مقالة منهجية

الليزر التقاط ميكروتشريح الغضروف الجنيني الماوس والعظام لتحليل التعبير الجيني

DOI:

10.3791/60503

⸱

ديسمبر 18, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Icahn Institute for Data Science and Genomic Technology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول التشريح المجهري للتقاط الليزر لعزل الغضروف والعظم من الأجزاء المجمدة الطازجة من جنين الفاره. الغضروف والعظم يمكن تصورها بسرعة بواسطة تلطيخ البنفسج كريريل وجمعت علي وجه التحديد لإنتاج الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا المحددة أو المناطق ذات الاهتمام من الانسجه غير المتجانسة. التعقيد الخلوي والجزيئي للعناصر الهيكل العظمي يزيد مع التنمية. تغاير الانسجه ، مثل في واجهه العناصر الغضروفية والعظمية مع بعضها البعض أو مع الانسجه المحيطة بها ، هو عقبه واحده لدراسة تطوير الغضروف والعظام. بروتوكولنا يوفر طريقه سريعة لمعالجه الانسجه وعزل الغضروف والعظام التي تعطي الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة لتحليل التعبير الجيني. يتم تقسيم الانسجه المجمدة الطازجة من الاجنه الماوس ويتم استخدام قصيرة البنفسجية التلون الأرجواني لتصور الغضروف والعظم مع ألوان المتميزة من الانسجه المحيطة بها. ثم يتم تجفيف الشرائح بسرعة ، ويتم عزل الغضروف والعظم في وقت لاحق من قبل LCM. التقليل من التعرض للحلول المائية اثناء هذه العملية يحافظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي. تم جمع بنجاح الغضروف الماوس Meckel وعظم فك في E 16.5 وتحليل التعبير الجيني أظهرت التعبير التفاضلي من الجينات علامة لعظم ، والخلايا العظمية ، والعظم ، والغضروفي. كما تم عزل الحمض الريبي عالي الجودة من مجموعه من الانسجه والاعمار الجنينية. هذا البروتوكول تفاصيل اعداد العينة ل LCM بما في ذلك كريومبيدينج ، التقطيع ، تلطيخ وتجفيف الانسجه المجمدة الطازجة ، وعزل دقيق من الغضروف والعظم من قبل LCM مما ادي إلى الحمض الريبي النيبالي عاليه الجودة للتحليل الناسخ.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجهاز العضلي الهيكلي هو نظام متعدد المكونات يتكون من العضلات, النسيج الضام, وتر, الرباط, الغضروف, والعظام, العصبية من الأعصاب والاوعيه الدموية بواسطة أوعيه دموية1. تتطور انسجه الهيكل العظمي مع زيادة التغاير الخلوي والتعقيد الهيكلي. الغضروف والعظام تتطور من نفس النسب أوستيوتشوندروبروجينيتور وذات الصلة للغاية. الغضروف الجنيني والعظام تتطور بالتعاون مع العضلات والأعصاب والاوعيه الدموية ، وغير متمايزة مسسبي. ويمكن أيضا ان يكون الغضروف محاطا بالعظم ، مثل غضروف ميكيل والغضروف المخروطي داخل عظم الفك. هذه الانسجه هي المرتبطة تشريحيا وتتفاعل مع بعضها البعض من خلال إشارات خارج الخلية اثناء التنمية. في دراسة التعبير الجيني في تطوير الغضروف والعظام ، عقبه واحده هي تغاير الهياكل الهيكلية التي تتالف من أنواع متعددة من الانسجه. العزل الدقيق للانسجه المحددة ذات الاهتمام هو المفتاح للتحليل الناجح للتحويل.

التشريح المجهري للتقاط الليزر (LCM) هو أداه قويه لعزل أنواع الخلايا أو مناطق الاهتمام داخل الانسجه غير المتجانسة ، وهي قابله للتكرار وحساسة لمستوي الخلية الواحدة2. يمكن ان تستهدف بدقه والتقاط الخلايا من الفائدة لمجموعه واسعه من الاختبارات المصب في النسخ ، والجينوم ، وبروبروتيميكس3،4. ويمكن تقييم نوعيه الحمض النووي الريبي المعزول أو الدنا أو البروتين باستخدام محلل حيوي أو منصة مكافئه. مثلا, [رنا] أشرت نوعيه ب ال [رنا] نزاهة رقم ([رين])5.

