Method Article

في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة

DOI:

10.3791/60541

⸱

November 1st, 2019

 ,  ,  , 
1Heart Research Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3Department of Biomedical Sciences, University of Copenhagen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المقدمة هنا هو بروتوكول للكشف عن الإنتاج الضام (MET) فخ خارج الخلية في ثقافة الخلايا الحية باستخدام المجهر وتلطيخ فلوري. ويمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول لدراسة محدده علامات البروتين التقي بتلطيخ المناعي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحديد الإفراج عن الفخاخ خارج الخلية (ETs) من العدلات باعتبارها عاملا مساهما في تطوير الامراض المتعلقة بالتهاب مزمن. العدلات ETs (الناموسيات) تتكون من شبكه من الحمض النووي ، والبروتينات هيستون ، والبروتينات الحبيبية المختلفة (اي ، الميلوكسيداز ، اللدائن ، و كاتيبسين G). الخلايا المناعية الأخرى ، بما في ذلك الضامة ، ويمكن أيضا ان تنتج ETs ؛ ومع ذلك ، إلى اي مدي يحدث هذا في الجسم الآخر وما إذا كانت الفخاخ خارج الخلية الضامة (ميتس) تلعب دورا في أليات المرضية لم يتم فحصها بالتفصيل. لفهم أفضل دور ميتس في الامراض التهابيه ، تم تطوير بروتوكول لتصور الإفراج عن التقي من الضامة البشرية الاوليه في المختبر ، والتي يمكن أيضا ان تستغل في التجارب المناعية. وهذا يسمح بمزيد من توصيف هذه الهياكل ومقارنتها مع ETs الصادرة من العدلات. الضامة البشرية المشتقة من الخلايا (HMDM) تنتج ميتس عند التعرض لمحفزات التهابيه مختلفه بعد التمايز إلى النمط الظاهري M1 الموالية للالتهابات. ويمكن تصور الإفراج عن ميتس عن طريق المجهر باستخدام الأخضر الفلورسنت وصمه عار الحمض النووي التي يتم تعريضها للخطر الخلايا الحية (علي سبيل المثال ، SYTOX الخضراء). استخدام الضامة الابتدائية المعزولة الطازجة ، مثل HMDM ، هو مفيد في النمذجة في الظواهر التهابيه الجسم التي هي ذات الصلة للتطبيقات السريرية المحتملة. ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لدراسة الإفراج عن الخلايا البشرية الاحاديه الخلية (علي سبيل المثال ، thp-1) بعد التمايز في الضامة مع خلات ميريستات phorbol أو غيرها من خطوط الخلايا الضامة (علي سبيل المثال ، الضامة murine-مثل الخلايا J774A).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تحديد الإفراج عن ETs من العدلات لأول مره كاستجابة مناعية فطريه الناجمة عن العدوى البكتيرية1. وهي تتكون من العمود الفقري الحمض النووي التي ترتبط البروتينات الحبيبية المختلفة مع خصائص مضاده للبكتيريا ، بما في ذلك اللدائن العدلات و myeloperoxidase2. الدور الرئيسي لل العدلات (الناموسيات) هو للقبض علي مسببات الامراض وتسهيل القضاء عليها3. ومع ذلك ، بالاضافه إلى دور وقائي من ETs في الدفاع المناعي ، وقد اكتشف عدد متزايد من الدراسات أيضا دورا في الامراض المرضية ، وخاصه خلال تطوير امراض يحركها التهاب (اي التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين4). ويمكن تشغيل الإفراج عن ETs من قبل مختلف السايتوكينات الموالية للالتهابات بما في ذلك انترلوكين 8 (آيل-8) وعامل نخر الورم الفا (tnfα)5،6، وتراكم المترجمة من ets يمكن ان تزيد من تلف الانسجه واستحضار استجابه الموالية للالتهابات7. علي سبيل المثال, وقد تورطت ETs كما لعب دورا سببيه في تطوير تصلب الشرايين8, تعزيز تخثر9, وتوقع مخاطر القلب والاوعيه الدموية10.

