في المختبر التحفيز والتصور من الإفراج عن فخ خارج الخلية في الضامة البشرية المتمايزة المشتقة

تم تحديد الإفراج عن ETs من العدلات لأول مره كاستجابة مناعية فطريه الناجمة عن العدوى البكتيرية¹. وهي تتكون من العمود الفقري الحمض النووي التي ترتبط البروتينات الحبيبية المختلفة مع خصائص مضاده للبكتيريا ، بما في ذلك اللدائن العدلات و myeloperoxidase². الدور الرئيسي لل العدلات (الناموسيات) هو للقبض علي مسببات الامراض وتسهيل القضاء عليها³. ومع ذلك ، بالاضافه إلى دور وقائي من ETs في الدفاع المناعي ، وقد اكتشف عدد متزايد من الدراسات أيضا دورا في الامراض المرضية ، وخاصه خلال تطوير امراض يحركها التهاب (اي التهاب المفاصل الروماتويدي تصلب الشرايين⁴). ويمكن تشغيل الإفراج عن ETs من قبل مختلف السايتوكينات الموالية للالتهابات بما في ذلك انترلوكين 8 (آيل-8) وعامل نخر الورم الفا (tnfα)^5،6، وتراكم المترجمة من ets يمكن ان تزيد من تلف الانسجه واستحضار استجابه الموالية للالتهابات⁷. علي سبيل المثال, وقد تورطت ETs كما لعب دورا سببيه في تطوير تصلب الشرايين⁸, تعزيز تخثر⁹, وتوقع مخاطر القلب والاوعيه الدموية¹⁰.

ومن المسلم به الآن انه بالاضافه إلى العدلات, الخلايا المناعية الأخرى (اي, الخلايا البدينة, الحمضات, والضامة) يمكن أيضا الإفراج عن ETs علي التعرض للتحفيز الميكروبية أو الموالية للالتهابات^11,12. قد يكون هذا مهما بشكل خاص في حاله الضامة ، بالنظر إلى دورها الرئيسي في تطوير وتنظيم وحل الامراض التهابيه المزمنة. ولذلك ، من المهم الحصول علي فهم أكبر للعلاقة المحتملة بين الإفراج عن ET من الضامة والامراض المرتبطة بالتهاب التنمية. وقد أظهرت الدراسات الاخيره وجود ميتس والشباك في لويحات تصلب الشرايين البشرية سليمه ونظمت الجلطات¹³. المثل, وقد تورط ميتس في القيادة أصابه الكلي من خلال تنظيم الاستجابات التهابيه¹⁴. ومع ذلك ، وعلي النقيض من العدلات ، وهناك بيانات محدوده عن أليات تشكيل اجتمع من الضامة. الدراسات الاخيره باستخدام نماذج الإنسان في المختبر من تشكيل اجتمع تظهر بعض الاختلافات في مسارات المشاركة في كل نوع الخلية (اي ، فيما يتعلق بعدم وجود هيستون سيترولينيشن مع الضامة)⁶. ومع ذلك ، فقد أظهرت بعض ان الإفراج عن NET يمكن ان يحدث أيضا في غياب هيستون سيترولينيشن¹⁵.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير طريقه بسيطه ومباشره لتقييم الإفراج عن الوفاء في نموذج الضامة ذات الصلة سريريا. وهناك عدد من مختلف في المختبر نماذج الخلايا الضامة التي تم استخدامها لدراسة ميتس (اي THP-1 خط خليه الخلايا الاحاديه الإنسان ومختلف خطوط الخلايا الضامة murine)¹⁶. هناك بعض القيود المرتبطة بهذه النماذج. علي سبيل المثال ، التمايز من الخلايا الاحاديه thp-1 إلى الضامة عاده ما يتطلب خطوه فتيله ، مثل أضافه خلات phorbol ميريستات (نقدا) ، الذي ينشط نفسه البروتين كيناز C (pkc)-المسارات التابعة. ومن المعروف هذه العملية لتشغيل ET الإصدار⁴ والنتائج في القاعدية منخفضه التقي الإفراج من خلايا thp-1. وقد أبرزت دراسات أخرى بعض الاختلافات في النشاط البيولوجي والاستجابات التهابيه التي شنتها الضامة في الجسم الحيوي مقارنه مع الخلايا المعالجة بالنقد العامل THP-1¹⁷.