هنا ، ونحن نقدم بروتوكول لتلطيخ السريع والعزلة من الغضروف والعظام من قبل LCM من الانسجه المجمدة الطازجة. نحن نستخدم الجنين الفار لإثبات ان هذا البروتوكول غله عاليه الجودة الجيش النيبالي الممتاز للتحليل اللاحقة الناسخ ، مثل التسلسل RNA (RNA-seq).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتم الحصول علي الانسجه من الفئران وفقا لدليل المعاهد الصحية الوطنية لرعاية واستخدام المختبرات الحيوانية ، وتمت الموافقة علي بروتوكولات الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية للعناية بالماشية والاستخدام في كليه الطب في إياهن في جبل سيناء.

1. اعداد العينات المجمدة الطازجة

  1. تشريح الجنين أو الانسجه ذات الفائدة. تضمين العينة في قالب تضمين المتاح مع الأمثل درجه حرارة القطع (أكتوبر) مجمع. ضبط اتجاه العينة مع تلميح أو ابره.
  2. تجميد العينات بسرعة في الجليد الجاف/ميثيل-2-البوتان حمام. المتابعة إلى الخطوة التالية أو تخزين في-80 درجه مئوية.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. التجميد للتقاط الليزر المجهرية تشريح

  1. تذويب البرد وتنظيف الأسطح الداخلية مع 70 ٪ الايثانول. علاج المضادة--لفه لوحه وزوج من ملقط مع عامل أزاله التلوث RNase. تعيين التبريد إلى درجه حرارة القطع المطلوبة (-18 إلى-22 درجه مئوية). اعداد حاويه بغطاء مع الثلج الجاف ، ووضع ورقه من رقائق ألومنيوم علي الجليد الجاف للتخزين المؤقت للشرائح عينه مقسمه اثناء التجميد.
    تحذير: الثلج الجاف بارد جدا. دائما التعامل مع الثلج الجاف مع الرعاية وارتداء قفازات معزولة كلما التعامل معها.
  2. نقل العينة المجمدة الطازجة إلى دلو من الثلج الجاف. وضع طبقه من أكتوبر مركب علي حامل العينة الباكية ووضع العينة علي الفور علي راس OCT مع ضغط لطيف. عندما يتم تجميد OCT تماما ، ربط حامل مع العينة في قطع الذراع الباكية.
  3. ترك العينة في البرد لمده 15 دقيقه لتتوازن إلى درجه حرارة القطع.
  4. قسم الانسجه وجمع الشرائح علي الشرائح غشاء البولي إيثيلين (PEN) الاغشيه بسماكة 12 μm. محاذاة المقاطع المتتالية علي الغشاء. مره واحده يتم الانتهاء من الشريحة ، والسماح للأقسام لتجف لبضع دقائق ونقل الشريحة إلى إحباط في حاويه الثلج الجاف حتى يتم جمع جميع الشرائح المطلوبة.
  5. تخزين الشرائح في-80 درجه مئوية في مربع شريحة.
    ملاحظه: يتم اختيار سماكه القسم لتعظيم كميه الانسجه التي تم جمعها مع السماح بالقطع الفعال للانسجه ، وقد تختلف تبعا للانسجه ذات الاهميه. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. الحفاظ علي الشرائح خاليه من التلوث RNase. تجنب التغيرات في درجات الحرارة. علي الرغم من ان الجيش النيبالي الريبي من الشرائح المخزنة لمده تصل إلى 6 أشهر قد لا تزال تشير إلى جوده عاليه من RNA ، ونحن نوصي باستخدام الشرائح في أقرب وقت ممكن.