ومن المسلم به الآن انه بالاضافه إلى العدلات, الخلايا المناعية الأخرى (اي, الخلايا البدينة, الحمضات, والضامة) يمكن أيضا الإفراج عن ETs علي التعرض للتحفيز الميكروبية أو الموالية للالتهابات11,12. قد يكون هذا مهما بشكل خاص في حاله الضامة ، بالنظر إلى دورها الرئيسي في تطوير وتنظيم وحل الامراض التهابيه المزمنة. ولذلك ، من المهم الحصول علي فهم أكبر للعلاقة المحتملة بين الإفراج عن ET من الضامة والامراض المرتبطة بالتهاب التنمية. وقد أظهرت الدراسات الاخيره وجود ميتس والشباك في لويحات تصلب الشرايين البشرية سليمه ونظمت الجلطات13. المثل, وقد تورط ميتس في القيادة أصابه الكلي من خلال تنظيم الاستجابات التهابيه14. ومع ذلك ، وعلي النقيض من العدلات ، وهناك بيانات محدوده عن أليات تشكيل اجتمع من الضامة. الدراسات الاخيره باستخدام نماذج الإنسان في المختبر من تشكيل اجتمع تظهر بعض الاختلافات في مسارات المشاركة في كل نوع الخلية (اي ، فيما يتعلق بعدم وجود هيستون سيترولينيشن مع الضامة)6. ومع ذلك ، فقد أظهرت بعض ان الإفراج عن NET يمكن ان يحدث أيضا في غياب هيستون سيترولينيشن15.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير طريقه بسيطه ومباشره لتقييم الإفراج عن الوفاء في نموذج الضامة ذات الصلة سريريا. وهناك عدد من مختلف في المختبر نماذج الخلايا الضامة التي تم استخدامها لدراسة ميتس (اي THP-1 خط خليه الخلايا الاحاديه الإنسان ومختلف خطوط الخلايا الضامة murine)16. هناك بعض القيود المرتبطة بهذه النماذج. علي سبيل المثال ، التمايز من الخلايا الاحاديه thp-1 إلى الضامة عاده ما يتطلب خطوه فتيله ، مثل أضافه خلات phorbol ميريستات (نقدا) ، الذي ينشط نفسه البروتين كيناز C (pkc)-المسارات التابعة. ومن المعروف هذه العملية لتشغيل ET الإصدار4 والنتائج في القاعدية منخفضه التقي الإفراج من خلايا thp-1. وقد أبرزت دراسات أخرى بعض الاختلافات في النشاط البيولوجي والاستجابات التهابيه التي شنتها الضامة في الجسم الحيوي مقارنه مع الخلايا المعالجة بالنقد العامل THP-117.

المثل ، فان السلوك والاستجابات التهابيه من مختلف خطوط الخلايا الضامة murine لا تمثل تماما طيف الاستجابة من الضامة البشرية الاوليه18. ولذلك ، لغرض التحقيق في تكوين الضامة ET في البيئة السريرية ، ويعتقد ان الضامة البشرية الاوليه المشتقة (HMDMs) نموذج أكثر ملاءمة بدلا من الخلايا الاحاديه أو murine الضامة مثل خطوط الخلية.

