الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

يمثل النسخ مجموعة كاملة من النصوص الحمض النووي الريبي (RNA) التي أعرب عنها جينوم كائن حي في وقت معين وخاصة الظروف البيئية والنمو. كل خلية لها transcriptome الفردية، والتي تعكس حالتها الفسيولوجية والأيضية الحالية. يتم استخدام مجموعة من الخلايا المشتقة من نسيج أو عضو مماثل في دراسة النسخ النموذجية ، ولكن الخلايا المفردة والخلايا المصممة مكانًا هي الحصول على شعبية¹. تبدأ التحليلات الكجنية باستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من نسيج محدد في نقطة زمنية محددة ، وفي ظروف نمو محددة. لهذا الغرض، ونحن نوصي باستخدام طريقة وضعت حديثا لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من عينات عالية في محتوى النشا أو السكر، مثل بذور الحبوب^2. المقارنة بين النسخ بين عينات مختلفة النتائج في تحديد جزيئات الحمض النووي الريبي مع وفرة مختلفة. وتعتبر هذه الجزيئات الحمض النووي الريبي الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs). ويمكن بعد ذلك استخدام وفرة النصوص المستمدة من جينات علامات محددة لتقدير الحالة الإنمائية أو تحديد استجابة الكائن الحي للتقلبات البيئية. الجينات مع عدم وجود تغييرات يمكن الكشف عنها في وفرة النص عبر النقاط الزمنية التنموية قيد الدراسة وغالبا ما تستخدم كمرجع أو جينات التدبير المنزلي.

يتم الكشف عن الحمض النووي الريبي عادة وكميا من قبل أساليب مختلفة، مثل النشاف الشمالي وكمية عكس البلياز تفاعل البوليميراز (qRT-PCR)، ولكن الأساليب الحالية النسخ عالية الإنتاجية تعتمد بشكل كبير على التهجين الحمض النووي باستخدام تكنولوجيا microarray فضلا عن تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq). RNA-Seq تحظى بشعبية كبيرة في الوقت الحاضر لأنه يوفر العديد من المزايا لتطبيقات النسخ عالية الإنتاجية كما استعرضت في مكان آخر^3,4. على الرغم من أن التكنولوجيا القديمة ، والتنميط التعبير الجيني باستخدام رقائق microarray لا تزال تستخدم على نطاق واسع لأنها تكنولوجيا أكثر راسخة ، والتي تتطلب أقل من خلفية في المعلوماتية الحيوية. بالمقارنة مع RNA-Seq ، فإن مجموعات البيانات الناتجة عن تجارب microarray أصغر وأسهل في التحليل. وبالإضافة إلى ذلك، فمن أكثر فعالية من حيث التكلفة، وخاصة إذا كان التعامل مع أعداد كبيرة من العينة. في مختبرنا، نستخدم بشكل روتيني التحليلات النسخة باستخدام تكنولوجيا microarray لتحديد دور المحاور التنظيمية المركزية التي تحكم الشبكات الجزيئية والمسارات المشاركة في نمو وتطوير واستقلاب الحبوب^{5،6،7،8،9.} كما نستخدمها بشكل روتيني لإجراء دراسات توصيف التعبير الجيني على نطاق الجينوم للحصول على فهم ميكانيكي لاستجابة حبوب الحبوب للضغوط اللاأحيائية¹⁰، وكذلك في إجراء الارتباط على نطاق النسخ (TWAS) ودراسات رسم خرائط الروابط لتحديد الجينات المسؤولة عن جودة الحبوب الحبوب والتغذية^11،12. كما استخدمت مجموعات أخرى تكنولوجيا الصفيف الصغير في توفير أطلس التعبير الجيني الخاص بالتنمية في الشعير¹³والأرز^14و15,,و16والذرة الرفيعة¹⁷والقمح^18.

الغرض من هذا المنشور هو تقديم ملخص نصي موجز ووصف مرئي مفصل للطريقة التي نستخدمها حاليًا في مختبرنا للتنميط النسخي لحبوب الحبوب باستخدام منصة Agilent microarray. يرجى ملاحظة أن منصات microarray الأخرى متوفرة، ولكن لن يتم تغطيتها في هذه الطريقة. نبدأ البروتوكول من خلال تقديم وصف مفصل لاستخراج الحمض النووي الريبي من تطوير أو إنبات بذور الحبوب. استنادا إلى تجربتنا، والحصول على نسخة عالية الجودة وكمية عالية قابلة لتحليلات النسخ المصب غالبا ما يكون عنق الزجاجة عند استخدام أنسجة بذور الحبوب. لقد جربنا العديد من مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي المتاحة تجاريًا ، ولكن لم يقدم أي منها نتائج مرضية. ومن ثم، قمنا بتطوير بروتوكول استخراج كيميائي للحصول على مستخلص الحمض النووي الريبي الخام الذي يخضع بعد ذلك لتنقية الأعمدة باستخدام مجموعة متاحة تجاريا. باستخدام هذه الطريقة، ونحن بشكل روتيني واستنساخ الحصول على جودة عالية الحمض النووي الريبي² (الشكل 1)،والتي يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مختلفة لتوليد ملف تعريف transcriptome.

