1. بوليكبرولاكيوني ثلاثية الكريريلات (PCLTA) التوليف
- الجافة 3.2 مل من 400 Da polycaprolacyone (PCL) الثلاثي بين عشية وضحاها في 50 درجة مئوية في قارورة مفتوحة 200 مل أسفل جولة وK2CO3 في قارورة زجاجية في 90 درجة مئوية.
- اخلط الثلاثي مع 6.4 مل من ديكلوروميثان (DCM) و4.246 غرام من كربونات البوتاسيوم (K2CO3) تحت الأرجون.
- مزيج 2.72 مل من كلوريد الاكريلويل في 27.2 مل من DCM وإضافة dropwise إلى خليط رد فعل في قارورة أكثر من 5 دقائق.
- تغطية خليط التفاعل مع رقائق الألومنيوم وتركها دون عائق في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة تحت الأرجون.
- بعد 24 ساعة، قم بتصفية خليط التفاعل باستخدام ورقة تصفية على قمع Buchner تحت الفراغ لتجاهل الكواشف الزائدة.
- راسب filtrate من الخطوة 1.5 التي تحتوي على البوليمر endcapped في الأثير ديثيل في 1:3 (vol/vol) و rotovape في 30 درجة مئوية لإزالة الأثير ديثيل.
2. تشكيل polybubble
ملاحظة: حقن البوليمر في المياه deionized (DI) من شأنه أن يسبب polybubbles إلى الهجرة إلى الجزء السفلي من القارورة مما أدى إلى أسفل بالارض. استخدام 10٪ (wt/vol) carboxymethyl السليلوز (CMC) ملء الزجاج بدلا من ذلك قارورة لتجنب التسطيح polybubble.
- إعداد 10٪ (wt/ vol) CMC الحل في DI المياه.
- تعبئة 0.92 مل قارورة زجاجية مع 0.8 مل من 10٪ CMC باستخدام أنبوب نقل 1 مل.
- مزيج 1000 ملغ / مل من 14 كيلو Da PCL في DCM وتوليف PCLTA في 1:3 (vol/vol) لمجم 200 ميكرولتر أو إعداد 200 ميكرولتر من 1000 ملغ/مل من 5 كيلو بولي (حمض اللاكتيك المشترك الجليكوليك) diacrylate (PLGADA) في الكلوروفورم.
- مزيج من 2-هيدروكسي-4′-(2-هيدروكسيثوكسي)-2-ميثيل بروبيوفينون (فوتوينيتاتير) مع البوليمر (PLGADA أو PCL/PCLTA) في 0.005:1 (فول/فول).
- تحميل 200 ميكرولتر من خليط البوليمر في حقنة زجاجية 1 مل محمولة على مضخة حقنة متصلة بأنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ الاستغناء مع قطر داخلي 0.016 بوصة.
- استخدام micromotor للسيطرة على الحركة إلى الأمام والخلف من أنبوب البوليمر لحقن البوليمر في 10٪ CMC في الزجاج القارورة لتشكيل polybubble.
- علاج polybubbles تحت الأشعة فوق البنفسجية (UV) في الطول الموجي 254 نانومتر لمدة 60 s في 2 W / cm2.
- فلاش تجميد polybubbles في النيتروجين السائل وlyophilize بين عشية وضحاها في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
- فصل polybubbles من CMC المجففة باستخدام ملقط وغسل polybubbles مع DI المياه لإزالة أي CMC المتبقية. لاحظ أنه يمكن استخدام البوليمرات الأخرى على الأرجح مع تعديلات لتغيير حركية الإطلاق.
3. تعديل من متعدد بوبل قطر
- تعبئة 0.92 مل الزجاج القارورة مع 10٪ CMC باستخدام أنبوب نقل 1 مل.
- خلط PCL/PCLTA في 1:3 (فول / فول) مع 1000mg/mL 14kDa PCL وتوليف PCLTA. اخلطي المُتَرِّف الضوئي مع خليط البوليمر في 0.005:1 (vol/vol).
- قم بتحميل خليط البوليمر في حقنة زجاجية 1 مل مثبتة على مضخة حقنة متصلة بأنبوبة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر داخلي 0.016 بوصة.
- استخدام micromotor للسيطرة على الحركة إلى الأمام والخلف من أنبوب البوليمر لحقن البوليمر في 10٪ CMC في الزجاج القارورة لتشكيل polybubble.
- للحصول على polybubbles بأطر مختلفة ، تختلف معدل الاستغناء من 0.0005 إلى 1 ميكرولتر / س.
- التقاط صور للقارورة مع polybubbles مع قطر متفاوتة.
- استخدام ImageJ لتحديد قطر polybubbles واستخدام حجم القارورة على نطاق.
4. البضائع مركزة داخل polybubble
-
تعديل لزوجة PCL/PCLTA باستخدام K2CO3:
ملاحظة: لا يلزم تعديل لزوجة PLGADA باستخدام K2CO3 لأن لزوجة 5 كيلو اديا PLAGDA في 1000 ملغ/مل كافية لتمركز البضائع.
