يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي

9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/60486

⸱

نوفمبر 7, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Pediatrics and Communicable Diseases, University of Michigan Medical School, 3Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, 4Graduate Program in Cellular and Molecular Biology, University of Michigan Medical School, 5Undergraduate Research Opportunity Program, University of Michigan, 6Department of Surgery, Ann Arbor Veterans Affairs Healthcare System

في هذه المقالة

ملخص

نحن وصف 3D الإنسان مصفوفة خارج الخلية-الخلايا الشحمية في المختبر نظام الثقافة التي تسمح تشريح ادوار المصفوفة والخلايا الشحمية في المساهمة في النسيج الدهني النمط الظاهري الأيضي.

الملخص

المصفوفة خارج الخلية (ECM) يلعب دورا محوريا في تنظيم التوازن الانسجه ، والانخراط في المتبادل مع الخلايا وتنظيم جوانب متعددة من وظيفة الخلوية. ال ECM يلعب دورا هاما بشكل خاص في وظيفة الانسجه الدهنية في السمنة ، والتعديلات في الانسجه الدهنية ترسب المحتوي والتركيب ترتبط بالامراض الايضيه في الفئران والبشر. النماذج العريكته في المختبر التي تسمح بتشريح ادوار ECM والخلايا في المساهمة في النمط الظاهري للانسجه العالمية هي متفرقة. ونحن نقدم رواية 3D في نموذج المختبر للثقافة البشرية ECM-الخلايا الشحمية التي تسمح بدراسة الأدوار المحددة لل ECM والخلايا الشحمية في تنظيم النسيج الدهني النمط الظاهري الأيضي. الانسجه الدهنية البشرية هي decellularized لعزل ECM ، والتي يتم أعاده ملؤها فيما بعد مع الخلايا الشحمية التي يتم بعد ذلك تمييزها داخل ECM إلى الخلايا الشحمية ناضجه. ينشئ هذا الأسلوب بنيات الخلايا الشحمية التي تعمل بالأيض وتحافظ علي خصائص الانسجه والمرضي الذين يتم اشتقاقهم منها. وقد استخدمنا هذا النظام لإثبات المرض محدده ECM-الخلية الشحمية المتبادلة في الانسجه الدهنية البشرية. يوفر نموذج الثقافة هذا أداه لتشريح ادوار ECM والخلايا الشحمية في المساهمة في النمط الظاهري الأيضي للانسجه الدهنية العالمية ويسمح بدراسة دور ECM في تنظيم توازن الانسجه الدهنية.

المقدمة

مصفوفة خارج الخلية (ECM) لا يوفر فقط سقالة ميكانيكيه للانسجه ، ولكن أيضا يشارك في المتبادل معقده مع الخلايا التي تعيش داخلها ، وتنظيم العمليات المختلفة اللازمة للتوازن الانسجه ، بما في ذلك انتشار الخلايا ، التمايز ، والإشارات ، والأيض1. علي الرغم من ان ECM الصحي يلعب دورا أساسيا في الحفاظ علي وظيفة الانسجه الطبيعية ، فقد تورط في امراض متعددة2.

الانسجه الدهنية يلعب دورا هاما في التسبب في الامراض الايضيه. ويرتبط السمنة مع تضخم الخلايا الشحمية المفرطة ونقص الأكسجين الخلوي ، والعيوب في الأيض الخلوية الشحمية ، والانسجه الدهنية الشبكية إندوبلازمي والاكسده والتهاب. في حين سوء فهم, هذه العمليات المعقدة يتامرون لاضعاف المغذيات الانسجه الدهنية القدرة التخزين المؤقت, مما يؤدي إلى تجاوز المغذيات من الانسجه الدهنية, سميه في الانسجه المتعددة, وامراض الأيض الجهازية3,4 ،5. تسلسل الاحداث واليات المحددة التي تكمن وراء فشل الانسجه الدهنية غير مفهومه بشكل سيئ ، ولكن التعديلات في الانسجه الدهنية ECM قد تورطت. يتم تغيير تكوين ECM داخل الانسجه الدهنية في السمنة البشرية والمريدين ، مع زيادة ترسب بروتين ECM جنبا إلى جنب مع الاختلافات النوعية البيوكيميائية والهيكلية في الانسجه الدهنية ECM المرتبطة بالامراض الايضيه البشرية ، بما في ذلك النوع 2 من السكري والدهون6,7,8,9,10,11.

وعلي الرغم من هذه الملاحظات, دور الانسجه الدهنية ECM في التوسط الخلل الوظيفي الانسجه الدهنية ليست محدده جيدا. ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود نماذج تجريبية عريكة تسمح بتشريح الأدوار المحددة لECM والخلايا الشحمية في تنظيم وظيفة الانسجه الدهنية النهائية. ثقافة ECM-الخلايا الشحمية يحاكي أفضل في بيئة الجسم الطبيعي من الانسجه الدهنية الاصليه في اثنين علي الأقل من النواحي. أولا ، توفر ثقافة ECM بيئة جزيئيه مماثله للانسجه الدهنية الاصليه ، بما في ذلك الانسجه الاصليه ، واللدائن ، وغيرها من البروتينات المصفوفة الغائبة في الثقافة ثنائيه الابعاد القياسية. ثانيا, وقد أظهرت الثقافة علي 2D البلاستيك لتغيير الأيض الخلايا الشحمية عن طريق الآثار الميكانيكية بسبب انخفاض مرونة الركيزة البلاستيك12, الذي ECM-الثقافة يلغي.