1. مجموع استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية

ملاحظة: العمل دائما تحت غطاء الدخان لأن هذه الطريقة تنطوي على استخدام المذيبات العضوية المتطايرة الضارة. قبل الدفء أنبوب microfuge من المياه خالية nuclease في كتلة الحرارة 50 درجة مئوية قبل بدء التجربة. سيتم استخدام هذه المياه الخالية من nuclease لتميّل إجمالي الحمض النووي الريبي من عمود الدوران في الخطوة 1.8.

1. الأرض بشكل منفصل العينات، مع كل ما لا يقل عن ثلاثة يكرر البيولوجية، في مسحوق ناعم باستخدام هاون معقم والحشرات التي يتم تبريدها مسبقا في النيتروجين السائل.
   1. اغرف العينات المجففة باستخدام ملعقة معدنية صغيرة مغموسة في النيتروجين السائل ووضع العينات المجففة في أنابيب الميكروفوغ الخالية من النوكل 2.0 مل، كما تم غمسها مسبقًا في النيتروجين السائل. تخزين العينات على الفور في الفريزر درجة حرارة منخفضة جدا (-80 درجة مئوية) حتى اليوم المخصص لاستخراج الحمض النووي الريبي دفعة (STOP POINT).
      ملاحظة: عينات البذور يمكن أن تكون الأرض إلى مسحوق ناعم مع أو بدون dehusking. بالنسبة للأرز ، نقوم بطحن العينات بشكل روتيني دون إزالة القشور لأن القشرة تحتوي على السيليكا التي يمكن أن تساعد أثناء عملية الطحن.
      تنبيه: يجب أن تتم هذه الخطوة بسرعة وفي ظل ظروف التبريد بدقة. أحد الخيارات للأتمتة هو طحن العينات باستخدام طاحونة كرة مبردة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي وتدهور الجودة.
2. الحصول على استخراج الحمض النووي الريبي الخام باستخدام ما يقرب من 200 ملغ من العينة مسحوق الأصلي. إضافة كل عينة على حدة إلى أنبوب microfuge خالية من nuclease تحتوي على 750 ميكرولتر من المحمية استخراج الحمض النووي الريبي (100 mM Tris، درجة الحموضة 8.0، 150 mM LiCl، 50 mM EDTA، 1.5٪ SDS، 1.5٪ 2-mercaptoethanol) و 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: isoamyl (25:24:1).
   1. اخلط يُمزج جميع العينات في نفس الوقت لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام خلاط دوامة متعدد الأنابيب تم تعيينه بسرعة عالية. على الفور إبقاء جميع الأنابيب على الجليد لمدة دقيقتين.
      تنبيه: العمل دائما داخل غطاء الدخان، وخاصة بالنسبة لجميع الخطوات التي تنطوي على الفينول، الكلوروفورم والمذيبات العضوية الأخرى. من الناحية المثالية، استخدم غطاء محرك السيارة الأبخرة واسعة التي يمكن أن تستوعب جهاز طرد مركزي واحد benchtop، خلاط دوامة، خلاط دوامة متعددة أنبوب، ومتعددة أنبوب خلاط دوارة.
3. فصل استخراج الحمض النووي الريبي الخام من الحطام عن طريق الطرد المركزي في 14،000 × ز لمدة 10 دقيقة. قم بكافة خطوات الطرد المركزي في نفس الإعدادات لهذا القسم.
   1. نقل ما يقرب من 800 ميكرولتر من supernatant إلى أنبوب ميكروفوغ جديد 2.0 مل يحتوي على 400 ميكرولتر من 1.2 M NaCl و 700 ميكرولتر من الإيزوبروبانول. خلط الحل بلطف عن طريق عكس 5x.
   2. عجل ونا عن طريق احتضان في العادية (-20 درجة مئوية) أو الفريزر درجة حرارة منخفضة جدا (-80 درجة مئوية)، لمدة ساعة واحدة على الأقل (أو بين عشية وضحاها).
      توقف أو نقطة توقف: مجرد الحفاظ على العينات في العادية -20 درجة مئوية الفريزر لوقف لبضع ساعات. لليلة واحدة أو نقطة توقف أطول، وتخزين العينات في الثلاجة درجة حرارة منخفضة جدا (-80 درجة مئوية).
4. الحصول على بيليه الحمض النووي الريبي الخام عن طريق الطرد المركزي في 18800 × ز لمدة 15 دقيقة. بعد التخلص من supernatant ، وتنقية بيليه RNA الخام عن طريق تنقية العمود باستخدام مجموعة صغيرة(جدول المواد).
   1. حل بيليه في إعداد هاب 450 μL من RLT المخزن المؤقت (قبل الاستخدام، إضافة 100 ميكرولتر من α-mercaptoethanol لكل 100 مل من المخزن المؤقت RLT، أعدت يوميا الطازجة). تعزيز حل جميع الكريات عن طريق خلط جميع الأنابيب في درجة حرارة الغرفة في خلاط دوامة متعددة أنبوب لمدة 5 دقيقة على الأقل.
5. تنقية بيليه الحمض النووي الريبي المذاب عن طريق المرور عبر العمود تدور مصغرة الأرجواني مع أنبوب جمع 2 مل. الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة في 9000 × ز والتخلص من العمود الدوران المصغرة الأرجواني.
   1. أضف 0.5 حجم الإيثانول المطلق (~ 225 ميكرولتر) إلى الليسات المنقّفة في أنبوب جمع 2 مل. خلط الحل باستخدام نفس تلميح من البلاستيك عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات.
6. جمع الحمض النووي الريبي النقي عن طريق نقل فورا الحل إلى عمود تدور صغيرة وردي مع أنبوب جمع 2 مل. الطرد المركزي في 9000 × ز ل15 s لجمع الحمض النووي الريبي على غشاء السيليكا من العمود تدور دقيقة الوردي. تجاهل تدفق من خلال وغسل الحمض النووي الريبي مع 350 ميكرولتر من RW1 المخزن المؤقت عن طريق الطرد المركزي في 9000 × ز ل15 s.
7. إزالة الحمض النووي الجينومي الملوث بإضافة 80 ميكرولتر من DNase المخفف 1 (50 ميكرولتر من مخزون DNase المجمد + 350 ميكرولتر من RDD باستخدام مجموعة DNase) مباشرة على الغشاء والهضم عن طريق الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل (PAUSE POINT).
   1. اغسل DNase 1 بإضافة 350 ميكرولتر من RW1 والغزل لأسفل عند 9000 × ز لـ 15 s. كرر مرتين ، ولكن هذه المرة اغسل 500 ميكرولتر من RPE المخزن المؤقت. نقل إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة وتدور في 9,000 × ز لمدة 2 دقيقة لتجف.
8. نقل عمود الدوران المجفف إلى أنبوب جمع جديد خالٍ من الـ nuclease بـ 1.5 مل. ابدأ عملية elution لاستخراج الحمض النووي الريبي النقي بإضافة 50 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease (الدفء المسبق عند 50 درجة مئوية) واحتضان لمدة 3 دقيقة عند كتلة حرارة 50 درجة مئوية.
   1. بعد الحضانة، نلث مجموع استخراج الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي في 9،000 × ز لمدة 1 دقيقة. وضع فورا جميع العينات على الجليد.
9. تحديد كمية ونوعية مجموع استخراج الحمض النووي الريبي عن طريق تشغيل التخفيفات المناسبة (عادة 1:10) في Nanodrop وBioAnalyzer باستخدام بروتوكولات الشركة المصنعة الخاصة بكل منهما. وينبغي أن تكون قيمة مستخلصات الحمض النووي الريبي على الأقل 8.0 وتركيز قدره 50 نانوغرام/ميكرولتر. ويبين الشكل 1 نتيجة نموذجية لمستخلصات الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها من أوراق الشعير والبذور.
   نقطة التوقف: تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. cDNA توليف تليها cRNA النسخ ووضع العلامات