3. اعداد عينه للتقاط الليزر المجهرية تشريح

  1. اعداد حلول لتلطيخ والجفاف.
    1. مكان 45 mL من الايثانول 80 ٪ في كل من أنابيب الطرد المركزي 3 50 mL علي الجليد. قم بتسميتها علي انها #1 و#2 و#3. تمييع الايثانول مع المياه الحرة RNase/DNase.
    2. مكان 45 mL من 95 ٪ الايثانول في أنبوب الطرد المركزي 50 mL علي الجليد.
    3. مكان 45 mL من 100 ٪ الايثانول في أنبوب الطرد المركزي 50 mL علي الجليد.
    4. مكان 45 mL من اكسيلين في أنبوب الطرد المركزي 50 mL في درجه حرارة الغرفة.
      تحذير: يجب استخدام اكسيلين في غطاء الدخان.
  2. ذوبان الشريحة غشاء القلم لفتره وجيزة عن طريق وضعه ضد اليد قفاز ، ثم يغسل مرتين ل 30 ثانيه في كل 45 ml من 80 ٪ الايثانول (#1 وال#2) مع التحريض في أنابيب الطرد المركزي 50 ml لأزاله OCT.
    ملاحظه: من المهم أزاله OCT قبل تلطيخ ، لمنع OCT خففت اثناء تلطيخ من حجب الأقسام. يمكن استخدام الملقط لتسهيل أزاله OCT التي لا تغسل بواسطة الانفعالات.
  3. وضع الشريحة علي ورقه من رقائق ألومنيوم. ماصه 0.8 ml من 0.1 ٪ البنفسج كريريل في 50 ٪ الايثانول علي الشريحة ووصمه عار ل 30 ق. اغسل الشريحة في 45 مل من 80 ٪ الايثانول (#3) لمده 30 ثانيه ، ثم ديهيدرات عن طريق المرور لمده 30 ثانيه كل من خلال 45 ml من 95 ٪ الايثانول ، 100 ٪ الايثانول ، و الزيلين في أنابيب الطرد المركزي 50 ml.
  4. الوقوف الشرائح علي ممسحة مهمة حساسة لمده 5 دقائق لاستنزاف اكسيلين والأقسام الجافة.
    ملاحظه: يجب تجفيف الشرائح تماما قبل LCM.

4. التصوير بالليزر التشريح المجهري

ملاحظه: ارتداء قفازات النتريل مجانا مسحوق اثناء أداء lcm.

  1. قم بتشغيل المجهر LCM والليزر والكمبيوتر. قم بتسجيل الدخول إلى الكمبيوتر وبدء تشغيل البرنامج. قم بتحويل المفتاح إلى الموضع "تشغيل" لبدء تشغيل الليزر. عندما يكون الضوء الأخضر (ليزر) علي ، اضغط علي الزر الأحمر لتنشيط الليزر ، ومن ثم ضوء (ليزر) يتحول الأحمر يشير ليزر علي استعداد للاستخدام.
    ملاحظه: يحتاج الليزر حوالي 10 دقيقه للتدفئة.
  2. قم باعداد أنابيب التجميع.
    1. ادراج الحد الأقصى لل 0.5 mL البلمره سلسله تفاعل (PCR) أنبوب في جامع.
      ملاحظه: اختيار جامع مطابقه للأنابيب PCR المطلوب (0.2 أو 0.5 mL).
    2. ماصه 50 μL من المخزن المؤقت استخراج (التي تقدمها مجموعه العزل RNA المدرجة في جدول المواد) في الغطاء من أنبوب جمع 0.5 mL.
    3. ادخل جهاز التجميع في المجهر.
    4. في الإطار " تغيير جهاز جامع " ، انقر فوق الزر الانتقال إلى النقطة المرجعية لنقل المجمع إلى النقطة المرجعية (RP). اضبط التركيز لعرض RP بوضوح. انقر فوق الأسهم لنقل RP إلى مركز طريقه العرض.