وقد درست أساليب لهندسه السقالات البيولوجية عن طريق عزل ECM من الدهون الدهنية وغيرها من الانسجه في سياق الطب التجديدي والترميمي وهندسه الانسجه13،14، 15،16،17،18. وقد نشرنا سابقا المنهجية التي قمنا بتكييف هذه الأساليب لتطوير نموذج 3D في المختبر من ثقافة الإنسان-الخلية الشحمية ، وذلك باستخدام ECM والخلايا الجذعية الخلية الشحمية المستمدة من الانسجه الدهنية البشرية الأحشاء11. في هذه المقالة ، نقوم بوصف هذه الأساليب بالتفصيل. اجراء التقطير للانسجه الدهنية البشرية هو عمليه لمده أربعه أيام التي تنطوي علي العلاجات الميكانيكية والانزيميه لأزاله الخلايا والدهون ، وترك سقالة البيولوجية التي تحافظ علي خصائص الانسجه التي تستمد منها. Decellularized ECM يدعم التمايز اديبوغينيك من الخلايا الشحمية البشرية ، وعند أعاده تشكيلها مع الخلايا الشحمية ، ويحافظ علي الهندسة المجهرية والخصائص البيوكيميائية والامراض الخاصة بالانسجه الدهنية سليمه ويشارك في الأيض وظائف مميزه من الانسجه الدهنية الاصليه. هذه المصفوفة يمكن دراستها وحدها أو أعاده الانفصال مع الخلايا ، والسماح بدراسة التفاعلات والتبادل بين المكونات الخلوية وخارج الخلوية من الانسجه الدهنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتم شراء الانسجه الدهنية من الأشخاص الذين يخضعون لجراحه السمنة الاختيارية تحت موافقه مجلس المراجعة المؤسسية.

1. العزل قبل الخلية واعداد كاشف الثقافة

  1. اعداد 2 ٪ الزلال المصل البقري (جيش الصرب البوسنيين) في 1x الفوسفات مخزن محلول ملحي (تلفزيوني). تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.
  2. اعداد النوع الثاني كولاجيناز: 2 مغ/مل في 2 ٪ بوسني في 1x تلفزيوني. استعد فورا قبل الاستخدام.
  3. اعداد خليه الدم الحمراء (ربك) ليسينج الحل: 1.5 M NH4Cl ، 100 مم ناهكو3، 10 مم الصوديوم أدتا في ديمتاين المياه (دي/ح2س). يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية. اعداد 1x ربك ليسينج الحل من 10x حل الأسهم في DI/H2O مباشره قبل الاستخدام.
  4. اعداد وسائل الاعلام النمو: 15 ٪ الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1 ٪ المضادة للمضادات الحيوية الحل (ABAM) في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM/F12). تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.
  5. اعداد محلول تجميد الخلايا الشحمية المسبقة: 10 ٪ ثنائي ميثيل سولفوكيد ، 15 ٪ في وسائل الاعلام DMEM/F12. تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.
  6. اعداد وسائل الاعلام التمايز: 10 ملغ/لتر transferrin ، 33 μM البيوتين ، 0.5 μM محلول الانسولين البشري ، 17 μM D-الحمض الهيميكالسيوم ملح ، 100 nM ديكساميثازون ، 2 نانومتر 3 ، 3 ' ، 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم (T3) ، 1 μM ciglitizone ، 540 μM 3- ايزوبوتيل-1-ميثيلززانيني (IBMX) ، 1 ٪ ABAM في DMEM/F12. تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية.

2. اعداد كاشف ECM

  1. اعداد تجميد الحل العازلة: 10 ملم تريس قاعده ، 5 مم أدتا ، 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ من فلوريد فينيلميثيل السلفونيل (PMSF) في DI/H2O. يحرك الحل لحل أدتا. ضبط درجه الحموضة إلى 8.0 مع حمض الهيدروكلوريك أو NaOH. يخزن في 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  2. اعداد الحل الانزيمي #1:1 ٪ ABAM في 0.25 ٪ التريبسين-أدتا. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  3. اعداد محلول الشطف العازلة: 137 mM NaCl ، 2.68 mM KCl ، 7 ملليمتر Na2hpo4، 1.5 mm KH2PO4، 1 ٪ abam ، 1 ٪ pmsf في تعقيم دي/ح2س. يحرك لأذابه الأملاح. ضبط درجه الحموضة إلى 8.0 مع HCl أو NaOH. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.
  4. اعداد الحل الانزيمي #2:55 mM Na2hpo4، 17 مم KH2PO4، 4.9 mm mgso4∙ 7h2o ، 1 ٪ abam ، 1 ٪ Pmsf في دي/ح2س. مخزن 4 درجه مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر. يحرك الخليط لأذابه الأملاح. مباشره قبل الاستخدام ، أضافه 80 U/mL ليباس من البنكرياس الخنازير ، نوع السادس-S. 160 U/mL ديوكسيريبونوكليسي الأول من البنكرياس البقري ، النوع الثاني-S ؛ و 100 ميكروغرام/مليلتر من البنكرياس البقري ، من النوع الثالث-الف.
  5. اعداد حل استخراج المذيبات القطبية: 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ PMSF في الايزوبروبانول.
    تحذير: ايزوبروبانول قابل للاشتعال. يخزن في خزانه قابله للاشتعال عند درجه حرارة 25 مئوية ويتخلص من النفايات القابلة للاشتعال.
  6. اعداد 70 ٪ الايثانول ، 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ PMSF في DI/H2O. أضافه abam و pmsf قبل الاستخدام فقط.
    تحذير: الايثانول قابل للاشتعال. يخزن في خزانه قابله للاشتعال عند درجه حرارة 25 مئوية ويتخلص من النفايات القابلة للاشتعال.
  7. اعداد حل التخزين: 1 ٪ ABAM ، 1 ٪ PMSF في 1x تلفزيوني. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى 3 أشهر.