ملاحظة: هذه الخطوة مناسبة لمعالجة 24 عينات في وقت واحد. ويقترح أن تتم الخطوة بأكملها بشكل مستمر في يوم واحد، ولكن يتم تحديد نقاط التوقف والإيقاف الاختياريالاختياري. تأكد من الدفء المسبق لثلاثة كتل حرارة أنبوب microfuge في 80 درجة مئوية، 65 درجة مئوية، و 37 درجة مئوية قبل البدء في الخطوات أدناه. سيتم تغيير إعدادات درجة الحرارة هذه كما هو موضح في الخطوات التالية. على سبيل المثال، سيتم تعيين كتلة الحرارة 37 درجة مئوية إلى 40 درجة مئوية بعد إعداد ميكس سبايك (أو إذا كان قد تم إعداده مسبقا). إعداد لون واحد سبايك ميكس، T7 المروج ميكس ومزيج سيد هدنا باستخدام منخفضة الإدخال السريع Amp التعبير مجموعة (انظر جدول المواد)استنادا إلى تعليمات الشركة المصنعة. هذا التحضير يعتمد على كمية من بدء مقتطفات الحمض النووي الريبي, التي تتراوح عادة من 10 إلى 200 نانوغرام لمجموع الحمض النووي الريبي أو 5 نانوغرام لPOLYA RNA. نحن نستخدم بشكل روتيني 50 نانوغرام مجموع الحمض النووي الريبي كمادة البداية للتهجين microarray² وللطريقة التي سيتم وصفها أدناه. في إعداد مزيج رئيسي لعينات 24، إضافة 2 ردود فعل إضافية لحساب الاختلافات pipetting. دائما استخدام أنابيب الميكروفوج خالية من nuclease والمياه خالية من nuclease في هذه الخطوة.

