الغرض من هذا البروتوكول هو دمج نوعين مختلفين من الخلايا لإنشاء خلايا مختلطة. يستخدم تحليل المجهر الفلوري للخلايا المنصهرة لتتبع الخلية الاصليه للعضيات الخلوية. يمكن استخدام هذا الفحص لاستكشاف كيفيه استجابه البنية الخلوية والوظيفة للاضطراب بواسطة دمج الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
خلايا خليه الانصهار من الجينوم تحرير خطوط الخلايا لاضطراب الهيكل الخلوي والوظيفة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الحياة مقسمه مكانيا داخل اغشيه الدهن للسماح بالتشكيل المعزول للدول الجزيئية المتميزة داخل الخلايا والأرغن. دمج الخلايا هو دمج خليتين أو أكثر لتشكيل خليه واحده. هنا نقدم بروتوكولا لدمج الخلايا من نوعين مختلفين من الخلايا. يتم إثراء الخلايا الهجينة تنصهر عن طريق الفرز القائم علي التدفق الخلوي ، تليها المجهر الفلوري من بنيه الخلية الهجينة وظيفة. فلوريسسينتلي الموسومة البروتينات المتولدة عن الجينوم التحرير هي الذين تتراوح أعمارهم داخل الخلايا تنصهر ، مما يسمح الهياكل الخلوية ليتم تحديدها علي أساس الانبعاثات فلوري والمشار اليها مره أخرى إلى نوع الخلية من أصل. ويمكن تطبيق هذه الطريقة القوية والعامة علي أنواع مختلفه من الخلايا أو العضيات من الفائدة ، لفهم بنيه الخلوية ووظيفتها عبر مجموعه من المسائل البيولوجية الاساسيه.
المقدمة
الصيانة الساكنة للهيكل الخلوي أمر بالغ الاهميه للحياة. الخلايا لها مورفولوجيس المميزة ، والأرقام العضوية الفرعية الخلوية ، والتركيب البيوكيميائي الداخلي. فهم كيف يتم إنشاء هذه الخصائص الاساسيه وكيف انها تذهب منحرف اثناء المرض يتطلب أدوات مختبريه للاضطراب لهم.
انصهار الخلية هو دمج خليتين منفصلتين أو أكثر. قد يكون الانصهار الخلية الحاسمة لظهور حياه حقيقية النواة1. في جسم الإنسان ، والانصهار الخلية نادره نسبيا ، والتي تحدث خلال الظروف التنموية المقيدة وأنواع الانسجه ، مثل اثناء الإخصاب أو تشكيل العضلات والعظام والمشيمة2. يصف هذا البروتوكول الحث علي دمج خلايا الخلايا في خطوط خلايا ثقافة الانسجه مع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-وسم الخلايا الفلورية التفاضلية
- وضع العلامات الجينية مع CRISPR كاس 9
- استخدام CRISPR كاس 9 الجينوم التحرير إلى العلامة روتليتين (أو غيرها من الجينات الاهتمام) مع البروتينات الفلورية meGFP أو mScarlet في خطوط الخلايا السرطانية البشرية.
ملاحظه: وتغطي البروتوكولات المفصلة لتحرير المجين في مكان آخر24،25،26.
- استخدام CRISPR كاس 9 الجينوم التحرير إلى العلامة روتليتين (أو غيرها من الجينات الاهتمام) مع البروتينات الفلورية meGFP أو mScarlet في خطوط الخلايا السرطانية البشرية.
- وسم الصبغة الفلورية
- تنمو Cal51 الخلايا السرطانية البشرية في المتوسطة دولبيكو النسر المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ مصل البقر الجنين (الدم) ، L-الجلوتامين ، و 100 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الخلايا الموسومة بشكل مناسب مرئية اثناء التدفق الخلوي عن طريق اشاره مضان اعلي من خلايا التحكم غير المسمية (الشكل 2ا). يتم تعيين غيتس لفرز الخلايا الايجابيه المزدوجة ، وإثراء هذا الشعب مباشره في اطباق التصوير لمزيد من التحاليل المجهرية. الخلايا المنصهرة قابله للكشف كخلايا فلوريسسينتليه مزدوجة متميزة وتشكل حوالي ~ 1% من السكان.