3. اعداد كاشف التنميط الأيضي

  1. امتصاص الجلوكوز
    1. اعداد المصل التجويع وسائل الاعلام: DMEM/F12 ، 1 ٪ ABAM. تصفيه تعقيم ، وتخزين في 4 درجه مئوية
    2. اعداد 200 nM محلول الانسولين البشري في 1x تلفزيوني علي الفور قبل الاستخدام.
    3. اعداد 200 nM الانسولين البشري ، 0.1 mM 2-ديكسي-د-الجلوكوز ، 1 μCi/بئر ديكسي-د-الجلوكوز ، 2-[1 ، 2-3H (N)]-، في 1X تلفزيوني. استعد فورا قبل الاستخدام.
  2. Lipolysis
    1. اعداد ايزوبروتيرينول المخفف في التخزين التلفزيوني: 3 مم الحل الأسهم. تمييع لتركيز العمل من 3 μM لفحص.
  3. النفط الأحمر-O تلطيخ
    1. اعداد فورالين 4 ٪ في DI/H2س. مخزن في درجه حرارة الغرفة.
    2. اعداد النفط الأحمر-O حل العمل. تمييع النفط الأحمر-O الحل (ORO) مع DI/H2o في نسبه 3:2 (ORO: Di/h2o). استعد فورا قبل الاستخدام. تصفيه من خلال ورقه فلتر (جدول المواد).

4. شراء الانسجه الدهنية

ملاحظه: يتم جمع الانسجه الدهنية الباطنية (VAT) من القدر الأكبر في بداية العملية من قبل الجراح ونقلها مره أخرى إلى المختبر علي الجليد للمعالجة الفورية. يجب استخدام الاحتياطات العالمية عند التعامل مع جميع الانسجه البشرية والمواد الكاشفة الكاوية ، بما في ذلك أداء جميع الاعمال في غطاء التيار الرقائقي ، وذلك باستخدام السلامة المختبرية الكاملة ، وعدم اللف من الابر.

  1. أضافه 5-10 غرام من ضريبة القيمة المضافة سليمه إلى 15-25 مل من محلول التجميد العازلة في أنبوب مخروطي 50 mL لتزج عينه الانسجه. تخزين العينات في-80 درجه مئوية حتى التقطير ، لمده تصل إلى 1 شهر.
  2. استخدم عينه جديده منفصلة من ضريبة القيمة المضافة لعزل الخلايا الشحمية المسبقة كما هو موضح في القسم 5.

5. العزل المسبق للخلية

  1. ضع 2 غرام من ضريبة القيمة المضافة سليمه في 20 مل من كولاجيناز ، النوع الثاني ، الحل في أنبوب مخروطي 50 mL. ثم اللحم المفروم جيدا عن طريق إدخال مقص معقمه في أنبوب مخروطي والفرم الانسجه داخل الأنبوب. مره واحده مفرومه تماما إلى الطين غرامه ، احتضان الانسجه في محلول كولاجيناز علي شاكر المداري في 130 لفه في الدقيقة و 37 درجه مئوية ل 60 دقيقه.
  2. تصفيه digestate الناتجة من خلال شبكه النايلون 100 μm إلى أنبوب مخروطي جديد 50 mL عن طريق سكب digestate من أنبوب مخروطي واحد من خلال قطعه من شبكه مطوية علي الجزء العلوي من أنبوب مخروطي جديد. وينبغي ان يكون digestate في هذه المرحلة السائل الأصفر والبرتقالي مع اللزوجة المعتدلة ، مع كميات صغيره من خيوط المتبقية من الانسجه الليفية غير مهضوم. وينبغي للشبكة التقاط قطع أكبر من الانسجه غير المهضومة ، والتي يتم التخلص منها.
  3. الطرد المركزي العينة في 270 x g لمده 10 دقيقه أزاله ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 2 مل من 1x الحل ليسينج مع ماصه.
    1. احتضان لمده 1 دقيقه عند 25 درجه مئوية ومن ثم أضافه 10 مل من 15 ٪ من المعرضين لل-DMEM/F12. الطرد المركزي في 270 x g لمده 10 دقيقه.
  4. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق بيليه الخلية في 10 مل من 15 ٪ منها--dmem/F12 مع ماصه. نقل تعليق الخلية إلى 100 مم طبق بيتري مع ماصه واحتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2، حتى تصل الخلايا 80-100 ٪ التقاء ، عاده 2-6 أيام. تغيير الوسائط كل 2-3 يوما.
  5. افصل الخلايا واغسلها.
    1. أزاله الوسائط مع ماصه وتطبيق 4 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا إلى الخلايا الملتصقة. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه ، ويحوم بشكل دوري لوحه بلطف لفصل الخلايا.
    2. أضافه 20 مل من 15 ٪-DMEM/F12 وأعاده تعليق الخلايا المنفصلة في هذه الوسائط مع ماصه. ثم نقل إلى جديد 50 mL أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي 270 x g لمده 10 دقيقه.
    3. أزاله ماده طافي وتجاهل. غسل بيليه الخلية مره واحده في 1x تلفزيوني ، ومن ثم أعاده التعليق بيليه الخلية في 20 مل من الطازجة 15 ٪-DMEM/F12 مع ماصه. نقل تعليق الخلية إلى قارورة ثقافة T-150.
  6. [كلتثر سل] في 37 [ك] و 5% [كو]2. تقسيم وتوسيع الخلايا كل 2-3 يوما لأنها تصل إلى 80-100 ٪ التقاء عن طريق تطبيق 7 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا ، وتوسيع من قارورة واحده إلى 8 قوارير.
    ملاحظه: هذا يتطلب عاده 3-4 الممرات ، والذي يسمح التوسع المناسب ويحتفظ المحتملة اديبوغينيك والمريض ومستودع محدده الظواهر الايضيه الخلوية. يؤدي تجاوز الخلايا الشحمية الزائدة عن 4-5 الممرات إلى فقدان الإمكانيات المحتملة.
  7. فصل الخلايا في 8 قوارير مع 7 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا للزجاجة الواحدة كما هو موضح أعلاه ، واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
  8. أضافه 8 مل من 15 ٪ لكل قارورة/F12 للزجاجة الواحدة وأعاده تعليق الخلايا المنفصلة مع ماصه. نقل التعليق الخلية بأكملها مقسمه بالتساوي في أنابيب المخروطية 3 50 mL والطرد المركزي في 270 x g لمده 10 دقيقه.
  9. أعاده التعليق علي الكريات الخلية الناتجة في 5 مل من 15 ٪ من-DMEM/F12 في أنبوب مخروطي 15 مل وعدد الخلايا باستخدام عداد الخلية والأزرق الترلون.
  10. الطرد المركزي تعليق الخلية في 270 x g لمده 10 دقيقه. ثم أعاده تعليق بيليه الخلية في محلول تجميد الخلايا المسبقة لتركيز الخلية النهائية من 1 × 106/مل ، و قسامه 1 مل من تعليق الخلية لكل 1.5 ml أنبوب كريوفيال.
  11. تخزين الخلايا في تخزن لمده 1 أيام في-80 درجه مئوية. ثم نقل تخزن إلى النيتروجين السائل للتخزين علي المدى الطويل لمده 3-6 أشهر.
  12. عندما تكون جاهزه للاستخدام ، ذوبان واحد كريوفيال في حمام مياه 37 درجه مئوية لمده 3-5 دقيقه. أعاده تعليق الخلايا في 20 مل من 15 ٪ من المستوي العام/F12 ، وأجهزه الطرد المركزي في 270 x g لمده 10 دقيقه.
  13. أعاده التعليق علي بيليه الخلية في 20 مل من 15 ٪-DMEM/F12 ، ماصه في قارورة 150 واحده ، ومن ثم تنمو إلى 80 ٪ التقاء أكثر من 2-3 يوما في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  14. فصل الخلايا مع 7 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا للزجاجة الواحدة كما هو موضح أعلاه في الخطوة 5.6. أعاده التعليق عند 3,000,000 خليه لكل مليلتر (اي ، 6 x 104 خلايا لكل 20 μl) في 15% من الخلايا-dmem/F12 ، واستخدامها كما هو موضح أدناه (القسم 7 ، الخطوة 7.4).