1. بسبب ارتفاع العائد، وعادة ما تمييع استخراج الحمض النووي الريبي 100 أضعاف لتناسب ضمن نطاق 50-100 نانوغرام. استناداً إلى نتائج التقدير الكمي الحمض النووي الريبي في الخطوة 1.9، وجعل تخفيف 1:100 عن طريق إضافة 1 μL من استخراج الحمض النووي الريبي النقي إلى 99 ميكرولتر من المياه خالية من nuclease في أنبوب ميكروفوغ 1.5 مل. تحديد التركيز الفعلي لهذا التخفيف باستخدام Nanodrop.
   1. جعل تخفيف الثاني من كل عينة الحمض النووي الريبي الكلي في 1.5 مل أنبوب microfuge لجعل 50 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي في حجم النهائي من 1.5 μL. الحفاظ على جميع العينات على الجليد.
2. إعداد ميكس سبايك من استنادا ً إلى تعليمات الشركة المصنعة. وتتلخص هذه الخطوة أيضا في Püffeld وآخرون 2019². استخدام كتلة الحرارة 37 درجة مئوية لهذا الغرض. تخزين تخفيف الأول والثاني من ارتفاع لون واحد مزيج الضوابط الإيجابية في ثلاجة درجة حرارة منخفضة جدا (-80 درجة مئوية) وتذهب فقط من خلال ثماني دورات تجميد / ذوبان المتكررة.
   1. إعداد التخفيف الثالث والرابع الطازجة يوميا. تذوب وتخزين التخفيف الثالث والرابع من مزيج ارتفاع على الجليد قبل الاستخدام.
      ملاحظة: تحويل درجة حرارة كتلة الحرارة 37 درجة مئوية إلى 40 درجة مئوية عندما تم إعداد ميكس سبايك (أو إذا تم إعداده مسبقًا).
3. إعداد T7 المروج ميكس وتخزينها على الجليد قبل الاستخدام. ما يلي يكفي ل24 عينة:
   20.8 ميكرولتر من التمهيدي المروج T7
   + 26.0 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكليس
   = 46.8 ميكرولتر من الحجم الإجمالي T7 مزيج المروج
4. أضف 1.8 ميكرولتر من T7 المروج التمهيدي ميكس (الخطوة 2.3) في كل أنبوب ميكروفوغ يحتوي على 1.5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي 50 نانوغرام من الخطوة 2.1. خلط المكونات بشكل صحيح عن طريق الأنابيب عدة مرات. تشويه مزيج قالب الحمض النووي الريبي التمهيدي عن طريق احتضان في كتلة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. وضع أنابيب الميكروفوغ على الجليد على الفور استعدادا للخطوة التالية.
5. في حين denaturing مزيج قالب التمهيدي (الخطوة 2.4) ، ما قبل الحارة 5x أول ستراند المخزن المؤقت في 80 درجة مئوية لمدة 4 دقيقة على الأقل. إعداد بسرعة cDNA توليف ماجستير ميكس من مجموعة الطرح السريع منخفضة الوسم أمبير (انظر جدول المواد)استنادا إلى تعليمات الشركة المصنعة. ما يلي يكفي لردود الفعل 24:
   52.0 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x ستراند الأول الدافئ مسبقًا (الخطوة 2.5)
   + 26.0 ميكرولتر من 0.1M DTT
   + 13.0 ميكرولتر من مزيج dNTP 10 mM
   + 31.2 ميكرولتر من مزيج كتلة RNase
   = 122.2 ميكرولتر من إجمالي حجم cDNA توليف ماجستير ميكس
   1. إذابة كل مكون على الجليد. مزيج كل مكون عن طريق الأنابيب لطيف. احتفظ بمزيج Master Mix في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
      تنبيه: يجب وضع مزيج كتلة RNase على الفور مرة أخرى في الفريزر -20 درجة مئوية بعد الاستخدام.
6. قم بإزالة مزيج قالب الـ RNA على الجليد (الخطوة 2.4) والطرد المركزي لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة لتدوير جميع المحتويات إلى أسفل أنبوب الميكروفوج. الاستغناء عن 4.7 ميكرولتر من مزيج سيد هدنا (الخطوة 2.5) إلى كل أنبوب، وخلط بعناية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. يجب أن يكون الحجم الإجمالي عند إضافة كافة المكونات 8.0 ميكرولتر.
   1. توليف cDNA لمدة 2 ساعة في كتلة الحرارة 40 درجة مئوية. خلال الحضانة 2 ح، وتحويل درجة حرارة كتلة الحرارة 65 درجة مئوية إلى 70 درجة مئوية استعدادا لتعطيل الحرارة (الخطوة 2.7).
      نقطة التوقف الاختيارية: تخزين العينات في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها. يمكن مواصلة التجربة في اليوم التالي بعد تعطيل الحرارة (الخطوة 2.7).
7. احتضان كل أنبوب في كتلة الحرارة 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتنشيط الحرارة ميكس كتلة RNase. نقل الأنابيب على الجليد على الفور واحتضان لمدة لا تقل عن 5 دقيقة.
8. في حين أن العينات على الجليد لمدة 5 دقيقة (الخطوة 2.7) ، قم بإعداد مزيج النسخ الرئيسي بسرعة. يمكن الجمع بين جميع المكونات في درجة حرارة الغرفة ولكن مكونات الذوبان على الجليد. ما يلي يكفي ل24 عينة:
   19.5 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكليس
   + 83.2 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5x النسخ
   + 15.6 ميكرولتر من 0.1M DTT
   + 26.0 ميكرولتر من مزيج NTP
   + 5.5 ميكرولتر من مزيج T7 RNA Polymerase
   + 6.2 ميكرولتر من السيانين 3-CTP (Cy3)
   = 156.0 ميكرولتر من إجمالي حجم النسخ الرئيسي ميكس
   تنبيه: يجب الاحتفاظ بمزيج T7 RNA Polymerase في الفريزر -20 درجة مئوية ووضعه مرة أخرى مباشرة بعد الاستخدام. وعلاوة على ذلك، Cy3 حساسة للضوء. وبالتالي، ينبغي أن يتم الخلط (الخطوة 2.9) والاستغناء (الخطوة 2.10) في ظروف الإضاءة المنخفضة. لهذا، عادة ما نطفئ أي ضوء مباشرة فوق مقعد المختبر.
9. كما تعرضت أنابيب للتدفئة والتبريد المفاجئ (الخطوة 2.7)، تدور لفترة وجيزة أسفل محتويات كل عينة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لجمع كل السائل في الجزء السفلي من كل أنبوب microfuge. أضف 6 ميكرولتر من النسخ الرئيسي ميكس (الخطوة 2.8) عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. وينبغي أن يكون الحجم الإجمالي لرد الفعل هذا 16 ميكرولتر في هذه المرحلة. احتضان الأنابيب في 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتوليد CRNA Cy3 المسمى.
   نقطة التوقف الاختيارية: يمكن تخزين الأنابيب عند -80 درجة مئوية بعد النسخ.
10. أثناء توليد cRNA (الخطوة 2.9) ، قم بتعيين درجة حرارة الكتلة الحرارية إلى 55 درجة مئوية. إضافة أنبوب واحد على الأقل microfuge من المياه خالية من nuclease في كتلة الحرارة. سيتم استخدام هذه المياه الخالية من nuclease لelution من cRNA النقي.
11. بعد نسخ cRNA ووضع العلامات، وتنقية cRNA وصفت باستخدام RNeasy ميني كيت كما هو مفصل في الخطوة 3.