المثل ، فان السلوك والاستجابات التهابيه من مختلف خطوط الخلايا الضامة murine لا تمثل تماما طيف الاستجابة من الضامة البشرية الاوليه¹⁸. ولذلك ، لغرض التحقيق في تكوين الضامة ET في البيئة السريرية ، ويعتقد ان الضامة البشرية الاوليه المشتقة (HMDMs) نموذج أكثر ملاءمة بدلا من الخلايا الاحاديه أو murine الضامة مثل خطوط الخلية.

وقد ثبت ET الإفراج عن HMDMs M1 الاستقطاب التالية التعرض لهذه الخلايا لعدد من المحفزات التهابيه المختلفة ، بما في ذلك الأحماض المؤكسدة المشتقة الميلوكسيداز (الحسين) ، ونقدا ، TNFα ، و IL-8⁶. وصف هنا هو بروتوكول لاستقطاب HMDMs إلى النمط الظاهري M1 وتصور الإفراج عن اللاحقة التقي عند التعرض لهذه المحفزات التهابيه. وتستخدم هذه النقد كحافز للإفراج عن الاجتماعات لتسهيل مقارنات الدراسات السابقة التي استخدمت العدلات. الأهم من ذلك ، يتم استخدام الهوكي ، آيل-8 ، و TNFα أيضا لتحفيز الإفراج عن الوفاء ، والتي يعتقد انها أفضل نماذج من البيئة التهابيه في الجسم الفيفو. الطريقة المجهرية لتصور الإفراج عن ET ينطوي تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية في ثقافات الخلايا الحية باستخدام الأخضر SYTOX ، وهو الفلورية الخضراء الفلورسنت وصمه عار التي تم تطبيقها بنجاح في الدراسات العدلات السابقة. وتسمح هذه الطريقة بالتقييم السريع والنوعي للإصدار ET ، ولكنها ليست مناسبه كطريقه قائمه بذاتها للقياس الكمي لمدي الإفراج عن ET. وينبغي استخدام المنهجية البديلة إذا اقتضى الأمر القياس الكمي لمقارنه مدي الإفراج عن البيانات التعريفية الناتجة عن ظروف أو تدخلات علاجيه مختلفه.

تم عزل HMDM من المستحضرات البشرية معطف بافي المقدمة من بنك الدم مع موافقه الأخلاق من منطقه سيدني الصحية المحلية.

1. الثقافة HMDM

1. عزل الخلايا الاحاديه من الاستعدادات معطف بافي أعدت من الدم المحيطي من المتبرعين البشرية الصحية باستخدام استعداد تجاريا المتاحة لعزل الخلايا الليمفاوية ، تليها التيار الطرد المركزي المضادة لل^{19، 20}-الآن
2. تاكيد وجود الخلايا الاحاديه عن طريق الخلايا الخلوية وتلطيخ مع تعديل Giemsa وصمه عار لتوصيف الخلايا الاحاديه¹⁹.
3. تحت ظروف معقمه ، وضبط كثافة الخلايا الاحاديه إلى 1 × 10⁶ خليه/مل باستخدام rpmi-1640 وسائل الاعلام دون المصل. أضافه 1 مل من هذا التعليق الخلية إلى كل بئر من 12 لوحه ثقافة الانسجه جيدا. الثقافة في حاضنه الخلية في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO₂ لمده 2 ساعة لتعزيز التزام بلوحه ثقافة الانسجه.
4. في ظروف معقمه ، قم بازاله الوسائط الخلوية واستبدلها بوسائل الاعلام الثقافية الكاملة RPMI-1640 التي تحتوي علي 10% (v/v) المصل البشري المجمع و 20 ملم L-الجلوتامين.
5. ثقافة الخلايا في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO₂ في حاضنه الخلية لمده 8 أيام ، وتغيير وسائل الاعلام كل يوم 2.