  3. تحميل الشرائح عينه.
    1. انقر فوق الزر إلغاء التحميل الأيسر في شريط الاداات لخفض حامل الشريحة.
    2. ضع الشريحة في الحامل ، مع مواجهه القسم النسيجي للأسفل.
      ملاحظه: هذا التوجه يضمن ان المقاطع الانسجه الملتقطة تقع في الغطاء من أنبوب جمع حسب الجاذبية.
    3. ادخل الحامل مره أخرى إلى المرحلة.
  4. قم باعداد معلمات الليزر.
    1. حدد خيار التحكم من القائمة ليزر أو انقر علي أيقونه ليزر .
    2. ضبط هذه المعلمات علي النحو المطلوب: السلطة، وقوه الليزر. فتحه, العرض من الليزر; والسرعة، وسرعه القطع في رسم ووضع قص .
      ملاحظه: اختبر الليزر في منطقه بعيدا عن الاهتمام. الطاقة العالية أو الفتحة الأكبر تجعل من السهل قطعها ولكنها تسبب المزيد من الضرر للخلايا. ضبط مزيج من السلطة ، والفتحة ، والسرعة للحصول علي قطع فعاله والحد الأدنى من الضرر من الانسجه. علي سبيل المثال ، الطاقة = 40 ، الفتحة = 5 ، والسرعة = 7 للانسجه الغضروف علي قسم 12 μm.
  5. حدد وقطع مجالات الاهتمام.
    1. تبدا مع 5x الهدف والعثور علي مجالات الاهتمام ، ومن ثم التحول إلى الهدف (5x ، 10x ، أو 40x) التي تظهر أفضل منطقه الاهتمام.
      ملاحظه: بعد تلطيخ البنفسج الهلالي ، والغضاريف الملونة الأرجواني والانسجه المعدنية تظهر البني أو الأسود ، يمكن تمييزها من الانسجه الأخرى. يمكن حفظ الصور باستخدام حفظ الصورة باسم من القائمة ملف .
    2. اختيار أنبوب لجمع (A ، B ، C ، D) عن طريق النقر علي علامة في جامع.
    3. اختر نقل وقص أو رسم وقص. في التحرك ووضع قص ، يتم قطع العينة يدويا ، وذلك باستخدام الماوس أو القلم الشاشة التي تعمل باللمس لرسم الاشكال الحرة. في رسم وقص الوضع ، قد يتم رسمها الاشكال الحرة مع الماوس أو القلم الذي تعمل باللمس لقطع اللاحقة. انقر فوق بدء قص زر لبدء القطع بالليزر.
    4. وبمجرد الانتهاء من قطع ، والانسجه المستهدفة مع غشاء القلم يقع في الغطاء من أنبوب جمع من الجاذبية. كرر 4.5 لتجمع مناطق متعددة من الاهتمام إذا لزم الأمر.
      ملاحظه: قد يكون تكرار التخفيضات أو زيادة الطاقة أو الفتحة ضروريا إذا لم ينخفض النسيج إلى الحد الأقصى لأنبوب التجميع بسبب القطع غير المكتملة. لا يمكن قطع العظام المعدنية (البني أو الأسود) مباشره عن طريق الليزر.
  6. تفريغ جامع وإغلاق بعناية أنبوب PCR. ضع الانسجه المجهرية في الثلج الجاف. المتابعة إلى الخطوة التالية أو تخزين في-80 درجه مئوية.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. كرر 4.2 إلى 4.6 للعينه التالية.