3. تنقية كرنا

1. تنقية cRNA وصفت باستخدام مجموعة صغيرة RNeasy (انظر جدول المواد). إعداد المخازن المؤقتة استناداً إلى إرشادات الشركة المصنعة. على سبيل المثال، يتم توفير RPE المخزن المؤقت في المجموعة في شكل مركز. قبل الاستخدام، إضافة 4 مجلدات من البيولوجيا الجزيئية الصف الإيثانول المطلق (96-100٪).
2. أضف 84 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكليس إلى كل عينة لضبط الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر. ثم أضف 350 ميكرولتر من RLT المخزن المؤقت و 250 ميكرولتر من الإيثانول المطلق إلى كل أنبوب. مزيج شامل عن طريق الأنابيب.
3. نقل 700 ميكرولتر من كل خليط على عمود تدور مصغرة مع أنبوب جمع 2 مل. جمع cRNA الموسومة على الغشاء عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 30 ق في 7534 × ز. تخلص من السائل المتدفق.
4. اغسل كل عينة في 500 ميكرولتر من RPE المخزن المؤقت. الطرد المركزي والتخلص من التدفق من خلال كما في الخطوة السابقة. كرر هذه الخطوة مرة واحدة، ثم انتقل إلى الخطوة التالية.
5. نقل عمود الدوران المصغر إلى أنبوب تجميع جديد. تجفيف العينات عن طريق الطرد المركزي كما هو الحال في الخطوة 3.3.
6. نقل العمود تدور مصغرة في أنبوب microfuge خالية من nuclease 1.5 مل التي يتم توفيرها مع عدة. تم يلوط كل عينة cRNA الموسومة بإضافة 30 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease (التي تم تسخينها مسبقًا عند 55 درجة مئوية) مباشرة في فلتر الغشاء. تعزيز elution عن طريق احتضان في كتلة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 60 s.
7. جمع cRNA الموسومة عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 s في 7535 × ز. تجاهل العمود تدور وإغلاق كل أنبوب microfuge. وضع فورا كل أنبوب على الجليد.
   نقطة التوقف الاختيارية: يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية بعد elution.
8. قياس cRNA مع Nanodrop باستخدام ميزة microarray. تعيين العينة إلى RNA-40. الحصول على القيم التالية وسجل في جدول البيانات: السيمنين 3 تركيز صبغ (pmol/μL)، نسبة امتصاص الحمض النووي الريبي (260 نانومتر/280 نانومتر)، وتركيز كرنا (نانوغرام/ميكرولتر).
   نقطة التوقف: تخزين فورا عينات cRNA في -80 درجة مئوية بعد القراءة.
9. حساب العائد cRNA والنشاط المحدد كما هو مفصل في Püffeld وآخرون 2019².

4. التهجين Microarray والمسح الضوئي

ملاحظة: هذه الخطوة يأخذ فقط 3-4 ساعة وبالتالي يمكن أن تبدأ التهجين من 24 عينات بعد الغداء. يمكن لمشغّل واحد تشغيل ما يصل إلى 4 شرائح بشكل مريح (32 عينة). يتم تخصيص صباح اليوم التالي لغسل ومسح الشرائح microarray. ويمكن بعد ذلك تنفيذ أشواط إضافية في فترة ما بعد الظهر من اليوم الثاني. يتم تكرار هذه الخطوة حتى يتم تهجين كافة العينات ومسحها ضوئياً. يوصى بشدة باستخدام قفازات اللاتكس الخالية من الألوان والخالية من المسحوق للتعامل مع الشرائح ومعالجتها لضمان عدم تلوث العينات بالأصباغ الملونة التي يمكن أن تتداخل مع تحليلات microarray. وبصرف النظر عن microarrays المتاحة تجاريا، تم تصميم الصفائف المخصصة التالية من قبل مجموعتنا ومتاحة لأجل من Agilent: رمز النظام 028827 للشعير(Hordeumvulgare)،054269 للأرز(أوريساتيفا الغواصات. جابونيكا)،054270 للأرز(Oryzasativa subs. Indica)و 048923 للقمح(Triticumaestivum).