2. استقطاب HMDM

1. في ظل ظروف معقمه ، واعداد وسائل الاعلام فتيله M1 عن طريق أضافه γ مضاد للفيروسات (ifnγ ؛ 20 نانوغرام/مل) و عديد السكاريد (lps ؛ 1 ميكروغرام/مل) إلى الاعلام الثقافة rpmi-1640 كامله. اعداد وسائل الاعلام فتيله M2 عن طريق أضافه انترلوكين 4 (IL-4 ؛ 20 نانوغرام/مل) إلى وسائل الاعلام الثقافة rpmi-1640 كامله.
2. في ظروف معقمه ، يستنشق وسائل الاعلام من الآبار لوحه ثقافة الانسجه التي تحتوي علي HMDM ، التي تم المصنفة ومثقف كما هو موضح في القسم 1.
3. غسل بعناية الآبار التي تحتوي علي الخلايا 3x مع العقيمة التلفزيونية (ما قبل الإحماء إلى 37 درجه مئوية) ، وذلك باستخدام 1 مل قسامات من تلفزيوني.
4. أضف 1 مل من الوسائط الفتيلة M1 أو M2 إلى كل المحتويات الجيدة التي تحتوي علي HMDM (أيهما مناسب للتجربة).
5. احتضان الخلايا ل 48 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO₂ في حاضنه الخلية.

3. تحفيز HMDM للحث علي الإفراج عن الوفاء

1. في ظروف معقمه ، واعداد وسائل الاعلام الثقافة التي تحتوي علي محفزات مختلفه من الإفراج التقي (أيهما المناسب للتجربة) لكامل RPMI-1640 وسائل الاعلام: نقدا (25 نانومتر) ، الإنسان المؤتلف TNFα (25 نانوغرام/مل) ، أو الإنسان المؤتلف IL-8 (50 ng/mL ).
2. بالنسبة للتجارب التي أجريت مع تحفيز الهوكي ، أعد الهوكي (200 μM) في HBSS (قبل التسخين إلى 37 درجه مئوية) ، قبل الاضافه إلى الخلايا مباشره. تاكد من عدم اعداد الوحدة في الوسائط الكاملة للخلايا.
   ملاحظه: يتم تحديد تركيز الحل المخزون من الهراء عن طريق قياس امتصاص الاشعه فوق البنفسجية من المحلول عند 292 nm ودرجه الحموضة = 11⁶ واستخدام معامل الانقراض من 350 M^-1سم^-121.
3. بعد الاستقطاب العلاج الموصوفة في القسم 2 ، يستنشق وسائل الاعلام الخلية من كل بئر ويغسل بعناية الخلايا 3x مع 1 مل قسامات اما: العقيمة تلفزيوني (لنقدا ، tnfα و IL-8) أو hbss (ل الحسين) ، التي تم تسخينها مسبقا إلى 37 درجه مئوية.
4. لاجراء تجارب مع النقد الخاص ، TNFα ، أو آيل-8: أضافه 1 مل من وسائل الاعلام الكاملة التي تحتوي علي النقد الخاص ، TNFα ، أو آيل-8 بعد أزاله التلفزيونية في خطوه الغسيل النهائي.
5. للتجارب مع TNFα ، احتضان الخلايا ل 6 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO₂ في حاضنه الخلية. لاجراء تجارب مع قوه النقد الخاصة و IL-8 ، احتضان الخلايا ل 24 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO₂ في حاضنه الخلية.
6. لاجراء تجارب مع السيد الحسين ، أضف 1 مل من الهوكي في HBSS بعد أزاله HBSS في خطوه الغسيل النهائية. ثم ، احتضان الخلايا لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO₂ في حاضنه الخلية.
   1. يستنشق بعناية الخلية ماده طافي ويغسل الخلايا 3x مع 1 مل قسامات من hbss كما هو موضح في الخطوة 3.3.
   2. بعد أزاله HBSS من خطوه الغسيل النهائية ، أضف 1 مل من الوسائط الثقافية RPMI-1640 الكاملة. ثم ، احتضان الخلايا ل 24 ح في 37 درجه مئوية في وجود 5 ٪ CO₂ في حاضنه الخلية.