وقد ثبت ET الإفراج عن HMDMs M1 الاستقطاب التالية التعرض لهذه الخلايا لعدد من المحفزات التهابيه المختلفة ، بما في ذلك الأحماض المؤكسدة المشتقة الميلوكسيداز (الحسين) ، ونقدا ، TNFα ، و IL-86. وصف هنا هو بروتوكول لاستقطاب HMDMs إلى النمط الظاهري M1 وتصور الإفراج عن اللاحقة التقي عند التعرض لهذه المحفزات التهابيه. وتستخدم هذه النقد كحافز للإفراج عن الاجتماعات لتسهيل مقارنات الدراسات السابقة التي استخدمت العدلات. الأهم من ذلك ، يتم استخدام الهوكي ، آيل-8 ، و TNFα أيضا لتحفيز الإفراج عن الوفاء ، والتي يعتقد انها أفضل نماذج من البيئة التهابيه في الجسم الفيفو. الطريقة المجهرية لتصور الإفراج عن ET ينطوي تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية في ثقافات الخلايا الحية باستخدام الأخضر SYTOX ، وهو الفلورية الخضراء الفلورسنت وصمه عار التي تم تطبيقها بنجاح في الدراسات العدلات السابقة. وتسمح هذه الطريقة بالتقييم السريع والنوعي للإصدار ET ، ولكنها ليست مناسبه كطريقه قائمه بذاتها للقياس الكمي لمدي الإفراج عن ET. وينبغي استخدام المنهجية البديلة إذا اقتضى الأمر القياس الكمي لمقارنه مدي الإفراج عن البيانات التعريفية الناتجة عن ظروف أو تدخلات علاجيه مختلفه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم عزل HMDM من المستحضرات البشرية معطف بافي المقدمة من بنك الدم مع موافقه الأخلاق من منطقه سيدني الصحية المحلية.

1. الثقافة HMDM

  1. عزل الخلايا الاحاديه من الاستعدادات معطف بافي أعدت من الدم المحيطي من المتبرعين البشرية الصحية باستخدام استعداد تجاريا المتاحة لعزل الخلايا الليمفاوية ، تليها التيار الطرد المركزي المضادة لل19، 20-الآن
  2. تاكيد وجود الخلايا الاحاديه عن طريق الخلايا الخلوية وتلطيخ مع تعديل Giemsa وصمه عار لتوصيف الخلايا الاحاديه19.
  3. تحت ظروف معقمه ، وضبط كثافة الخلايا الاحاديه إلى 1 × 106 خليه/مل باستخدام rpmi-1640 وسائل الاعلام دون المصل. أضافه 1 مل من هذا التعليق الخلية إلى كل بئر من 12 لوحه ثقافة الانسجه جيدا. الثقافة في حاضنه الخلية في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 لمده 2 ساعة لتعزيز التزام بلوحه ثقافة الانسجه.
  4. في ظروف معقمه ، قم بازاله الوسائط الخلوية واستبدلها بوسائل الاعلام الثقافية الكاملة RPMI-1640 التي تحتوي علي 10% (v/v) المصل البشري المجمع و 20 ملم L-الجلوتامين.
  5. ثقافة الخلايا في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية لمده 8 أيام ، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم 2.

2. استقطاب HMDM

  1. في ظل ظروف معقمه ، واعداد وسائل الاعلام فتيله M1 عن طريق أضافه γ مضاد للفيروسات (ifnγ ؛ 20 نانوغرام/مل) و عديد السكاريد (lps ؛ 1 ميكروغرام/مل) إلى الاعلام الثقافة rpmi-1640 كامله. اعداد وسائل الاعلام فتيله M2 عن طريق أضافه انترلوكين 4 (IL-4 ؛ 20 نانوغرام/مل) إلى وسائل الاعلام الثقافة rpmi-1640 كامله.
  2. في ظروف معقمه ، يستنشق وسائل الاعلام من الآبار لوحه ثقافة الانسجه التي تحتوي علي HMDM ، التي تم المصنفة ومثقف كما هو موضح في القسم 1.
  3. غسل بعناية الآبار التي تحتوي علي الخلايا 3x مع العقيمة التلفزيونية (ما قبل الإحماء إلى 37 درجه مئوية) ، وذلك باستخدام 1 مل قسامات من تلفزيوني.
  4. أضف 1 مل من الوسائط الفتيلة M1 أو M2 إلى كل المحتويات الجيدة التي تحتوي علي HMDM (أيهما مناسب للتجربة).
  5. احتضان الخلايا ل 48 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.