1. تنفيذ التهجين microarray باستخدام مجموعة التهجين التعبير الجيني (انظر جدول المواد). إعداد عامل حظر 10x وفقا لمواصفات الشركة المصنعة^2. Aliquot عامل حظر 10x إلى 200 μL أجزاء وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. كل aliquot يكفي لما يصل إلى 40 التهجين ومستقر حتى شهرين.
2. في اليوم المخصص للتهجين microarray، تذوب واحدة 200 μL aliquot من عامل حظر 10x على الجليد. بالإضافة إلى ذلك ، ما قبل تسخين فرن التهجين إلى 65 درجة مئوية وتسخين كتلة الحرارة مسبقًا إلى 60 درجة مئوية للاستخدام أثناء تفتيت cRNA.
3. إعداد مزيج التجزئة لكل عينة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة². في مختبرنا، نستخدم بشكل روتيني 600 نانوغرام من cRNA المسمى Cy3 بشكل خطي للتهجين في مجموعة صغيرة من 8 حزم. في هذه الحالة، تلخص القائمة أدناه مكونات مزيج التجزئة لكل عينة:
   600 نانوغرام من كرنا مضخمة خطيا، السيانين 3 المسمى
   + 5 ميكرولتر من عامل حظر 10x
   ضبط مستوى الصوت إلى 24 ميكرولتر مع المياه الخالية من nuclease
   + 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت 25x التجزئة
   = 25 ميكرولتر من إجمالي مزيج التجزئة الحجم
   1. خلط العينات بلطف باستخدام خلاط دوامة. قم بتدوير جميع العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير.
4. احتضان جميع العينات في كتلة الحرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بالضبط. تبرد على الفور كل أنبوب على الجليد لمدة دقيقة واحدة ثم انتقل بسرعة إلى الخطوة التالية.
5. لوقف رد فعل التجزئة بشكل كامل، أضف 2x GEx Hybridization Buffer HI-RPM إلى كل أنبوب. مزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا، مع الحرص الشديد على عدم إدخال أي فقاعات أثناء الاختلاط. نحن نستخدم بشكل روتيني 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت التهجين لوقف تفاعل التجزئة لتنسيق microarray 8 حزمة.
6. الطرد المركزي جميع الأنابيب لمدة دقيقة واحدة في 15750 × ز في درجة حرارة الغرفة المحيطة. وضع بسرعة جميع الأنابيب على الجليد وتحميل كل عينة في أسرع وقت ممكن.
7. قبل مغادرة المختبر لحضانة 17 ساعة بين عشية وضحاها، وإعداد الجمعية التهجين² كما هو مفصل في الفيديو.
   1. خطوة حرجة: نقل كل مزيج التهجين والاستغناء ببطء في وسط كل حشية جيدا، ومراقبة عناية كبيرة بعدم إدخال أي فقاعات أثناء الاستغناء. نحن نستخدم بشكل روتيني 44 ميكرولتر من مزيج التهجين لتنسيق microarray 8 حزمة. ضع أيضًا 44 ميكرولتر من 1x التهجين المؤقت في أي آبار غير مستخدمة.
   2. وضع على الفور شريحة microarray مع الاتجاه الصحيح على رأس الشريحة طوقا. هذا يحتاج إلى القيام به بعناية فائقة من أجل عدم تسرب أي سائل. إغلاق الجمعية التهجين بإحكام وتدويرها للتحقق مما إذا لم يتم إدخال فقاعات الهواء الدائمة. يجب أن تتحرك جميع الفقاعات داخل شريحة الحشية.
8. وضع الجمعية غرفة التهجين في دوار فرن التهجين. إذا كان استخدام المخزن المؤقت التهجين GEx 2x، تعيين سرعة الدوران إلى 10 دورة في الدقيقة والهجينة في 65 درجة مئوية لبالضبط 17 ساعة.
9. غسل microarrays الهجينة باستخدام جين التعبير غسل مجموعة عازلة (انظر جدول المواد). إعداد الجين التعبير غسل المخازن المؤقتة 1 و 2 استنادا إلى تعليمات الشركة المصنعة². إضافة 2 مل من 10٪ تريتون X-102 إلى كل من المخازن المؤقتة (اختياري بحتولكن ينصح بشدة للحد من حدوث القطع الأثرية غسل microarray)².
10. إعداد ثلاثة تجمعات غرفة غسيل كما هو مفصل في المنشور السابق². يتم جدولة تفاصيل كل غرفة غسيل أدناه(الجدول 1).
11. Aliquot 500 مل من الغسيل المخزن المؤقت 1 في زجاجة كاشف 1 L ويترك في درجة حرارة الغرفة المحيطة. إعداد زجاجة كاشف 1 L إضافية والتسمية مع "غسل المخزن المؤقت 1 إعادة استخدام" لحفظ المخزن المؤقت غسل من الغرفة الأولى. بالإضافة إلى ذلك، aliquot 500 مل من الغسيل المخزن المؤقت 2 في زجاجة كاشف واحتضان في حمام مياه 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: لا تغادر المختبر دون إعداد الخطوات 4.9 إلى 4.11. وهي ضرورية لخطوات الغسيل في اليوم التالي.
12. في اليوم التالي، قم بإعداد مخازن الغسيل كما هو مفصل في الجدول 2. ملء كل طبق إلى ثلاثة أرباع المخزن المؤقت المقابلة لها. كل مخزن مؤقت للغسيل جيد لما يصل إلى 4-5 شرائح.
13. بعد بالضبط 17 ح من التهجين، والحصول على غرفة واحدة التهجين وتفكيك على مقاعد البدلاء مختبر اصطف مع ورقة خالية من الوبر كما هو مفصل في المنشور السابق².
    1. خطوة حرجة: نقل شطيرة microarray إلى الطبق 1. تأكد من أن الباركود microarray تواجه في وضع مائل، وتجنب غمر الشريحة بأكملها في المخزن المؤقت. التعامل مع كل شريحة microarray من نهاياتها وتجنب لمس الجانب النشط من الشريحة.
    2. فصل الشرائح الزجاجية اثنين باستخدام ملقط². اسمحوا الشريحة طوقا قطرة بلطف في الجزء السفلي من الطبق 1، وفي الوقت نفسه ضمان أن يتم عقد الشريحة microarray بحزم للخطوة التالية.
14. الخطوة الحرجة: رفع ببطء الشرائح microarray جانبية ونقل على الفور إلى رف microarray في طبق 2 كما هو مفصل في المنشور السابق². من الأهمية بمكان أن الشرائح microarray معرضة الحد الأدنى للهواء.
    1. كرر الخطوتين 4.13 و 4.14 حتى تكون الشرائح الثمانية في الحامل. توزيع الشرائح microarray بالتساوي على طول الرف. يمكن القيام بهذه الخطوة من قبل عامل تشغيل واحد دون مساعدة لما يصل إلى 4 شرائح. إرفاق حامل الحامل ونقل كامل إعداد طبق 2 إلى التحريك المغناطيسي الأول. يُحرّك المزيج برفق لمدّة دقيقة واحدة بالضبط.
15. أثناء التحريك لمدة دقيقة واحدة (الخطوة 4.14)، نقل الطبق 3 من حاضنة صغيرة 37 درجة مئوية ووضعها على رأس الستير المغناطيسي الثاني. ضع بلطف Wash Buffer 2 (من حمام الماء 37 درجة مئوية) على الطبق 3. تجنب تشكيل فقاعة أثناء صب.
    1. بعد 1 دقيقة يتم التحريك (الخطوة 4.14)، بلطف وببطء رفع رف الشريحة من طبق 2 ونقل إلى الطبق 3. إزالة حامل الحامل ويحرك لمدة دقيقة واحدة بالضبط.
16. رفع ببطء وبلطف رف الشريحة من الطبق 3. تأكد من تجنب تشكيل قطرات عازلة². قم بتجفيف جانبي كل شريحة عن طريق اللمس بلطف على الورق الخالي من الوبر. ضع كل شريحة مجففة في مربع شريحة وكرر الخطوة 4.16 حتى تكون جميع شرائح microarray في مربع الشريحة. جاف لمدة 15 دقيقة تقريبًا.
    نقطة إيقاف اختيارية
17. ضع كل شريحة ميكروفير في حامل شريحة، مما يضمن أن الباركود يواجه لأعلى.
    ملاحظة: يجب أن تكون مستويات الأوزون داخل غرفة المساحة الدقيقة 50 جزء في المليار (100 ميكروغرام/م³⁾أو أقل. وهذا أمر اختياري محض ولكن يوصى به بشدة: استخدام غطاء شريحة حاجز الأوزون لتجنب تدهور الأصباغ السيانينية الناجم عن الأوزون.
18. ضع أصحاب الشرائح المجمعة في دائري المسح الضوئي. تحميل العينات في تسلسل، استنادا ً إلى رقم الباركود. مسح الشرائح على الفور باستخدام الماسح الضوئي microarray (انظر جدول المواد)، كما هو مفصل في المنشور السابق².
19. بعد التشغيل، قم بإخضاع البيانات لميزة الاستخراج والتحقق من صحة مراقبة الجودة، كما هو مفصل في المنشور السابق².