4. التصور من اجتمع في ثقافة خليه حيه

1. اعداد الصبغة الخضراء SYTOX في HBSS بتركيز 40 μM.
2. في نهاية العلاجات الموصوفة في القسم 3 للحث علي الإفراج عن MET ، أضافه مباشره 25 μL من 40 μM من الصبغة لكل المحتوية جيدا HMDM.
3. احتضان الخلايا في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 5 دقائق في الظلام.
4. وضع HMDM في الآبار ثقافة الانسجه علي مرحله المجهر من المجهر الفلورسنت المقلوب للتصوير.
5. إجراءات المجهر
   1. قم بتشغيل مصدر الضوء الفلوري واسع الطيف ، ومصدر الضوء الساطع ، والمجهر المقلوب المثبت بكاميرا رقميه ملونه عاليه الدقة (انظر جدول المواد).
   2. تدوير عجله فلتر إلى موقف "عدد 2" للفلوري الأخضر (الاثاره = 504 نانومتر ، الانبعاثات = 523 nm) للتصوير من العينات الملونة الخضراء الواردة داخل الآبار ثقافة الانسجه.
   3. باستخدام الهدف 5x ، والتركيز علي الصورة مع التركيز الخشن ، ثم المقابض التركيز الدقيق علي المجهر ، حتى تظهر الصورة حاده ، واضحة ، وتركز عندما ينظر اليها من خلال العدسة المجهر.
   4. التبديل المجهر إلى وضع الكاميرا.
   5. بدء تشغيل البرامج المقترنة.
   6. حدد علامة التبويب التقاط علي البرنامج.
   7. انقر علي زر التشغيل لمعاينه الصورة وضبط مقبض التركيز الدقيق علي المجهر حتى تظهر الصورة حاده وواضحة ومركزه في نافذه معاينه البرنامج.
   8. انقر فوق الزر التقاط .
      ملاحظه: سيتم عرض الصورة الملتقطة تلقائيا في البرامج المصاحبة.
   9. ضمن البرنامج ، انقر فوق ملف | حفظ كنوع ملف الصورة المطلوبة.
   10. علي المجهر ، تدوير عجله التصفية إلى موقف "عدد 5" للتصوير برايت وكرر الخطوات 4.5.2-4.5.9 للحصول علي صوره المقابلة برايت.
   11. كرر الخطوات 4.5.2 – 4.5.10 حسب الضرورة للحصول علي الصورة اللاحقة.

تظهر صور برارفيلد التي تظهر التغيرات المورفولوجية لل HMDM استجابه لمحفزات لتمايز الخلايا في الشكل 1. وأظهرت الضامة M1 الاستقطاب من التجارب مع HMDM يتعرض لifnγ و LPS شكل خليه ممدود والمغزل ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (اللوحة الوسطي). النسبة للمقارنة ، فان شكل الضامة M2 الاستقطاب بعد التعرض لل HMDM إلى IL-4 ل 48 h كانت عاده مستديرة ومسطحه ، كما هو مبين من الأسهم السوداء في الشكل 1 (لوحه اليمين المتطرف).

تم تصور قدره الأنماط الظاهرية HMDM المتمايزة للإفراج عن ميتس من خلال التصوير الحي للخلايا الخلوية مع SYTOX الأخضر ، كما هو مبين في الشكل 2. يظهر الشكل 2A بيانات التحكم التي تم الحصول عليها من كل نمط ظاهري لكل hmdm تم احتضانه لمده 24 ساعة في غياب اي محفزات مواليه للالتهابات. في هذه الحالة ، كان هناك تلطيخ الخضراء محدوده جدا ، كما كان متوقعا ، نظرا للخلية التي تهدد طبيعة هذا وصمه عار. وأظهرت الشكل 2B تلطيخ ايجابيه لل ميتس ، الناتجة عن التعرض لل M1 HMDMs إلى الحسين ، ونقدا ، آيل-8 ، أو TNFα. ويشار إلى ميتس من قبل السهام البيضاء ، كما هو مبين الشرائط الخضراء ، والناجمة عن خيوط الحمض النووي خارج الخلية. مع الحسين ، بالاضافه إلى تلطيخ الحمض النووي خارج الخلية ، كان هناك بعض تلطيخ الخضراء واضحة في الخلايا. ولوحظ أيضا هذا تلطيخ الخلوية إلى حد ما مع المحفزات الأخرى ، ويعتقد ان تعكس فقدان سلامه الغشاء الناجمة عن موت الخلايا المستقلة ET نتيجة لظروف العلاج.