3. تحفيز HMDM للحث علي الإفراج عن الوفاء

  1. في ظروف معقمه ، واعداد وسائل الاعلام الثقافة التي تحتوي علي محفزات مختلفه من الإفراج التقي (أيهما المناسب للتجربة) لكامل RPMI-1640 وسائل الاعلام: نقدا (25 نانومتر) ، الإنسان المؤتلف TNFα (25 نانوغرام/مل) ، أو الإنسان المؤتلف IL-8 (50 ng/mL ).
  2. بالنسبة للتجارب التي أجريت مع تحفيز الهوكي ، أعد الهوكي (200 μM) في HBSS (قبل التسخين إلى 37 درجه مئوية) ، قبل الاضافه إلى الخلايا مباشره. تاكد من عدم اعداد الوحدة في الوسائط الكاملة للخلايا.
    ملاحظه: يتم تحديد تركيز الحل المخزون من الهراء عن طريق قياس امتصاص الاشعه فوق البنفسجية من المحلول عند 292 nm ودرجه الحموضة = 116 واستخدام معامل الانقراض من 350 M-1سم-121.
  3. بعد الاستقطاب العلاج الموصوفة في القسم 2 ، يستنشق وسائل الاعلام الخلية من كل بئر ويغسل بعناية الخلايا 3x مع 1 مل قسامات اما: العقيمة تلفزيوني (لنقدا ، tnfα و IL-8) أو hbss (ل الحسين) ، التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجه مئوية.
  4. لاجراء تجارب مع النقد الخاص ، TNFα ، أو آيل-8: أضافه 1 مل من وسائل الاعلام الكاملة التي تحتوي علي النقد الخاص ، TNFα ، أو آيل-8 بعد أزاله التلفزيونية في خطوه الغسيل النهائي.
  5. للتجارب مع TNFα ، احتضان الخلايا ل 6 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية. لاجراء تجارب مع قوه النقد الخاصة و IL-8 ، احتضان الخلايا ل 24 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.
  6. لاجراء تجارب مع السيد الحسين ، أضف 1 مل من الهوكي في HBSS بعد أزاله HBSS في خطوه الغسيل النهائية. ثم ، احتضان الخلايا لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.
    1. يستنشق بعناية الخلية ماده طافي ويغسل الخلايا 3x مع 1 مل قسامات من hbss كما هو موضح في الخطوة 3.3.
    2. بعد أزاله HBSS من خطوه الغسيل النهائية ، أضف 1 مل من الوسائط الثقافية RPMI-1640 الكاملة. ثم ، احتضان الخلايا ل 24 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO2 في حاضنه الخلية.

