بعد 1 إلى 2 دقيقه ، أزاله كامل الفورمالديهايد من كل بئر وأضافه 100 μL من المتوسطة المتصاعدة لمعطف الآبار.
    ملاحظه: محلول الفورمالديهايد (4 ٪) يستخدم لشل وإصلاح الديدان. بالنسبة لكل مجموعه علاج ، يتم استخدام 5 ابار (5 نسخ متماثلة) لتحليل الصور.

8. التصوير c. ايليجنس مع نظام التصوير Operetta وتحديد نفاذيه الأمعاء عن طريق قياس امتصاص الفلورية fitc-ديكسان

ملاحظه: يمكن استخدام ستيريوميكروسكوبي الفلورسنت لتحليل الصور بدلا من نظام Operetta.

  1. التقاط الصور الفلورية وقياس كثافة مضان باستخدام نظام التصوير العالي المحتوي Operetta وتحليل الصور مع برنامج هارموني.
  2. في برنامج Harmony ، اضغط علي الايقونه المفتوحة لفتح الغطاء ووضع اللوحة في الجهاز.
  3. قم باعداد المعلمات.
  4. انقر فوق اعداد، حدد نوع لوحه (96-بئر كورنينج مسطحه القاع) وأضافه القناات (المجال الساطع وقناات egfp).
  5. اضبط التخطيط. انتقل إلى تحديد التخطيط، ثم حدد تعقب وضبط المعلمات (الصورة الاولي في 1 μm ، عدد الطائرات هي 10 ، المسافة 1 μm).
  6. حدد واحده من الآبار المعالجة وحقل التقاط واحد والصحافة اختبار للتحقق ما إذا كانت الصور مرضيه في قسم التجربة التشغيل .
  7. إذا كانت الصور مرضيه ، فارجع إلى القسم اعداد واضغط علي أيقونه أعاده التعيين في نهاية الشاشة. ثم حدد كل الآبار المستهدفة وعدد مناسب من حقول التقاط.
  8. انتقل إلى تشغيل التجربة مره أخرى وادخل اسم اللوحة ، ثم اضغط علي أبدا لبدء المعالجة.
  9. لقياس كثافة الفلورية ، انتقل إلى قسم تحليل الصور وإدخال الصورة. العثور علي الخلية عن طريق اختيار قناه EGFP والطريقة b. ضبط العتبة المشتركة إلى 0.5 ، منطقه إلى > 200 μm2، وتقسيم عامل إلى 3.0 ، عتبه الفردية إلى 0.18 وعلي النقيض من أكثر من 0.18. ثم قم بحساب خصائص الكثافة واختر المتوسط كالاخراج. اضغط علي أيقونه تطبيق لحفظ الاعداد.
  10. انتقل إلى قسم التقييم لقياس الكثافة عن طريق الحصول علي خريطة الحرارة وجدول البيانات. تعيين المعلمة قراءات إلى خلايا — الكثافة الخلية egfp يعني-في بئر وبدء التقييم.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  11. لاستخراج البيانات من Operetta ، انقر فوق الزر اعداد واختر أداره البيانات.
  12. اختر كتابه الأرشيف، ثم افتح الاستعراض وحدد الملف.
  13. لتحديد الملف ، انقر فوق الاشاره الصغيرة + في الزاوية اليسرى ، ثم انقر فوق القياس واختر اسم اللوحة.
  14. حدد الملف ثم انقر فوق موافق.
  15. حدد المسار لحفظ الملف بالنقر فوق اشاره الاستعراض في المسار النشط.
  16. انقر فوق أبدا لحفظ ملف البيانات.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