6. الانسجه الدهنية اعداد ECM

  1. اليوم الأول: تجميد الذوبان والهضم الانزيمي #1
    1. تجميد-ذوبان الجليد المجمدة سابقا (الخطوة 4.2) عينات ضريبة القيمة المضافة المخزنة في تجميد الحل العازل في أنابيب المخروطية 50 mL من-80 درجه مئوية إلى 37 درجه مئوية في حمام مياه مسخن ، احتضان 20 دقيقه مع التحريض اليدوي الدوري لطيف. مره واحده أذابه ، ونقل مره أخرى إلى-80 درجه مئوية واحتضان 20 دقيقه. كرر تجميد-ذوبان 3x ، تنتهي بالذوبان عينات في 37 درجه مئوية حمام المياه.
    2. باستخدام ملقط معقمه ، نقل عينات ضريبة القيمة المضافة إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 mL من الحل الانزيمي #1 ، وضمان ان العينات ضريبة القيمة المضافة مغمورة تماما. ثم احتضان بين عشيه وضحيها علي شاكر المداري (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية).
  2. اليوم الثاني: الهضم الانزيمي #2
    1. غسل عينات 3x مع 15-25 mL من محلول الشطف العازلة علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل). صب قباله الشطف حل العازلة بعد كل غسل.
    2. نقل العينات إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 مل من الحل الانزيمي #2 واحتضان علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، بين عشيه وضحيها).
  3. اليوم الثالث: الدلفين
    1. غسل عينات 3x مع 15-25 mL من محلول الشطف العازلة علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل). صب قباله الشطف حل العازلة بعد كل غسل.
    2. نقل العينات إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 مل من الحل استخراج المذيبات القطبية واحتضان علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 25 درجه مئوية ، بين عشيه وضحيها). بعد هذه الخطوة ، يجب أزاله غالبيه الدهون ، وينبغي ان تكون العينات بيضاء أو شفافة في اللون.
      تحذير: حل استخراج المذيبات القطبية قابل للاشتعال ويجب تخزينه واستخدامه عند 25 درجه مئوية.
  4. اليوم الرابع: الغسيل والتخزين
    1. نقل العينات إلى أنابيب مخروطيه 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 mL من محلول الشطف العازلة. غسل عينات 3x علي شاكر المداري (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
    2. غسل عينات 3x مع 15-25 مل من الايثانول 70 ٪ علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل) يصب قباله محلول الايثانول 70 ٪ بعد كل غسل.
    3. غسل عينات مره واحده مع حل التخزين علي شاكر المداري (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
    4. باستخدام ملقط معقمه ، نقل العينات إلى أنابيب المخروطية 50 mL الطازجة التي تحتوي علي 15-25 mL من الحل التخزين. تاكد من استخدام حل التخزين الكافي لغمر العينات بشكل كامل. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لمده تصل إلى شهر واحد.