- أضف K2CO3 (التي تم عزلها بعد تفاعل PCLTA) إلى PCLTA بتركيزات متفاوتة بما في ذلك 0 ملغم/مل، 10 ملغم/مل، 20 ملغ/مل، 40 ملغم/مل، و60 ملغم/مل.
- قياس اللزوجة الديناميكية للحلول عن طريق تغيير معدل القص من 0 إلى 1000 1/s باستخدام اِلتيْر الرحَم.
- حقن البضائع يدويا في الوسط (راجع الخطوة 4.2 لإعداد خليط البضائع) من polybubbles التي تشكلت باستخدام PCL / PCLTA الحلول مع تركيزات مختلفة من2K CO3 (الخطوة 4.1.1). تحديد التركيز الأمثل من K2CO3 من خلال مراقبة الحل الذي من الخطوة 4.1.1 يمكن أن يؤدي إلى الاحتفاظ البضائع في الوسط.
-
توسيط الحمولة (سبق أن أظهرت جدوى مع جزيئات صغيرة) مع CMC
- اخلط الحمولة مع 5٪ (wt/vol) CMC في الدوار بين عشية وضحاها لزيادة لزوجة البضائع.
- يدويا حقن 2 ميكرولتر من خليط البضائع في polybubble والمضي قدما مع الشفاء من الأشعة فوق البنفسجية في الطول الموجي 254 نانومتر لمدة 60 s في 2 W /cm2.
- فلاش تجميد polybubbles في النيتروجين السائل لمدة 30 s وlyophilize بين عشية وضحاها في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
- فصل polybubbles من CMC المجففة باستخدام ملقط وغسلها مع DI المياه لإزالة أي CMC المتبقية.
- قطع polybubble في نصف وصورة النصفين باستخدام المجهر confocal لضمان أن البضائع تركزت (الرجوع إلى الخطوة 6 لالإثارة والانبعاثات الطول الموجي المستخدمة).
5- تركيبات الشحنات
ملاحظة: يمكن أن تضم تركيبة polybubble أنواع مختلفة من البضائع، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة والبروتينات والأحماض النووية.
- استنادا إلى الدراسات السابقة، في حالة البضائع البروتين، واستخدام سواغ بما في ذلك البولي ايثيلين جلايكول (PEG)6، polyvinylpyrrolidone (PVP)، وغليكوبوليكمرات6 لتحسين استقرار البروتين أثناء صياغة polybubble.
- شكل polybubbles استناداً إلى البروتوكول في الخطوة 2.
- تحضير محلول مستضد بإضافة 17.11 غرام من تريهالوس إلى 625 ميكرولتر من فيروس نقص المناعة البشرية gp120/41 مستضد.
- حقن يدويا 1 ميكرولتر من محلول مستضد في منتصف polybubble.
- فتح polybubbles في أيام 0 و 7 و 14 و 21 ، وسجل الفلوريس من المستضد مع الإثارة والانبعاثات الطول الموجي 497 نانومتر و 520 نانومتر ، على التوالي.
- تحديد وظيفة المستضد باستخدام المقايسة المناعية المرتبطة بالانزيم (ELISA) واستخدام الحليب غير الدهني 5٪ كمخزن عازل للحجب.
6 - الإفراج عن البضائع
ملاحظة: يمكن استخدام جزيء صغير أو مستضد كنوع الحمولة
-
جزيء صغير
- احتضان polybubbles مع acriflavine مركز في 400 ميكرولتر من الفوسفات المالحة العازلة (PBS) في 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية لبولي بوببلس PLGADA وعند 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، 70 درجة مئوية لPCL / PCLTA polybubbles.
ملاحظة: السبب الذي ونوصي بإجراء اختبار فوق درجات حرارة الجسم هو أ) محاكاة درجة الحرارة (50 درجة مئوية) التي يصل فيها البولي بوبل أثناء بالليزر على نانورود الذهب (AuNRs) داخل PCL وPLGA. و ب) تسريع عملية التحلل من PCL (50 درجة مئوية، 70 درجة مئوية).
- في كل نقطة زمنية، وجمع سراويل واستبدالها مع 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني جديد.
- استخدام قارئ لوحة لتحديد كثافة الفلوريسنس في عظمى جمعها.
ملاحظة: استخدام ex/em من 416 نانومتر/514 نانومتر ل acriflavine.
-
Antigen
- احتضان polybubbles مع محورها بولفين الألبومين المصل (BSA)-488 في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية لبولي بوببلس PLGADA وعند 37 درجة مئوية، 50 درجة مئوية لPCL / PCLTA polybubbles.
- في كل نقطة زمنية، وجمع عظمى واستبدالها مع 400 μL برنامج تلفزيوني جديد.
- استخدام قارئ لوحة لتحديد كثافة الفلوريسنس في عظمى جمعها. استخدام السابقين / م من 497 نانومتر/520 نانومتر لBSA-488.