9. التحليل الإحصائي لل FITC-ديكسكان الفلورية من c. اليجان

  1. استيراد البيانات وحساب المتوسط والانحراف المعياري (SD) باستخدام برنامج إحصائيات.
  2. تحليل الفرق الكبير مع تحليل اتجاه واحد من التباين (ANOVA) متبوعا باختبار المقارنة المتعددة Tukey.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد الحضانة مع p. الزنجاريه PAO1 ، وأظهرت c. اليجايليس زيادة كبيره في الفلورية fitc-ديكسكان في الجسم دوده مقارنه مع الفلورية التي تظهر بعد الحضانة مع سلالات بكتيرية أخريين (الشكل 1). كثافة مضان من الديدان التي تغذيها e. القولونية OP50, p. الزنجاريه PAO1, و e. البرازيه KCTC3206 كانت 100.0 ± 6.6, 369.7 ± 38.9, 105.6 ± 10.6%, علي التوالي. وتؤكد البيانات ان الزنجاريه تسبب ضررا أكثر حيوية لحاجز الأمعاء الظهاريه ، التالي ، أظهرت الديدان زيادة ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال استخدام هذه الطريقة الجديدة لتحديد نفاذيه الأمعاء في c. اليجايليس ، والذي يجمع بين المجهر الألى المجهري وتحليل الصورة الكمية ، والاختلافات الناجمة عن الكائنات المجهرية المعوية أو المواد الكيميائية يمكن تحديدها في الجسم المجري ، وتحديدا في الأمعاء c. . هذا البروتوكول مفيد للتحقيقات نفاذيه الأمعاء وتنطبق علي العديد من المهام ، مثل تحديد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في ظل ظروف الإجهاد والفحوص المورفولوجية ، وذلك بسبب راحتها والتلاعب سهله. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد اثار الطر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حظيت هذه الدراسة بدعم معهد كوريا للبحوث العلمية والتكنولوجية (2E29563).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
3،3'-diindolylmethane سيجماD9568
90 & مرة ؛ أطباق بتري 15 ممSPL علوم الحياة ، كوريا الجنوبية10090
60 & مرة ؛ أطباق بتري 15 ملمSPL علوم الحياة ، كوريا الجنوبية10060
باكتر أجاربيكتون ديكنسونالمرجع 214010
محلول الفورمالديهايد سيجماF1635
تسريب قلب الدماغ (BHI)  Becton DickinsonREF. 237500
Caenorhabditis elegans N2مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC)النوع البري 
الكوليسترولسيجماC3045
كوستا ، 96 بئر أسود مع قاع مسطح شفاف غير معالج ، بدون غطاء بوليسترينكورنينج إنكوربوريتدالمرجع 3631
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigmaD2650
المكورات المعوية البرازية KCTC 3206المجموعة الكورية لثقافة النوعKCTC رقم 3206القولونية اللاهوائية
OP50مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC)
الفلورسين إيزوثيوسيانات - dextranSigmaFD10S
Harmony software PerkinElmerverson 3.5
Luria-Bertani LB متوسطMerckVM743185 626  1.10285.5000
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات فيشر BioreagentsBP2213-1
Fluoromount تصاعد مائي متوسطSigmaF4680
Operetta CLS نظام تحليل المحتوىالعالي PerkinElmer& nbsp ؛ HH16000000
PeptoneMerckEMD 1.07213.1000
Pseudomonas aeruginosa PA01المجموعة الكورية لثقافة النوعKCTC رقم 1637
كواشف حيويةلكلوريد الصوديومفيشر BP358-1
مجهر ستيريونيكون ، اليابانSMZ800N
مستخلص الخميرةBecton DickinsonREF. 212750
لوحة فحص الإشريكية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189(2014).
  2. Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
  3. Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26(2018).
  4. Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
  5. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135(2016).
  6. Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352(2018).
  7. Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
  8. Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
  9. Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
  10. Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441(2018).
  11. Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
  12. Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
  13. Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290(2014).
  14. Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
  15. Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
  16. Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
  17. Huang, Z., et al. 3,3'-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
  18. Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3'-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
  19. Kim, J. Y., et al. 3,3'-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
  20. Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437(2017).
  21. Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
  22. Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  25. Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227(2015).
  26. Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791(2018).
  27. Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 5 979-984 (1983).
  28. Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
  29. Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
  30. Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
  31. Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
  32. Kim, Y. H., et al. 3,3'-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
  33. Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
  34. Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C elegans FITC DIM Operetta Harmony

مقالات ذات صلة