7. اعداد الخلايا الشحمية

  1. نقل الشظايا المخزنة ECM إلى الآبار الفردية من 24 بئر لوحه باستخدام ملقط معقمه. أضافه العديد من أجزاء ECM في أكبر عدد من الآبار كما هو مطلوب لفحص المصب المخطط له (علي سبيل المثال ، امتصاص الجلوكوز أو تحلل الدهون ، انظر أدناه) ، بما في ذلك التكرارات أو الثلاثية. يغسل مع 500 μL من 70 ٪ الايثانول 3x علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
  2. أعاده ترطيب ECM عن طريق غسل 3x في العقيمة 1x تلفزيوني علي شاكر المدارية (130 دوره في الدقيقة ، 37 درجه مئوية ، 20 دقيقه كل غسل).
  3. باستخدام مقص العقيمة ، وخفض وتزن ECM إلى 100 ملغ شظايا. باستخدام ملقط معقمه ، مكان 1 100 ملغ جزء في كل بئر من لوحه 24 بئر. احتضان في 25 درجه مئوية لمده 15 دقيقه للسماح الزائدة التلفزيونية للبثق من شظايا. بعناية أزاله اي الزائدة التلفزيونية مع ماصه.
  4. بذور كل 100 ملغ ECM جزء مع 20 μL من تعليق خليه الخلايا الشحمية (3,000,000 الخلايا لكل مل ، 6 × 104 خلايا لكل 20 μl ، في 15 ٪ من الدرجة الاولي/F12 ، من الخطوة 5.10). ماصه الخلايا مباشره في ECM عن طريق وضع غيض من ماصه في ECM وطرد بلطف تعليق الخلية في وسط المصفوفة ، مع الحرص علي ان تعليق الخلية لا تجاوز وينتهي في الجزء السفلي من البئر.
    1. إذا كان تعليق الخلية تفيض من نظام ECM حيث تم وضع طرف الماصة ، قم بازاله الطرف من ذلك الموقع وادراجه في مكان آخر في ECM. احتضان المصنفة ECM ل 40 دقيقه في 37 درجه مئوية.
      ملاحظه: لاستخراج RNA ل qrtPCR ، البذور كل 500 ملغ ECM الشظايا مع 3 × 105 خلايا في 100 μl (3,000,000 خلايا لكل مل ، اي ، 3 × 105 خلايا في 100 μl ، في 15 ٪ ار-dmem/F12).
  5. أملا كل بئر من اللوحة 24 بئر مع 500 μL من وسائط النمو لتغطيه شظايا ECM المصنفة. الثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 72 h.
  6. وبعد 72 ساعة ، يستنشق بعناية 15% من الأجزاء/F12 ، أماله الصفيحة قليلا للسماح للوسائط بالتجمع تحت الجزء الأسفل ، ووضع طرف الماصة بجوار جزء ECM بدون إزعاج. بعد الشفط ، أضافه 500 μL من وسائل الاعلام التمايز ، وتغيير وسائل الاعلام كل 2-3 يوما باستخدام تقنيه مماثله ، لفتره الثقافة الاجماليه من 14 يوما.
    1. التحقق من التمايز باستخدام المجهر الضوئي: سوف تتراكم الخلايا الدهون ، وتتحول البني والأصفر في اللون وأكثر كرويه في الشكل.
      ملاحظه: يمكن استخدام المصفوفات المصنفة لاختبار الأيض (علي سبيل المثال ، فحص امتصاص الجلوكوز ، تحليل تحلل الدهون ، ORO) ، علم الانسجه أو مناعي (IHC) ، أو التصوير النسيجي القياسي. لتلطيخ الانسجه الثابتة ORO والتصوير ، تجميد عينات ECM-الخلايا الشحمية في النيتروجين السائل.