ملاحظة: لا ينبغي إجراء دراسة الافراج عند 70 درجة مئوية لبولي بوبل PCL/PCLTA لتجنب تعريض المستضد لدرجة حرارة قصوى.
7- السمية
-
قياس محتوى الكلور في polybubbles باستخدام تحليل تنشيط النيوترون (NAA)
- استخدام polybubbles التي تم lyophilized ل 2، 4، 6، 20، و 24 h لهذه الدراسة في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
- قياس 5-9 ملغ من polybubbles ووضعها على قارورة الإشعاع LDPE.
- إعداد 1000 غرام / مل من محلول معايرة الكلور من المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) - حل المعايرة التي يمكن تتبعها.
- استخدام 1- ميغاوات مفاعل تريغا لتنفيذ الإشعاعات النيوترونية على كل عينة بمعدل فلونس نيوتروني قدره 9.1 ×10 12 /سم2·s ل 600 s.
- نقل polybubbles إلى قنينات غير المشعة.
- استخدم كاشف HPGe للحصول على أطياف أشعة غاما لمدة 500 s بعد فواصل تحلل 360 s.
- استخدام برنامج NAA من قبل كانبيرا للصناعات لتحليل البيانات.
-
تحديد كمية محتوى الكلور الصادر من polybubbles باستخدام NAA
- احتضان polybubbles التي تم التجميل بين عشية وضحاها (في 0.010 مل 0 فراغ في 85 درجة مئوية) في 400 μL من برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية.
- جمع اادفع في الأسابيع 1 و 2 و 3 بعد الحضانة.
- تحليل المواد الفائقة لمحتوى الكلور باستخدام NAA باستخدام نفس الأسلوب كما هو موضح أعلاه في الخطوة 7.1.
8. أو إنر التوليف من قبل كيتلر، S.، وآخرون8
- تحضير محلول البذر AuNR عن طريق خلط 250 ميكرولتر من 10 mM حمض الكلوروواريك (HAuCl4)،7.5 مل من 100 M 100 بروميد التريتيمونيوم (CTAB)، و 600 ميكرولتر من 10 mM الجليد البارد بوروهيدريد (NaBH4).
- تحضير حل النمو عن طريق خلط 40 مل من 100 mM CTAB، 1.7 مل من 10 مل HAuCl4،250 μL من نترات الفضة (AgNO3)،و 270 μL من 17.6 ملغ / مل حمض الاسكوربيك إلى أنبوب.
- مزيج بقوة 420 ميكرولتر من حل البذور مع حل النمو في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. ثم اترك الخليط دون عائق ليتفاعل لمدة 16 ساعة.
- إزالة الكواشف الزائدة من الخليط عن طريق الطرد المركزي في 8000 × غرام لمدة 10 دقيقة والتخلص من supernatant.
9 - إضفاء التحلل من الفلوروفيك على الـ AuNRs من قبل سليمان، و M.G.، وآخرون9
- ضبط درجة حَسّة 1.5 مل من الـ CTAB-استقرت في الـ 10 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم 1 mM (NaOH).
- حرك الحل مع 0.1 مل من 0.3 mM الميثيليد PEG (mPEG) thiol في 400 دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.
- مزيج PEGylated AuNRs مع 0.4 M دوديسيلامين (DDA) في الكلوروفورم في 500 دورة في الدقيقة لمدة 4 أيام.
- Pipet خارج الطبقة العضوية العلوية التي تحتوي على AuNRs hydrophobicized وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام في المستقبل.
10. NIR تفعيل polybubbles
- اخلطي البوليمر (PLGADA أو PCL/PCLTA) مع محلول AuNRs المضروب في 1:9 (vol/vol).
- إضافة الضوئيات إلى البوليمر-أورار خليط في 0.005:1 (vol/vol).
- شكل polybubbles عن طريق حقن خليط البوليمر-أورار في 0.92 مل قارورة زجاجية مع 10٪ CMC (wt/vol) (الرجوع إلى الخطوة 2).
- علاج polybubbles في 254 نانومتر الطول الموجي لمدة 60 s في 2 W / cm2.
- فلاش تجميد في النيتروجين السائل لمدة 30 s وlyophilize بين عشية وضحاها في 0.010 mBar فراغ وعند -85 درجة مئوية.
- فصل polybubbles المجففة باستخدام ملقط وغسلها مع DI المياه لإزالة أي CMC المتبقية.
- احتضان polybubbles في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية.
- تفعيل polybubbles باستخدام 801 نانومتر NIR الليزر في 8A لمدة 5 دقائق كل يوم اثنين والأربى والجمعة.
- اتخاذ الأشعة تحت الحمراء التطلعية (FLIR) صور من polybubble قبل وبعد تنشيط الليزر للحصول على قيم درجة الحرارة.
- حساب الاختلافات في درجة الحرارة بين قبل وبعد تنشيط الليزر على أساس قيم درجة الحرارة من الصور FLIR.