وترد هنا طرق مفصله لتشريح وتلطيخ الدهون قطره من البويضات في اليرقات دروفيه باستخدام BODIPY 493/503 ، صبغه فلورية الدهون الخاصة الحبريه.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التشريح وتلطيخ الدهون القطرة من البويضات في يرقات دروفيا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الدهون ضرورية للتنمية الحيوانية والتوازن الفسيولوجي. خلل التمثيل الغذائي للدهون النتائج في مختلف العيوب التنموية والامراض ، مثل السمنة والكبد الدهني. عاده ، يتم تخزين الدهون في قطرات الدهون ، والتي هي متعددة الوظائف الدهنية تخزين الدهون في الخلايا. قطرات الدهون تختلف في الحجم والعدد في الانسجه المختلفة وتحت ظروف مختلفه. وقد أفادت التقارير بان قطرات الدهون يتم التحكم فيها باحكام من خلال تنظيم تكوينها الإحيائي وتدهورها. في دروفوسيلا، البويضة هي نسيج مهم لاستقلاب الدهون وتم التعرف عليها مؤخرا كالتناظرية الكبد البشرية فيما يتعلق بتعبئة الدهون استجابه للإجهاد. ومع ذلك ، فان أليات التي تقوم علي تنظيم الأيض قطره الدهون في البويضات لا تزال بعيده المنال. لحل هذه المشكلة ، فمن المهم للغاية لتطوير طريقه موثوقه وحساسة لتصور مباشره التغيرات الحيوية قطره الدهون في البويضات اثناء التنمية وتحت ظروف عصيبة. الاستفادة من 493/503 bodipy محبه للدهون ، صبغه فلورية قطره الدهون المحددة ، الموصوفة هنا هو بروتوكول مفصل لتشريح والدهون اللاحقة قطره الدهن في البويضات من اليرقات دروفيسيلا ردا علي المجاعة. وهذا يسمح للتحليل النوعي لديناميات القطيرات الدهنية في ظل ظروف مختلفه عن طريق المجهر البؤري. وعلاوة علي ذلك ، يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة السريعة والقابلة للتكرار للغاية في الشاشات الجينية للعوامل الوراثية الجديدة التي تنطوي علي استقلاب قطره الدهن في البويضات والانسجه الأخرى.
المقدمة
الدهون ضرورية لبقاء الخلية. بالاضافه إلى دورها التقليدي كمكونات لا تتجزا من أنظمه الغشاء الخلوي ، تلعب الدهون أيضا وظائف حاسمه في إمدادات الطاقة والإشارات المحولة طوال دوره حياه الإنسان الفردية1. وهكذا, استقلاب الدهون يجب ان تتوافق مع اللوائح الصارمة للحفاظ علي الأرقاء الفسيولوجية في الخلايا. ومن المعروف ان تقلبات نتائج استقلاب الدهون في مختلف الامراض ، مثل مرض السكري والكبد الدهني. علي الرغم من الاهميه الكبيرة لاستقلاب الدهون في صحة الحيوانية ، تبقي أليات الاساسيه لتنظيم استقلاب الدهون غير معروفه إلى حد كبير.
وقد استخدمت دروفيا علي نطاق واسع لسنوات منذ بدا البروفيسور توماس h. مورغان استخدامها في الدراسات ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. زرع البيض
- اعداد الغذاء وجبه الذرة القياسية لزرع البيض.
ملاحظه: للحصول علي وصفه والطبخ الاجراء للغذاء وجبه الذرة القياسية المستخدمة هنا ، انظر التفاصيل المنشورة سابقا15. - اعداد معجون الخميرة الطازجة عن طريق أضافه 6 مل من الماء المقطر إلى 4 غرام من الخميرة المجففة النشطة في أنبوب الطرد المركزي 50 mL. استخدام ملعقة لخلط وجعل عجينه.
- جعل زجاجات وضع البيض عن طريق ملء الطعام وجبه الذرة في الزجاجات ونشر ما يقرب من 1 غرام من عجينه الخميرة علي سطح الطعام الذرة مع ملعقة.