8. التنميط الأيضي

  1. فحص المجهر الكتروني
    1. إصلاح العينات في 2.5 ٪ غلوتارالديهيد في المخزن المؤقت الفوسفات سورنسن في 25 درجه مئوية ل 12 h. postfix في 1 ٪ الاوزميوم أكسيد في المخزن المؤقت الفوسفات سورنسن في 4 درجه مئوية ل 1 ساعة.
    2. عينات من الهيدرات المتسلسلة في الايثانول. يغسل في الهواء الجاف. ثم جبل علي المجهر الكترون المسح الضوئي كعب مع الجرافيت الغرويه. الجافة ، ومعطف مع الذهب.
    3. التقاط الصور مع مجهر الكترون المسح الضوئي.
  2. النفط الأحمر-O تلطيخ
    1. الانسجه الحية: النفط الأحمر-O الحل
      1. شفط الوسائط بعناية من الآبار مع ماصه. ثم غسل عينات مره واحده مع 500 μL من 1x تلفزيوني لكل بئر.
      2. إصلاح العينات مع 200 μl من 4 ٪ فورالين في المعقمة منزوعة الأيونات H2في 25 درجه مئوية لمده 15 دقيقه ، الفورمالين مع ماصه ، وغسل عينات مرتين مع 1x تلفزيوني (500 μl كل غسل).
      3. أضافه 200 μL من 60 ٪ الايزوبروبانول عينات في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق. الشفط 60 ٪ ايزوبروبانول مع ماصه.
      4. عينات وصمه عار مع النفط الأحمر-O حل العمل في 25 درجه مئوية لمده 5 دقائق. شفط النفط الأحمر-O مع ماصه ثم غسل عينات 3x مع 1x تلفزيوني (500 μL كل غسل). ثم صوره مع المجهر البصري.
    2. الانسجه الثابتة: النفط الأحمر-O وصمه عار كيت
      1. فلاش تجميد عينات ECM-الخلايا الشحمية في درجه حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) المجمع والقسم (5 μm) علي التبريد.
      2. ضع الشريحة في 85 ٪ البروبيلين غليكول في DI/H2o لمده 2 دقيقه وضع الشريحة في ORO وصمه عار في 60 درجه مئوية لمده 6 دقائق. مكان steh أيد في 85 ٪ البروبيلين غليكول في Di/h2o لمده 1 دقيقه شطف الشريحة مرتين مع di/h2o.
      3. ضع الشريحة في المعدلة ماير الدموية من النفط الأحمر-O تلطيخ عده لمده 1 دقيقه. شطف الشريحة مرتين باستخدام ماء الصنبور. شطف الشريحة مرتين مع DI/H2O.
      4. جبل كوفيرسليب باستخدام المتوسطة تركيب مائي وصوره علي المجهر.
    3. استخراج RNA من ECM لل qrtPCR
      ملاحظه: لتعظيم العائد RNA ، استخدم 500 ملغ ECM شظايا المصنفة مع 3 × 105 الخلايا الشحمية في 100 μl والتفريق علي النحو الوارد أعلاه في لوحات 6-حسنا في 3 مل من وسائل الاعلام التمايز في بئر.
      1. مره واحده المتمايزة, نقل كل الفردية ECM-الخلايا الشحمية عينه في أنبوب مخروطي 50 mL علي الجليد باستخدام ملقط معقمه.
      2. يغسل بشكل جيد مع 500 μL من RLT العازلة. أضافه RLT العازلة إلى 50 mL أنبوب مخروطي مع مطابقه ECM-الخلايا الشحمية عينه.
      3. باستخدام مقص معقم ، المفروم ناعما كل نموذج ECM-الخلايا الشحمية داخل أنبوب مخروطي 50 mL ، في حين عقد أنبوب علي الجليد ، وادراج مقص في أنبوب مخروطي لفرم الانسجه.
      4. تجميد تماما وذوبان الأنابيب المخروطية من-80 درجه مئوية إلى 37 درجه مئوية 3x.
      5. أنابيب مخروطيه الطرد المركزي في 500 x g و 4 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
      6. بعناية أزاله ماده طافي مع ماصه واستخدامها لاستخراج الجيش النيبالي الريبي مع النسيج الليفي rna استخراج كيت (جدول المواد).
  3. فحص امتصاص الجلوكوز
    1. التفريق بين 6 × 104 الخلايا الشحمية المسبقة في 100 ملغ من أجزاء ECM في 0.5 مل من متوسط التمايز في لوحات 24-حسنا علي النحو المبين أعلاه (القسم 5).
    2. بعد 14 يوما من التمايز ، وأزاله المتوسطة وغسل ECM-الخلايا الشحمية مره واحده مع 1x تلفزيوني. أضافه 0.5 mL/well مصل المجاعة المتوسطة والثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 12 ساعة.
    3. أزاله المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 1x تلفزيوني. أضافه 0.5 mL/بئر 2 ٪ جيش الصرب البوسنيين في الاذاعه التلفزيونية والثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 2 ساعة.
    4. اغسل الخلايا مره واحده مع 1x تلفزيوني ، أضافه 0.5 mL/well 1x تلفزيوني مع أو بدون 200 nM الانسولين ، واحتضان في 37 درجه مئوية ل 40 دقيقه.
    5. يستنشق 1x تلفزيوني ، أضافه 0.5 mL/well 1X تلفزيوني مع 0.1 mM 2-ديكسي-د-الجلوكوز ، 2 μCi/mL ديكسي-د-الجلوكوز ، 2-[1 ، 2-3H (N)] ، مع أو بدون الانسولين 200 nM ، واحتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 40 min استخدام الاحتياطات القياسية الكواشف والنفايات المشعة ، وفقا للتكليف الصادر عن القوانين التنظيمية المؤسسية المحلية.
    6. أزاله المتوسطة مع ماصه وغسل الخلايا 3x مع 1x تلفزيوني. أضافه 420 μL من محلول SDS 1 ٪ في DI/H2O ، وخلايا lyse مع الأنابيب القوية. احتضان 25 درجه مئوية لمده 10 دقائق.
    7. جمع 5 μL من كل بئر لفحص البروتين برادفورد. نقل 400 μl من الخلايا المتبقية محلله إلى 2 مل من السائل التلالؤ في قارورة التلالؤ. العد 3H-2dg النشاط علي العداد تلالؤ. تحليل البيانات كما تحسب في الدقيقة تطبيع للبروتين ، مغ/مل.
  4. فحص تحلل الدهون
    1. التفريق بين 6 × 104 الخلايا الشحمية المسبقة في 100 ملغ من أجزاء ECM في 0.5 mL من التمايز البشري المتوسطة في لوحات 24-حسنا كما هو موضح أعلاه (القسم 5).
    2. بعد 14 يوما من التمايز ، وأزاله المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 1x الدافئة تلفزيوني. أضافه 0.5 mL من المصل تجويع المتوسطة (بدون الانسولين) مع أو بدون ايزوبروتيرينول μM 3 ، والخلايا الشحمية الثقافة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 72 h.
    3. جمع supernatants الثقافة ، والتي يمكن تخزينها في-80 درجه مئوية حتى تكون جاهزه لفحص. جمع ECM في أنابيب الطرد المركزي للحصول علي كميات الحمض النووي لتطبيع البيانات.
    4. Pipet 2 μl من كل ماده طافي في ميكروبلايت 96 جيدا. الآبار الاحتياطية لفراغات (المقطر H2س) والحل القياسي الجلسرين المقدمة في مجموعه الدهون الثلاثية التحديد.
    5. أضافه 270 μL من كاشف الجلسرين الحرة من مجموعه الدهون الثلاثية تحديد لكل بئر ، ماصه لخلط. احتضان لوحه في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
    6. قياس الامتصاص في 540 نانومتر علي مقياس طيفي ميكروبلايت.
    7. حساب تركيز الجلسرين وتطبيع مع الحمض النووي من ECM:

figure-protocol-1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اعداد الانسجه الدهنية ECM ، البذر مع الخلايا الشحمية ، والتمايز في المختبر في الخلايا الشحمية ناضجه تؤدي إلى تغييرات واضحة متسلسلة في الانسجه التي تسمح التقييم البصري للتقدم في جميع انحاء البروتوكول (الشكل 1) . يتم عزل الخلايا السابقة التي تستخدم لبذر ECM باستخدام الهضم كولاجيناز من عينات ضريبة القيمة المضافة منفصلة (الشكل 2). المسح المجهري الكترون من يبني ECM-الخلايا الشحمية في كل مرحله من مراحل المعالجة يكشف عن التقطير من ECM و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر نموذج ثقافة ECM-أديب أداه قيمه لتشريح الأدوار الفردية لECM والخلايا في إملاء النمط الظاهري الانسجه النهائية. وبروتوكول العزل الخاص بالنظام قابل للاستنساخ تماما ، ولكن يمكن ملاحظه التباين في عمليه التقطير. تعد خطوه اليوم الثالث الخاصة بالفصل نقطه حرجه في البروتوكول. عند الانتهاء من الاستخراج بين عشيه وضحيها ، يجب ان يكون الدليل علي المصفوفة من الحل المذيبات القطبية تحول الصفراء ، في حين ان المصفوفة ينبغي الانتقال من اللون الأصفر والبرتقالي سمه من الانسجه الدهنية سليمه إلى شفافة/ ابيض (الشكل 1

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن تضارب المصالح.

شكر وتقدير

نشكر دانييل بيرغر ، مارلين وودروف ، سيمون كوريا ، و Retha Geiss للحصول علي المساعدة في تنسيق الدراسة. وقد تم تنفيذ SEM من قبل جامعه ميشيغان المجهر & تحليل الصور مختبر الطب الحيوي البحوث الاساسيه مرفق. تم دعم هذا المشروع من قبل المعاهد القومية للصحة المنح R01DK097449 (RWO) ، R01DK115190 (RWO ، CNL) ، R01DK090262 (CNL) ، وشؤون قدامي المحاربين منحه الجدارة I01CX001811 (RWO) ، الطيار ومنحه الجدوى من مركز ميشيغان لأبحاث السكري (منحه المعاهد القومية للصحة P30-DK020572) (RWO) ، أداره المحاربين القدماء VISN 10 سبارك التجريبية منحه (RWO). فحص المجهر الكتروني الذي تقوم به جامعه ميشيغان المجهر & تحليل الصور مختبر البحوث الطبية الحيوية مرفق الاساسيه. وقد نشر الشكل 4 من هذه المخطوطة في الأصل في بيكر وآخرون ، J Clin اندو Metab 2017 ؛ مارس 1 ؛ 102 (3) ، 1032-1043. doi: 10.1210/jc. 2016-2915 ، وقد استنسخ باذن من مطبعة جامعه أكسفورد [https://academic.oup.com/jcem/article/102/3/1032/2836329]. للحصول علي اذن لأعاده استخدام هذه المواد ، يرجى زيارة http://global.oup.com/academic/rights.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.25٪ التربسين-EDTAجيبكو ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 25200056
1.5 مل أنبوب التبريدFisher Scientific ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA USACat # 02-682-557
10٪ محايد Buffered FormalinVWR International LLC. ، Radnor ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 89370-094
100 & micro ؛ م مرشح شبكة النايلونCorning Inc. ، Corning ، NY ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 352360
2-Deoxy-D-glucoseSigma-Aldrich، Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # D8375
2 نانومتر 3،3 '، 5-Triiodo-L-ملح الصوديوم (T3)Sigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # T6397
24 ألواح زراعة الأنسجة VWRInternational LLC. ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةالقط # 10861-700
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)Sigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # I5879
96-well Tissue Culture PlatesVWR International LLC. ، Radnor ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 10861-666
محلول مضاد للحيوية ومضادات الفطريات (ABAM)Gibco ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 15240062
BiotinSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # B4639
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-Aldrich، Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # A8806
Buffer RLTQiagen ، هيلدن ، ألمانياCat # 79216
CiglitizoneSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # C3974
Deoxy-D-glucose ، 2- [1،2-3H (N)] -PerkinElmer Inc. ، Waltham ، MA ، USACat # NET328A250UC
ديوكسيريبونوكلياز I من البنكرياس البقري ، النوع II-SSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # D4513
ديكساميثازونسيجما ألدريتش ، إنك سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةالقط # D4902
ثنائي ميثيل سلفوكسيدفيشر العلمي ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA الولايات المتحدة الأمريكيةCat # BP231قابل للاشتعال ، كاوية
ثنائي الصوديوم EDTAفيشر Scientific ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA الولايات المتحدة الأمريكيةCat # BP118
D-pantothenic acid hemicalciumملح Sigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 21210
Dulbecco ' s وسيط النسر المعدل: خليط المغذيات F-12 (DMEM / F12Gibco ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA USACat # 11320033
EthanolDecon Labs، Inc. ، ملك بروسيا ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # DSP-MD.43القابلة للاشتعال
، NanoEnTekVWR International LLC. ، Radnor ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 10027-446
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Gibco ، ThermoFisher Scientific Inc. ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةالقط # 10437028
GlutaraldehydeSigma-Aldrich، Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # G5882الكاوية
HexamethyldisalizaneSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 440191القابل للاشتعال
، الكاوية Sigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # I9278
Isopropanolفيشر ساينتفيك ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA الولايات المتحدة الأمريكيةCat # A415قابل للاشتعال
IsoproterenolSigma-Aldrich، Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # I5627قابل للاشتعال
KClSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # S25484
KH2< / sub>PO4< / sub>Sigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةالقط # P5655
الليباز من البنكرياس الخنازير ، النوع VI-SSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # L0382
MgSO4< / sub> * 7H 2< / sub>OSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 230391
Na 2< / sub>HPO4< / sub>Sigma-Aldrich ، شركة سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # S5136
NaClSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # S3014
NaHCO3< / sub>Fisher Scientific ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA USACat # S233
NH4< / sub>ClFisher Scientific ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA USACat # A661
القطع الأمثل مركب درجة الحرارة (OCT)Agar Scientific، Ltd. ، Stansted ، Essex ، المملكة المتحدةCat # AGR1180
Oil Red-O Solution (ORO)Sigma-Aldrich، Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # O1391
Oil Red-O StainAmerican Master Tech Scientific Inc. ، Lodi ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # KTORO-G
رابع أكسيد الأوزميومSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 201030كاوية
فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF)سيجما ألدريتش ، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 93482
ملحي مخزن بالفوسفات الكاوية (PBS) فيشرScientific ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA الولايات المتحدة الأمريكيةCat # SH3025601
Ribonuclease A من البنكرياس البقري ، النوع III-ASigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # R5125
RNAEasy الأنسجة الليفية MiniKitQiagen ، هيلدن ، ألمانياالقط # 74704
سائل التلألؤفيشر العلمي ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA الولايات المتحدة الأمريكيةCat # SX18
مقص مضاد
، ملقط ،
Thomas Scientific، Inc. ، Swedesboro ، NJCAS #: 10049-21-5
قارورة ثقافة T-150VWR International LLC. ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 10062-864
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 4369016
الخالط
حرارته ، الخالط MicrotubeBoot المعياري العلميCat # D1030
TransferrinSigma-Aldrich، Inc. سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # T3309
مجموعة تحديد الدهون الثلاثيةSigma-Aldrich، Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # TR0100
Trypan Blue stain ، 0.4٪VWR International LLC. ، Radnor ، PA ، USACat # 10027-446
النوع الثاني كولاجينازجيبكو ، ThermoFisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # 17101015
ورق ترشيح Whatman Reeve Angel ، الصف 201 ، 150 ممSigma-Aldrich، Inc. ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةCat # WHA5201150
شرائح عد خلايا EVE محلول الأنسولين البشري Kit محلول التلألؤ عازلة فوسفات سورنسن المعقمة المداري الذي يتم التحكم في درجة