5. تحلل من الانسجه المجهرية والعزلة RNA

  1. أذابه الانسجه المجهرية في درجه حرارة الغرفة. الطرد المركزي لفتره وجيزة واحتضان عينات لمده 30 دقيقه في 42 درجه مئوية.
  2. بعد الحضانة ، تدور العازلة تحلل إلى أسفل في أنبوب PCR 0.5 mL. اجراء العلاج DNase واستخراج RNA باستخدام مجموعه العزل RNA (انظر جدول المواد) اتباع تعليمات الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت المقاطع الاكليليه من انسجه الفئران المجمدة الطازجة في البريد 16.5 لإظهار العزلة وجمع الغضروف meckel (MC) ، والغضروف فيزيولوجي ، وعظم فك من قبل lcm. تم تشريح أجنه الفئران في البريد 16.5 وجزءا لا يتجزا في قوالب المبردة مع مجمع أكتوبر. وجمدت العينات في قوالب بسرعة في الجليد الجاف وحمام ميثيل-2-البوتان وتخزينها في-80 درجه مئوية.

لإظهار تلطيخ البنفسج الأوج من الغضروف والعظام ، وأجريت التجميد في الطائرة الاكليليه وجمعت عينات علي الشرائح المجهر. تم غسل المقاطع وتلطيخها وتجفيفها باتباع الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتيح LCM عزل الخلايا المخصبة أو متجانسة من الانسجه غير المتجانسة. وتشمل مزاياه القبض السريع والدقيق للخلايا في سياقها المجري ، في حين ان المساوئ المحتملة تشمل ان تكون مضيعه للوقت ، ومكلفه ، ومحدوده بالحاجة إلى ان يتعرف المستخدم علي السكان الفرعيين المتميزين ضمن عينه محدده30. يوفر هذا البروتوكول تفاصيل LCM من الغضروف الجنيني الماوس والعظام ، وتسليط الضوء علي استخدام الصبغة البنفسجية كريريل في اجراء سريع لتصور الغضروف والعظام لجمع الانسجه دقيقه مع الحفاظ علي سلامه الحمض الريبي النيبالي عالي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني لبحوث طب الأسنان والجمجمة (R01DE022988) ومعهد يونيس كينيدي شريفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (P01HD078233). ويشكر المؤلفون المستودع الحيوي والامراض الاساسيه للوصول إلى منصة لأيكا LMD 6500 في مدرسه Icahn للطب في جبل سيناء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-ميثيل بوتانThermoFisher ScientificO3551-4
محلل حيويأنبوب
ThermoFisher Scientific339653أنابيب الطرد المركزي المعقمة المخروطية ، 50 مل
Cresyl البنفسجي أسيتاتSigma-AldrichC5042
CryostatLeica BiosystemsCM3050 S
ممسحة مهمة حساسةThermoFisher Scientific06-666
قالب تضمين يمكن التخلص منهThermoFisher Scientific1220
الماء المقطرInvitrogen10977-015DNase / RNase
خالية من الإيثانول ، مطلق (200 دليل)ThermoFisher ScientificBP2818الصف البيولوجيا الجزيئية
غشاءالقلم الزجاجيLeica Microsystems11505158
نظام LCMLeica MicrosystemsLeica LMD6500
غطاء مجهرزجاجي ThermoFisher Scientific12-545FP
شرائح مجهرThermoFisher Scientific12-550-15
OCT مركبعلوم المجهر الإلكتروني102094-106
أنبوب PCR بغطاء مسطح ، 0.5 ملAxygenPCR-05-CLCM متوسط
التركيب الدائممختبرات ناقلاتH-5000
طقم عزل الحمض النووي الريبيThermoFisher ScientificKIT0204
RNase عامل إزالة التلوثSigma-AldrichR2020RNase لتنظيف الأسطح
XyleneSigma-Aldrich214736
الطرد المركزي G2939BA شريحة أنابيب جمع