- وضع الذباب من الأنماط الجينية المطلوبة في زجاجه وضع البيض ووضعه في حاضنه مع درجه حرارة ثابته من 25 درجه مئوية والرطوبة من 60 ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
التنفيذ الناجح لهذا الاجراء يجب ان يؤدي إلى تلطيخ الدهون واضحة التي تكشف عن عدد وحجم قطرات الدهون في البويضات. يبين الشكل 1ا ، ا ' ، ا '' ان هناك عدد قليل من قطرات الدهن القابلة للكشف (النقاط الخضراء) في البويضات من يرقات التغذية العادية خلال مراحل النمو المختلفة. الشكل 1ب ، ب ' ، ب '' يظهر زيادة قطرات الدهون (النقاط الخضراء) كميه في البويضات استجابه ل 12 h (b) ، 24 h (b ') ، و 36 h (b '''') فترا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ومن بين الخطوات المذكورة أعلاه ، هناك عده خطوات حاسمه في هذا البروتوكول ، حيث ان فتره وضع البيضة هي واحده من هذه. كنسيج تعبئة الدهون ، والبويضة حساسة للغاية لحاله التغذية6،8. قد تؤدي الفترات الزمنيه المطولة لوضع البيض إلى يرقات اليد وزيادة المنافسة الغذائية ، مما يؤدي إلى نتائج غير دقيقه. تسمح الفترة الزمنيه التي وضعها البيض والتي تستخدم في هذا البروتوكول بان تتطور اليرقات بدون منافسه غذائية. وهناك عدد أكبر بكثير من اليرقات التي يمكن ان تنجم عن فترات زمنيه أطول ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدي صاحبي البلاغ اي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
وكان هذا العمل مدعوما بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671422 ، 31529004 ، 31601112) ، ومشروع 111 (D18010) ، ومشروع الفرق المحلية الابتكارية والبحثية لبرنامج مواهب نهر بيرل في قوانغدونغ (2017BT01S155) ، مؤسسه الصين لدكتوراه العلمية (2018M640767).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 50 مل أنبوب الطرد المركزي | كورنينج | 430829 50 مل | |
| 6 سم طبق بتري | ثيرمو فيشر | 150326 | 6 سم |
| أجار | للأغذية الذبابية | ||
| رقائق الألومنيوم | N / A | N / | A حماية الخنقيرة من الضوء |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | صبغة تلطيخ قطرات الدهون |
| مجهر | متحد البؤرLeica | Leica TSC SP5 | شراب الذرة للتصوير |
| لأغذية الذباب | |||
| دقيق | لأغذية الذباب | ||
| Coverslip | Citoglas | 10212424C | 20 & مرات 20 مم ، 0.13-0.17 سميكة |
| دبوس تشريح | N / A N / A | / A | |
| لوحة | N / A | N | |
| ترشيح | N / A | قطر N / A | : 11 سم |
| عازلة التثبيت | N / A | N / A | 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في 1x PBS |
| Forcep | Dumont | 11252-30 | # 5 |
| حاضنة | Jiangnan | SPX-380 | لثقافة الذبابة |
| أنبوب الطرد المركزي | الدقيق Axygen | MCT-150-C | 1.5 مل |
| شريحة الفحص المجهري | Citoglas | 10127105P-G | |
| تركيب متوسط | VECTASHIELDتركيب تركيب متوسط | H-1000 | مضاد للبهتان تركيب متوسط |
| طلاء الأظافر | PanEra | AAPR419 | ختم غطاء |
| فرشاة الرسم | N / A | N / | |
| PBS | N / A | N / A 1x | PBS (137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي مولار KCl ، 10 ملي أمبير Na 2< / sub>HPO4< / sub> ، 1.8 ملي متر K2< / sub>PO4< / sub> ، درجة الحموضة 7.4) |
| مختبر Kylin-Bell | المدورة | WH-986 | |
| مقص | Smartdata Medical | SR81 | Vannas مقص الربيع |
| دقيق | لطعام الذباب | ||
| ملعقة | N / A | N / A | |
| طعام دقيق الذرة | القياسي N / A | N / A | الترميز إلى وصفة طعام دقيق الذرة القياسية بلومنجتون |
| ستيريو المجهر | Leica | Leica S6E | لتشريح الأنسجة |
| مسح الورق | N / A | N / A | |
| خميرة | لطعام الذباب | ||
| YW يتم الاحتفاظ بها كمخزون مختبر | N / A | ذبابة الفاكهة |
المراجع
- Liu, Z., Huang, X. Lipid metabolism in Drosophila: development and disease. Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 45 (1), 44-50 (2013).
- Cheng, Y., Chen, D. Fruit fly research in China. Journal of Genetics and Genomics. 45 (11), 583-5....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