ويبين الشكل 2 باء أيضا التجارب المناظرة التي أجريت مع HMDMs M2 ، التي تعرضت ل IL-4. في هذه الحالة ، لم يكن هناك إطلاق الحمض النووي من الخلايا ، كما هو مبين من قبل عدم وجود خيوط/الشرائط من الحمض النووي خارج الخلية. علي الرغم من ذلك ، كان هناك بعض امتصاص الخلوية من صبغه الفلورسنت الخضراء مع الهوكي و TNFα. ولأغراض المقارنة ، يبين الشكل 3 البيانات التمثيلية التي تشير إلى الإفراج عن العقد من الضامة thp-1 المعرضة ل TNFα (50 Ng/mL) لمده 4 ساعات. في هذه الحالة ، تجدر الاشاره إلى انه تم استخدام السكان غير المستقطبة من الخلايا ، وتم التفريق بين البويضات THP-1 إلى الضامة عن طريق المعالجة المسبقة مع نقدا (50 ng/mL ل 72 h) كما هو موضح سابقا22.

الشكل 1: التغيرات المورفولوجية لل HMDMs المستقطبة بصوره مختلفه. الصور التمثيلية برايت من HMDMs غير متمايزة ومتمايزة (ن ≥ 5). تم استزراع HMDMs مع وسائل الاعلام الكاملة التي تحتوي علي المصل البشري و الجلوتامين لمده 8 أيام قبل فتيله إلى M1 أو M2 النمط الظاهري عند التعرض ل IFNγ و LPS أو IL-4 ، علي التوالي ، ل 48 h. شريط مقياس = 200 μm. الأسهم تشير إلى أمثله من الخلايا التي تظهر الخصائص المورفولوجية من M1 أو M2 HMDMs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: ميتس التي تنتجها M1 HMDMs بعد الشعوذة ، ونقدا ، آيل-8 ، وتحفيز TNFα. الصور التمثيلية لل SYTOX الأخضر الملون HMDMs من (ا) غير محفزه M1 و M2 hmdms حضن لمده 24 ساعة في غياب اي محفزات التهابيه كانت تستخدم كعنصر تحكم ، مما يدل علي عدم وجود الإفراج عن الوفاء. (B) تم التعامل مع HMDMs M1 و M2 مع 1) الهراء (200 μM ، 15 دقيقه) ، ونقدا (25 نانومتر) ، أو آيل-8 (50 Ng/ml) مع حضانة لمده 24 ساعة أو 2) TNFα (25 نانوغرام/مل) مع الحضانة ل 6 ح للحث علي الإفراج عن الوفاء. وقد تم تصور ميتس من خلال أضافه الأخضر SYTOX ، كما هو مبين من قبل السهام البيضاء في اللوحة العليا من M1 HMDMs. لم يشاهد اي ميتس في التجارب المناظرة مع HMDMs M2. وتمثل البيانات تكرار الآبار الثقافية من n ≥ 3 المتبرعين الفردية. شريط مقياس = 500 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: ميتس التي تنتجها غير المستقطبة THP-1 الضامة بعد التحفيز TNFα. الصور التمثيلية لل SYTOX الأخضر الملون TNP-1 الضامة ، والتي كانت متمايزة قبل العلاج مع النقد الخاص (50 ng/mL ل 72 h) قبل مزيد من الحضانة لمده 4 ساعات في غياب أو وجود TNFα (50 ng/mL) للحث علي الإفراج التقي. تم تصور ميتس بالاضافه إلى الأخضر SYTOX. البيانات هي ممثله لتكرار الآبار الثقافة من n ≥ 3 التجارب. شريط مقياس = 100 μm. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.