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kardon, G. Development of the musculoskeletal system: Meeting the neighbors. Development. 138 (14), 2855-2859 (2011).
  2. Nichterwitz, S., Chen, G., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  3. Liu, A. Laser capture microdissection in the tissue biorepository. Journal of Biomolecular Techniques. 21 (3), 120-125 (2010).
  4. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  5. Schroeder, A., Mueller, O., et al. The RIN: An RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
  6. Motch Perrine, S. M., Wu, M., et al. Mandibular dysmorphology due to abnormal embryonic osteogenesis in FGFR2-related craniosynostosis mice. Disease Models & Mechanisms. 12 (5), (2019).
  7. Holmes, G., O'Rourke, C., et al. Midface and upper airway dysgenesis in FGFR2-craniosynostosis involves multiple tissue-specific and cell cycle effects. Development. 145 (19), (2018).
  8. Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Käller, M. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).
  9. Tromp, G., Kuivaniemi, H., et al. Structure of a full-length cDNA clone for the preproα1(I) chain of human type I procollagen. Biochemical Journal. 253 (3), 919-922 (1988).
  10. De Wet, W., Bernard, M., et al. Organization of the human pro-alpha 2(I) collagen gene. Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16032-16036 (1987).
  11. Bonewald, L. F. The amazing osteocyte. Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).
  12. Toyosawa, S., Shintani, S., et al. Dentin matrix protein 1 is predominantly expressed in chicken and rat osteocytes but not in osteoblasts. Journal of Bone and Mineral Research. 16 (11), 2017-2026 (2001).
  13. Guo, D., et al. Identification of osteocyte-selective proteins. Proteomics. 10 (20), 3688-3698 (2010).
  14. Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., Karsenty, G. Osf2/Cbfa1: A transcriptional activator of osteoblast differentiation. Cell. 89 (5), 747-754 (1997).
  15. Nakashima, K., Zhou, X., et al. The novel zinc finger-containing transcription factor osterix is required for osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 108 (1), 17-29 (2002).
  16. Termine, J. D., et al. Osteonectin, a bone-specific protein linking mineral to collagen. Cell. 26 (1), 99-105 (1981).
  17. Baldwin, C. T., Reginato, A. M., Prockop, D. J. A new epidermal growth factor-like domain in the human core protein for the large cartilage-specific proteoglycan. Evidence for alternative splicing of the domain. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 15747-15750 (1989).
  18. Strom, C. M., Upholt, W. B. Isolation and characterization of genomic clones corresponding to the human type II procollagengene. Nucleic Acids Research. 12 (2), 1025-1038 (1984).
  19. Ninomiya, Y., Olsen, B. R. Synthesis and characterization of cDNA encoding a cartilage-specific short collagen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 81 (10), 3014-3018 (1984).
  20. Muragaki, Y., Mariman, E. C. M., et al. A mutation in the gene encoding the alpha 2 chain of the fibril-associated collagen IX, COL9A2, causes multiple epiphyseal dysplasia (EDM2). Nature Genetics. 12 (1), 103-105 (1996).
  21. Brewton, R. G., Wood, B. M., et al. Molecular cloning of the alpha 3 chain of human type IX collagen: linkage of the gene COL9A3 to chromosome 20q13.3. Genomics. 30 (2), 329-336 (1995).
  22. Newton, G., Weremowicz, S., et al. Characterization of human and mouse cartilage oligomeric matrix protein. Genomics. 24 (3), 435-439 (1994).
  23. Hiraki, Y., Mitsui, K., et al. Molecular cloning of human chondromodulin-I, a cartilage-derived growth modulating factor, and its expression in Chinese hamster ovary cells. European Journal of Biochemistry. 260 (3), 869-878 (1999).
  24. Smits, P., Li, P., et al. The transcription factors L-Sox5 and Sox6 are essential for cartilage formation. Developmental Cell. 1 (2), 277-290 (2001).
  25. Hayman, A. R., Jones, S. J., et al. Mice lacking tartrate-resistant acid phosphatase (Acp 5) have disrupted endochondral ossification and mild osteopetrosis. Development. 122 (10), 3151-3162 (1996).
  26. Dai, X. -M., Ryan, G. R., et al. Targeted disruption of the mouse colony-stimulating factor 1 receptor gene results in osteopetrosis, mononuclear phagocyte deficiency, increased primitive progenitor cell frequencies, and reproductive defects. Blood. 99 (1), 111-120 (2002).
  27. Gowen, M., Lazner, F., et al. Cathepsin K knockout mice develop osteopetrosis due to a deficit in matrix degradation but not demineralization. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (10), 1654-1663 (1999).
  28. Faccio, R., Takeshita, S., Zallone, A., Ross, F. P., Teitelbaum, S. L. c-Fms and the αvβ3 integrin collaborate during osteoclast differentiation. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 749-758 (2003).
  29. Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201-209 (2002).
  30. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods in Molecular Biology. 11723, 1-17 (2018).
  31. Goldsworthy, S. M., Stockton, P. S., Trempus, C. S., Foley, J. F., Maronpot, R. R. Effects of fixation on RNA extraction and amplification from laser capture microdissected tissue. Molecular Carcinogenesis. 25 (2), 86-91 (1999).
  32. Clément-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
  33. Farris, S., Wang, Y., Ward, J. M., Dudek, S. M. Optimized method for robust transcriptome profiling of minute tissues using laser capture microdissection and low-input RNA-seq. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 185(2017).
  34. Espina, V., Heiby, M., Pierobon, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Review of Molecular Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
  35. Martuscello, R. T., Louis, E. D., Faust, P. L. A stainless protocol for high quality RNA isolation from laser capture microdissected Purkinje cells in the human post-mortem cerebellum. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
  36. Bevilacqua, C., Makhzami, S., Helbling, J. C., Defrenaix, P., Martin, P. Maintaining RNA integrity in a homogeneous population of mammary epithelial cells isolated by Laser Capture Microdissection. BMC Cell Biology. 11 (95), (2010).
  37. Takahashi, N., Tarumi, W., Hamada, N., Ishizuka, B., Itoh, M. T. Cresyl violet stains mast cells selectively: Its application to counterstaining in immunohistochemistry. Zoological Science. 34 (2), 147-150 (2017).
  38. Sheldon, A. R., Almli, L., Ferriero, D. M. Copper/zinc superoxide dismutase transgenic brain in neonatal hypoxia-ischemia. Methods in Enzymology. 353, 389-397 (2002).
  39. Kolijn, K., Van Leenders, G. J. L. H. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Research Notes. 9, 17(2016).
  40. Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
  41. Filliers, M., et al. Laser capture microdissection for gene expression analysis of inner cell mass and trophectoderm from blastocysts. Analytical Biochemistry. 408 (1), 169-171 (2011).
  42. Vandewoestyne, M., et al. Laser capture microdissection: Should an ultraviolet or infrared laser be used? Analytical Biochemistry. 439 (2), 88-98 (2013).
  43. Ayturk, U. RNA-seq in skeletal biology. Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 178-185 (2019).
  44. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  45. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: A molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  46. Chen, J., et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature Protocols. 12 (3), 566-580 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA

مقالات ذات صلة