4. التصور من اجتمع في ثقافة خليه حيه

  1. اعداد الصبغة الخضراء SYTOX في HBSS بتركيز 40 μM.
  2. في نهاية العلاجات الموصوفة في القسم 3 للحث علي الإفراج عن MET ، أضافه مباشره 25 μL من 40 μM من الصبغة لكل المحتوية جيدا HMDM.
  3. احتضان الخلايا في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 5 دقائق في الظلام.
  4. وضع HMDM في الآبار ثقافة الانسجه علي مرحله المجهر من المجهر الفلورسنت المقلوب للتصوير.
  5. إجراءات المجهر
    1. قم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري واسع الطيف ، ومصدر الضوء الساطع ، والمجهر المقلوب المثبت بكاميرا رقميه ملونه عاليه الدقة (انظر جدول المواد).
    2. تدوير عجله فلتر إلى موقف "عدد 2" للفلوري الأخضر (الاثاره = 504 نانومتر ، الانبعاثات = 523 nm) للتصوير من العينات الملونة الخضراء الواردة داخل الآبار ثقافة الانسجه.
    3. باستخدام الهدف 5x ، والتركيز علي الصورة مع التركيز الخشن ، ثم المقابض التركيز الدقيق علي المجهر ، حتى تظهر الصورة حاده ، واضحة ، وتركز عندما ينظر اليها من خلال العدسة المجهر.
    4. التبديل المجهر إلى وضع الكاميرا.
    5. بدء تشغيل البرامج المقترنة.
    6. حدد علامة التبويب التقاط علي البرنامج.
    7. انقر علي زر التشغيل لمعاينه الصورة وضبط مقبض التركيز الدقيق علي المجهر حتى تظهر الصورة حاده وواضحة ومركزه في نافذه معاينه البرنامج.
    8. انقر فوق الزر التقاط .
      ملاحظه: سيتم عرض الصورة الملتقطة تلقائيا في البرامج المصاحبة.
    9. ضمن البرنامج ، انقر فوق ملف | حفظ كنوع ملف الصورة المطلوبة.
    10. علي المجهر ، تدوير عجله التصفية إلى موقف "عدد 5" للتصوير برايت وكرر الخطوات 4.5.2-4.5.9 للحصول علي صوره المقابلة برايت.
    11. كرر الخطوات 4.5.2 – 4.5.10 حسب الضرورة للحصول علي الصورة اللاحقة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظهر صور برارفيلد التي تظهر التغيرات المورفولوجية لل HMDM استجابه لمحفزات لتمايز الخلايا في الشكل 1. وأظهرت الضامة M1 الاستقطاب من التجارب مع HMDM يتعرض لifnγ و LPS شكل خليه ممدود والمغزل ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (اللوحة الوسطي). النسبة للمقارنة ، فان شكل الضامة M2 الاستقطاب بعد التعرض لل HMDM إلى IL-4 ل 48 h كانت عاده مستديرة ومسطحه ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (لوحه اليمين المتطرف).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجيل والتصور من تشكيل اجتمع باستخدام M1 المتمايزة HMDMs يمثل نموذج جديد في المختبر التي قد تكون مفيده للتحقيق في الدور المرضي المحتملة لهذه الهياكل الضامة ، وخاصه تحت التهابات مزمنة الظروف. ويوفر بروتوكولا قويا لتحفيز الضامة البشرية الاوليه للإفراج عن ميتس ، والتي يمكن أيضا ان تستخدم في الدراسات ذات الصلة مع البويضات البشرية أو خطوط الخلايا الضامة murine. ان التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول لتحفيز تكوين الاجتماعات من قبل HMDM يعتمد علي ثقافة الخلايا الدقيقة والتعامل معها للحفاظ علي سلامه الخلايا الجيدة. وهذا سيزيد من مدي ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان هذا العمل مدعوما بمنحه الأثر الدائم (IPAP201601422) ومنحه المشروع الطبي الحيوي لمؤسسه نوفو نورديسك (NNF17OC0028990). كما يعترف باستلام الجائزة الاستراليه للدراسات العليا من جامعه سيدني. ونود ان نشكر السيد بات بيسساراكسيت والسيدة مورغان جونز علي المساعدة في العزلة الاحاديه وثقافة الانسجه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
120Q مصدر ضوء الفلورسنت واسع الطيفEXFO Photonic Solutions ، تورنتو ، كنداسلسلة x-cite
Corning CellBIND لوحة الآبار المتعددة (12 بئرا)Sigma-AldrichCLS3336لزراعة الخلايا
مجموعة صبغة Quik التفاضلية (Giemsa المعدلة)Polysciences Inc.24606توصيف الخلايا الوحيدة
الملح المتوازن هانكس (HBSS) 14025050ثيرمو فيشرلخطوات الغسيل ومعالجة HOCl
حمض هيبوكلوروس (HOCl)سيجما ألدريتش320331لتحفيز MET
PMC4031 إنترفيرون جاماثيرمو فيشرلتحضير M1
إنترلوكين 4العلوم المتكاملةrhil-4لتحضير M2
Interleukin 8Miltenyl Biotec130-093-943لتحفيز MET
L-GlutamineSigma-Aldrich59202Cتمت إضافته إلى وسائط
الثقافة عديدات السكاريدالدهنية المتكاملةالعلوم tlrl-eblpsلتحضير M1
LymphoprepAxis-Shield PoC AS1114544لعزل الخلايا الوحيدة
أوليمبوس IX71 مقلوب مجهرأوليمبوس ، طوكيو ، اليابان
فوربول 12- ميريستات 13-أسيتات (PMA)سيجما ألدريتشP8139لتحفيز MET
محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS)سيجما ألدريتشD5652لخطوات الغسيل
وسائل الإعلامسيجما ألدريتشR8758لزراعة الخلايا
SYTOX greenLife TechnologiesS7020ل MET visulaization
TH4-200 مصدر ضوء المجال الساطعأوليمبوس ، طوكيو ، اليابانسلسلة x-cite
عامل نخر الورم ألفالونزا300-01A-50لتحفيز MET
محلول