الانصهار يحفز أعاده ترتيب العمارة الخلوية الرئيسية من خلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ونحن نظهر بروتوكولا سهل الاستخدام وفعالا من حيث التكلفة لدمج الخلايا وتصور البنية اللاحقة للخلايا الهجينة مع المجهر ، مع أخذ ما يقرب من يومين من البداية إلى النهاية. والأجزاء الهامه من هذا البروتوكول هي إثراء الخلايا المنصهرة حسب فرز الخلايا (القسم 3 من البروتوكول) ، والتحقق الدقيق من الخلايا المنصهرة بواسطة المجهر (القسم 4 من البروتوكول). تضمن هذه الأقسام ان الخلايا المنصهرة يتم الحصول عليها بسهوله وهي غير متجانسة النية. وينبغي التزام بالتركيزات وأوقات الحضانة. علي سبيل المثال ، عند استخدامها في تركيزات اعلي أو مع أوقات.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل زمالة هنري ويلكوم الاستئمانية لR.M. (https://wellcome.ac.uk/grant number 100090/12/Z). ولم يكن لهذا الممول اي دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، واتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو اعدادها. نشكر أشوك فينكيارامان وبول الفرنسية علي المشورة النقدية والتوجيه بشان المشروع. نشكر كيارا كوستيستي وغابرييلا غروندريس-كواربه في معهد كامبردج للبحوث الطبية التدفق الخلوي المرفق للحصول علي دعم ممتاز. نشكر ليام كاسيداي ، توماس ميلر ، وججيانماركو كونتيو لتصحيح المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنبوب 15 مل | Sarstedt | 62554502 | |
| محلول فورمالديهايد 37٪ | Sigma-Aldrich | F8875 | |
| 880 المسح الضوئي بالليزر مجهر Airyscan متحد البؤر | Carl Zeiss | ||
| أطباق التصوير 8 آبار | Ibidi | 80826 | |
| مكافحة GFP الألبكة GFP الداعم الجسم النانوي | Chromotek | gba-488 | |
| BD Influx فارز الخلايا | BD Biosciences | ||
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| مرشحات الخلايا (70 & mu; م) | Biofil | CSS010070 | |
| CellTrace Far Red | ThermoFisher Scientific | C34572 | |
| CellTrace البنفسجي | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، ارتفاع الجلوكوز ، GlutaMAX ، البيروفات | ThermoFisher Scientific | 31966021 | |
| مصل الأبقار الجنيني | سيجما-ألدريتش | 10270-106 | |
| FluoTag-X2 المضادة ل mScarlet-I الألبكة nanobody | NanoTag Biotechnologies | N1302-AT565 | |
| L15 CO2< / sub> وسيط تصوير مستقل | Sigma-Aldrich | 21083027 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | سيجما ألدريتش | 15140122 | |
| الفينول الأحمر الخالي من DMEM ، ارتفاع الجلوكوز | ThermoFisher Scientific | 21063029 | |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) | 8 جم كلوريد الصوديوم ، 0.2 جم كلوريد كلوريد الصوديوم ، 1.44 جم Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 0.24 جم KH2< / sub>HPO4< / sub> ، dH 2< / sub>O حتى 1 لتر | ||
| البولي إيثيلين جلايكول Hybri-Max 1450 | Sigma-Aldrich | P7181 | |
| أنابيب البولي بروبلين | BD Falcon | 352063 | |
| Triton X-100 | Fisher BioReagents | BP151 | خافض للتوتر السطحي غير أيوني |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Tween 20 | Fisher BioReagents | BP337 | منظف غير أيوني |
المراجع
- Lane, N. Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the meaning of life. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2006).
- Brukman, N. G., Uygur, B., Podbilewicz, B., Chernomordik, L. V. How cells fuse. The Journal of Cell Biology. 218 (5), 1436-1451 (2019).
- Köhler, G., Milstein, C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
