يصف هذا البروتوكول سير العمل خطوه بخطوه للحصول علي التكلفة المناعية لIBA1 و TMEM119 ، بالاضافه إلى تحليل الكثافة الصغرى والتوزيع والتشكل ، فضلا عن تسلل الخلايا النقوي الطرفية في انسجه المخ الماوس.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تلطيخ المناعية باستخدام IBA1 و TMEM119 لكثافة Microglial ، المورفولوجية والطرفية الخلية النخاعية تحليل تسلل في الدماغ الماوس
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
هذا هو بروتوكول لتصور مزدوج من الخلايا الصغيرة والتسلل الضامة في انسجه المخ الماوس. TMEM119 (التي تسمي الميكروبات الصغيرة بشكل انتقائي) ، عندما يقترن IBA1 (الذي يوفر التصور استثنائيه من المورفولوجية) ، يسمح التحقيق في التغيرات في الكثافة والتوزيع والتشكل. التحديد الكمي لهذه المعلمات أمر مهم في توفير رؤى حول الأدوار التي تمارسها الخلايا الصغيرة ، الضامة المقيمة في الدماغ. في ظل الظروف الفسيولوجية العادية ، يتم توزيع الخلايا الصغيرة بانتظام في نمط يشبه الفسيفساء وتقدم سوما صغيره مع العمليات الدقيقة. ومع ذلك ، وكاستجابة للعوامل البيئية (اي الصدمات ، والعدوى ، والمرض ، أو الاصابه) ، يتم تغيير الكثافة الصغرى ، والتوزيع ، والمورفولوجية في مختلف الآداب ، اعتمادا علي الاهانه. بالاضافه إلى ذلك ، فان طريقه التلطيخ المزدوج الموصوفة تسمح بتصور الضامة التسلل في الدماغ استنادا إلى التعبير عن IBA1 ودون التنظير مع TMEM119. التالي فان هذا النهج يسمح بالتمييز بين الخلايا الصغيرة والضامة المتسللة ، وهو أمر مطلوب لتوفير رؤى وظيفية لمشاركتها المتميزة في توازن الدماغ في مختلف سياقات الصحة والمرض. يدمج هذا البروتوكول أحدث النتائج في المناعة العصبية التي تتعلق بتحديد علامات انتقائية. كما انها بمثابه أداه مفيده لكل من خبراء المناعة العصبية ذوي الخبرة والباحثين الذين يسعون إلى دمج المناعة العصبية في المشاريع.
المقدمة
سواء الحاده أو المزمنة ، ويتاثر التهاب العصبي باحكام من الخلايا الصغيرة ، والضامة المقيمين في الدماغ. يعتبر تصور الخلايا الصغيرة من خلال المناعة أمرا قيما لدراسة التهاب العصبي مع استخدام المجهر الضوئي ، وهي تقنيه يمكن الوصول اليها بشكل كبير. في ظروف التماثل المنزلي ، يتم عاده توزيع الخلايا الصغيرة في نمط غير متراكب يشبه الفسيفساء. هم يبديون [سومد] صغيره ان يمدد عمليات [رفيد]1, اي أحيانا اتصلت واحده آخر2. العمليات المجهرية التي يتم مسحها بشكل حيوي الدماغ parenchyma ، والتفاعل مع الخلايا العصبية ، وغيرها من الكريات الدبقيه ، والاوعيه الدموية خلال الظروف الفسيولوجية العادية3. وقد تم تجهيز ميكروليا مع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية بالاتفاق مع المبادئ التوجيهية للجان المؤسسية للأخلاقيات الحيوانية ، وفقا للمجلس الكندي لرعاية الماشية ولجنه الرعاية الحيوانية التابعة لجامعه لافال.
1-التحصين المناعي
- حدد ثلاثه أقسام الدماغ الماوس التي تحتوي علي منطقه الفائدة (ROI) (اي ، الحصين) مع مساعده من أطلس الدماغ. ضع الأقسام في صفيحه بلاستيكية متعددة الآبار وغطيها ب350 μL من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (الجدول 1).
ملاحظه: للحصول علي أفضل النتائج ، يجب ان يكون perfused العقول مع 4 ٪ بارافورمالدهيد وقطع إلى سمك 50 μm مع الذبذبات. للحصول علي لوحه متعددة الآبار 24 ، كل بئر يمكن ان تعقد ما يصل إلى سته أقسام. الحجم الموصي ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1 المشاركة في وضع العلامات علي الخلايا الصغيرة التي تستخدم IBA1 و TMEM119 في الجزء الإكليلي من الحصين الظهري الذي يبلغ 20x بواسطة المجهر الفلوري. التلطيخ الناجح يكشف عن الأجسام الخلوية الصغيرة وعملياتها الدقيقة (الشكل 1ا − ج). هذا تلطيخ يسمح تحديد كثافة ميكروجليال والتوزيع وتحديد المجموعات الصغيرة (الشكل 1)والضامة التسلل (الشكل 1
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويمكن تقسيم هذا البروتوكول في جزاين الحرجة: نوعيه تلطيخ والتحليل. إذا كان تلطيخ ليس الأمثل ، وسوف تفشل في تمثيل الخلايا الدقيقة بشكل كاف ، التالي تؤثر علي الكثافة ، والتوزيع ، وقياسات المورفولوجية. الاضافه إلى ذلك ، يمكن الاستهانة بنسبه الخلايا النخاعية الطرفية للتسلل. هذا هو الإصدار الأمثل من البروتوكول تلطيخ ، ولكن هناك العديد من العوامل التي قد تؤدي إلى صور دون الأمثل. علي الرغم من ان الانصهار من الحيوانية غير المدرجة في هذا البروتوكول ، إذا كان تثبيت الدماغ ليست جيده التنفيذ ، سيتم اختراق نوعيه تلطيخ. بالاضافه إلى ذل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
ونحن ممتنون لناتالي فرناكس علي توجيهها ومساعدتها في التجارب. ونود أيضا ان نشكر السيد ايمانويل بلانيل سيرج ريفيست لاستخدامهما المجاهر والمجهر المحوري ، علي التوالي. وقد مول هذا العمل جزئيا بمنح دراسية من المجلس المكسيكي للعلم والتكنولوجيا (CONACYT ؛ إلى الاتحاد الأعصاب) ، ومؤسسه العائلة المختارة ومركز البحوث العلمية الخاصة (ك) ، وصندوق البحوث في كيبيك-سانتيه (إلى م.) ، معهد shastri الهندي الكندي (إلى K.B.) ، فضلا عن منحه ديسكفري من العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا (NSERC) إلى M.E.T. M.E.T. يحمل كرسي البحوث الكندية (الطبقة الثانية) من اللدونة المناعية العصبية في الصحة والعلاج.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 حمار مضاد للفأر | Invitrogen / Thermofisher | A21202 | |
| Alexa Fluor 568 الماعز المضاد للأرانب | Invitrogen / Thermofisher | A11011 | |
| Biolite 24 Well متعدد الأطباق | ثيرمو فيشر | 930186 | |
| الألبومين البقري | مصل الألبومين EMD Millipore Corporation | 2930 | |
| حامض الستريك | سيجما ألدريتش | C0759-500G | |
| DAPI صبغة حمض Nuseleic | Invitrogen / Thermofisher | MP 01306 | |
| Fine Brush | Art Store | ||
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| الجيلاتين من جلد أسماك المياه الباردة | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| غطاء مجهر فيشر | العلمي | 1254418 | |
| Microslides مشحونة إيجابيا | VWR | 48311-703 | |
| ماوس أحادي النسيلة Anti-IBA1 | Millipore | MABN92 | |
| Na2H2PO4& middot; H2O | BioShop Canada Inc. | SPM306 ، SPM400 | |
| Na 2< / sub>HPO4< / sub> | BioShop Canada Inc. | SPD307 ، SPD600 | |
| NaBH 4< / sub> | Sigma-Aldrich | 480886 | |
| كلوريد الصوديوم | فيشر العلمي | S642500 | |
| مصل الحمار العادي (NDS) | مختبرات جاكسون إيمونوريسيرش إنك. | 017-000-121 | |
| مصل الماعز العادي (NGS) | مختبرات Jackson ImmunoResearch Inc. | 005-000-121 | |
| Parafilm-M | Parafilm | PM-999 | |
| أرنب أحادي النسيلة مضاد TMEM119 | Abcam | ab209064 | |
| نموذج حمام الاهتزاز المتبادل 25 | ماصة | ||
| TRS002 / TRS004 | |||
| تريتون-X-100 | سيجما-ألدريتش | T8787 | |
| توين 20 | سيجما ألدريتش | P7949-100ML |
المراجع
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience. 39 (1), 151-170 (1990).
- Milior, G., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 10/12/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Immunofluorescence Staining Using IBA1 and TMEM119 for Microglial Density, Morphology and Peripheral Myeloid Cell Infiltration Analysis in Mouse Brain. An author name was updated.
The name was corrected from:
Maude Bordelau
to:
Maude Bordeleau