المراجع

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123, 4195-4200 (2010).
  2. Berrier, A. L., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesion. Journal of Cell Physiology. 213 (3), 565-573 (2007).
  3. Trayhurn, P. Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity. Physiology Reviews. 93 (1), 1-21 (2014).
  4. O'Rourke, R. W., Lumeng, C. N. Obesity heats up adipose tissue lymphocytes. Gastroenterology. 145 (2), 282-285 (2013).
  5. Engin, A. The Pathogenesis of Obesity-Associated Adipose Tissue Inflammation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 960. 960, 221-245 (2017).
  6. Dankel, S. N., et al. COL6A3 expression in adipocytes associates with insulin resistance and depends on PPARγ and adipocyte size. Obesity (Silver Spring). 22 (8), 1807-1813 (2014).
  7. Divoux, A., et al. Fibrosis in human adipose tissue: composition, distribution, and link with lipid metabolism and fat mass loss. Diabetes. 59, 2817-2825 (2010).
  8. Lackey, D. E., et al. Contributions of adipose tissue architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 306 (3), E233-E246 (2014).
  9. Muir, L. A., et al. Adipose tissue fibrosis, hypertrophy, and hyperplasia: correlations with diabetes in human obesity. Obesity (Silver Spring). 24 (3), 597-605 (2016).
  10. Spencer, M., et al. Adipose tissue macrophages in insulin-resistant subjects are associated with collagen VI and fibrosis and demonstrate alternative activation. American Journal of Physiology, Endocrinology, and Metabolism. 299 (6), E1016-E1027 (2010).
  11. Baker, N. A., et al. Diabetes-specific regulation of adipocyte metabolism by the adipose tissue extracellular matrix. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (3), 1-12 (2017).
  12. Pellegrinelli, V., et al. Human adipocyte function is impacted by mechanical cues. Journal of Patholology. 233 (2), 183-195 (2014).
  13. Flynn, L. E. The use of decellularized adipose tissue to provide an inductive microenvironment for the adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biomaterials. 31 (17), 4715-4724 (2010).
  14. Perea-Gil, I., et al. In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization. American Journal Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).
  15. Porzionato, A., et al. Decellularized omentum as novel biologic scaffold for reconstructive surgery and regenerative medicine. European Journal of Histochemistry. 57 (1), e4(2013).
  16. Tebyanian, H., et al. A Comparative Study of Rat Lung Decellularization by Chemical Detergents for Lung Tissue Engineering. Open Access Macedonian Journal of Medical Sciences. 5 (7), 859-865 (2017).
  17. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  18. Wang, L., Johnson, J. A., Zhang, Q., Beahm, E. K. Combining decellularized human adipose tissue extracellular matrix and adipose-derived stem cells for adipose tissue engineering. Acta Biomaterials. 9 (11), 8921-8931 (2013).
  19. Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
  20. Parker, M. W., et al. Fibrotic extracellular matrix activates a profibrotic positive feedback loop. Journal of Clinical Investigation. 124 (4), 1622-1635 (2014).
  21. Baker, N. A., Muir, L. A., Lumeng, C. N., O'Rourke, R. W. Differentiation and Metabolic Interrogation of Human Adipocytes. Methods in Molecular Biology. 1566, 61-76 (2017).
  22. O'Rourke, R. W., et al. Hexosamine biosynthesis is a possible mechanism underlying hypoxia's effects on lipid metabolism in human adipocytes. PLoS One. 8 (8), e71165(2013).
  23. Tchkonia, T., et al. Fat depot-specific characteristics are retained in strains derived from single human preadipocytes. Diabetes. 55 (9), 2571-2578 (2006).
  24. Tchoukalova, Y. D., et al. Sex- and depot-dependent differences in adipogenesis in normal-weight humans. Obesity (Silver Spring). 18 (10), 1875-1880 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Oil Red O
A الإنسان 3D مصفوفة-الخلايا الشحمية نموذج ثقافة لدراسة مصفوفة خليه الأيض الأيضي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.