تم تحسين هذه الطريقة لاستخراج عينات بذور الحبوب التي تحتوي على كميات كبيرة من النشا الملوث أو السكريات. وهي مصممة لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي من 24 عينات البذور يوميا. وينبغي أن تجرى باستمرار في يوم واحد، ولكن يتم تحديد نقاط التوقف والإيقاف الاختياري الاختياري ة في جميع أنحاء البروتوكول. بدلا ً من ذلك ، يمكن للقارئ استخدام مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي المفضلة لديهم أو طريقة الاستخراج الكيميائي اليدوي. ومع ذلك ، استنادا إلى خبرتنا السابقة ، المتاحة تجاريا مصنع مجموعات استخراج الحمض النووي الريبي ليست مناسبة للبذور بسبب كميات كبيرة من النشا والبروتينات والسكر و / أو التلوث بالدهون. في الطريقة الموصوفة ، يتبع الاستخراج الكيميائي للرنا الخام تنقية الأعمدة باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي التجارية. وهذا يوفر عادة الجيش الملكي النيبالي مع أعلى جودة والعائد. يوضح الشكل 1 نتيجة تشغيل BioAnalyzer لاختبار جودة استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام الطريقة الموضحة هنا. يتم تقديم النتائج لأوراق الشعير (عينات 1 و 2 تمثل عينات منخفضة محتوى النشا) وبذور الشعير (عينتين 3 و 4 تمثل عينات عالية من محتوى النشا). قيمة تكامل الحمض النووي الريبي (RIN) لكافة العينات هي 10.