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), 1000639(2009).
  3. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews in Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews in Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
  5. Keshari, R. S., et al. Cytokines induced neutrophil extracellular traps formation: implication for the inflammatory disease condition. PLoS One. 7 (10), 48111(2012).
  6. Rayner, B. S., et al. Role of hypochlorous acid (HOCl) and other inflammatory mediators in the induction of macrophage extracellular trap formation. Free Radical Biology and Medicine. 129, 25-34 (2018).
  7. Gunzer, M. Traps and hyperinflammation - new ways that neutrophils promote or hinder survival. British Journal of Haematology. 164 (2), 189-199 (2014).
  8. Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition reduces vascular damage and modulates innate immune responses in murine models of atherosclerosis. Circulation Research. 114 (6), 947-956 (2014).
  9. Megens, R. T., et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis. Thrombosis and Haemostasis. 107 (3), 597-598 (2012).
  10. Doring, Y., Weber, C., Soehnlein, O. Footprints of neutrophil extracellular traps as predictors of cardiovascular risk. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 33 (8), 1735-1736 (2013).
  11. Goldmann, O., Medina, E. The expanding world of extracellular traps: not only neutrophils but much more. Frontiers in Immunology. 3 (420), 1-10 (2012).
  12. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. Journal of Leukocyte Biology. 97 (6), 1023-1035 (2015).
  13. Pertiwi, K. R., et al. Extracellular traps derived from macrophages, mast cells, eosinophils and neutrophils are generated in a time-dependent manner during atherothrombosis. Journal of Pathology. 247 (4), 505-512 (2019).
  14. Okubo, K., et al. Macrophage extracellular trap formation promoted by platelet activation is a key mediator of rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. Nature Medicine. 24 (2), 232-238 (2018).
  15. Boeltz, S., et al. To NET or not to NET:current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
  16. Doster, R. S., Rogers, L. M., Gaddy, J. A., Aronoff, D. M. Macrophage Extracellular Traps: A Scoping Review. Journal of Innate Immunology. 10 (1), 3-13 (2018).
  17. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5 (1), 8668(2010).
  18. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
  19. Brown, B. E., Rashid, I., van Reyk, D. M., Davies, M. J. Glycation of low-density lipoprotein results in the time-dependent accumulation of cholesteryl esters and apolipoprotein B-100 protein in primary human monocyte-derived macrophages. FEBS Journal. 274, 1530-1541 (2007).
  20. Garner, B., Dean, R. T., Jessup, W. Human macrophage-mediated oxidation of low-density lipoprotein is delayed and independant of superoxide production. Biochemical Journal. 301, 421-428 (1994).
  21. Morris, J. C. The acid ionization constant of HOCl from 5 °C to 35 °C. Journal of Phyical Chemistry. 70, 3798-3805 (1966).
  22. Pan, G. J., Rayner, B. S., Zhang, Y., van Reyk, D. M., Hawkins, C. L. A pivotal role for NF-kappaB in the macrophage inflammatory response to the myeloperoxidase oxidant hypothiocyanous acid. Archives of Biochemistry and Biophysics. 642, 23-30 (2018).
  23. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. Journal of Leukocyte Biology. 91 (3), 369-376 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Trap ReleaseHuman Monocyte derived MacrophagesM1 PolarizationSYTOX Green StainingFluorescence MicroscopyHypochlorous Acid StimulationPMA StimulationTNF Alpha StimulationInterleukin 8 StimulationMET Visualization

Related Articles