ويبين الشكل 1 هلام تمثيلي من استخراج الحمض النووي الريبي النقي، حيث تم اختبار الجودة باستخدام محلل حيوي. العينات 1 و 2 هي النتائج النموذجية لعينات محتوى النشا منخفضة مثل أوراق الشعير، حيث أشرطة rRNA إضافية من الكلوروبلاست واضحة. العينات 3 و 4 هي نتائج تمثيلية لعينات محتوى النشا عالية مثل بذور الشعير، وتبين 18S و 28S rRNA. يرجى ملاحظة أنه لا يمكن حساب قيمة RIN الآلية لأنسجة النبات الأخضر مثل عينات الأوراق، وذلك بسبب كرنا الكلوروبلاست. ومع ذلك ، يمكن التأكد من النزاهة والجودة العالية بصريًا من خلال عدم وجود أي منتجات تدهور ، والتي تظهر عادة على أنها مسحة جزيئية منخفضة. قيمة RIN لعينات البذور عالية النشا مثل بذور الشعير عادة 10 باستخدام البروتوكول الموصوف في هذه الورقة.

وبالإضافة إلى ذلك، ونحن نقدم هنا أيضا بيانات تمثيلية لتجربة دورة زمنية من اثنين من الخطوط الأصيلة الشعير النخبة (صوفيا وفيكتوريانا) تستخدم لتحليل نوعية الشعير19. خلال عملية الشعاع، يتم تحويل النشا إلى سكر. لذلك ، تمثل العينات الأنسجة ذات النسب المختلفة من النشا ومحتويات السكر. وبما أن عملية التشعير الصناعي تشبه عملية الإنبات، فقد تم تحليل نسخ خطين من خطوط الشعير، تختلف في جودتها في التشعير. تم استخراج الحمض النووي الريبي من بذور الإنبات في 2 و 24 و 48 و 72 و 120 و 144 و 196 ساعة بعد التشبيب في ثلاثيات الأحيان البيولوجية. تم تنفيذ إعداد الحمض النووي الريبي وتهجين لرقاقة ميكرور الشعير المخصصة على النحو المبين أعلاه. يشير الشكل 2 إلى الشبكة العادية التي تمت قراءتها من التهجين الميكروي الوارد في تقرير مراقبة الجودة(الشكل 3)ومخطط الرسم البياني للإشارات المكتشفة. الشبكة تعطي مثالا على الإشارات المشتقة من كل ركن من أركان الشريحة، بما في ذلك الخلفية وسبايك في قراءة النقاط المستخدمة للمعايرة. يشير الرسم البياني إلى انحراف النقاط القابلة للكشف مع كثافة الإشارة ذات الصلة. التهجين الناجح يعطي منحنى واسع على شكل غاوسي مع القيم المتطرفة الصغيرة فقط كما هو مبين في الشكل. يمكن أن يؤدي التهجين الفاشل إلى تحول قوي نحو جانب واحد ("الوحوش الخضراء").

وأخيراً، تظهر نتيجة تمثيلية للقيم المقبولة في العمود 4 من الشكل 3. للإشارة إلى موثوقية التجارب التي أجريت، يتم تقييم النتائج باستخدام برنامج GeneSpring. وتقدم البيانات المجمعة كتحليل رئيسي للمكونات. يدمج PCA قيم النقاط المختارة (الجينات) كمتجه. يمكن أن يختلف عدد النقاط التي تم تقييمها التي يتم استخدامها من عدة مئات إلى الشريحة بأكملها ويعتمد على البرامج المستخدمة. كل رقاقة (عينة) النتائج في قيمة واحدة (ناقلات) التي نتجت عن كثافة إشارة متكاملة للنقاط تحليلها. لذلك، يشير الموضع النسبي في الرسم البياني (PCA) إلى تشابه العينات مع بعضها البعض. كلما كانت العينات أقرب، كلما كانت متشابهة أكثر. وينبغي أن تكون النسخ المتماثلة التقنية أقرب معاً من العناصر البيولوجية، وينبغي أن تتجمع النسخ البيولوجية للعينة معاً أقرب من عينات من نقاط زمنية أو أنسجة أو شروط مختلفة.

الشكل 1: ملف Electrophoresis تشغيل ملخص تم الحصول عليها بعد التحقق من جودة الحمض النووي الريبي مع محلل الحيوي. العينات 1 و 2 هي أنسجة أوراق الشعير كما هو مبين من قبل عصابات ريببوسال إضافية من الكلوروبلاست. العينات 3 و 4 هي أنسجة بذور الشعير مع 18S و 28S rRNA العصابات هو مبين. لا يتم حساب عامل RIN دائمًا للأنسجة الخضراء مثل الأوراق ولكن وفقًا للهلام ، فإن جودة الحمض النووي الريبي جيدة جدًا. قيمة RIN للعينات 3 و 4 هي 10. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تقرير مراقبة الجودة من التهجين الناجح للصفير الجزئي. A + يشير إلى إشارات تم الكشف عنها على الشبكة من جميع زوايا الشريحة. يُظهر الرسم البياني عدد الإشارات المصنفة وفقًا لشدة الإشارة (الفلورس) على أنها لوغاريتم بعد طرح الخلفية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: ملخص مراقبة الجودة (QC) بعد التهجين والمسح الضوئي. يتم إعطاء قيم الشريحة الهجينة في العمود 2 (القيمة) ويتم عرض نطاق القيم المقبولة في العمود 4. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: إعداد تجمعات غرفة الغسيل.

الجدول 2: درجة حرارة الحضانة والوقت لمجالس غرفة الغسيل.

وليس لدى أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة.