مقالة منهجية

الجمع بين الليزر التقاط Microdissection وMicrofluidic qPCR لتحليل الملامح النسخية للخلايا المفردة: نهج بيولوجيا النظم للاعتماد على المواد الأفيونية

DOI:

10.3791/60612

⸱

مارس 8, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشرح هذا البروتوكول كيفية جمع الخلايا العصبية المفردة وmicroglia والخلايا الفلكية من النواة المركزية للأميغدالا بدقة عالية وخصوصية تشريحية باستخدام المجهر الالتقاط بالليزر. بالإضافة إلى ذلك، نشرح استخدامنا لـ RT-qPCR الميكروسيولية لقياس مجموعة فرعية من النسخ من هذه الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشير التغايرية النسخة العميقة في الخلايا المفردة المجاورة تشريحياً إلى أنه يمكن تحقيق وظائف الأنسجة القوية من خلال تنوع النمط الظاهري الخلوي. وتبين التجارب أحادية الخلية التي تحقق ديناميات الشبكة للنظم البيولوجية استجابات خلوية وأنسجة لمختلف الظروف بدقة بيولوجية. هنا، نشرح أساليبنا لجمع خلايا مفردة من مواقع محددة تشريحياً وقياس مجموعة فرعية بدقة من ملامح التعبير الجيني الخاصة بهم. نحن نجمع بين microdissection التقاط الليزر (LCM) مع النسخ العكسية microfluidic التفاعلات المتسلسلة البوليميراز الكمية (RT-qPCR). كما نستخدم هذه المنصة MICROfluidic RT-qPCR لقياس الوفرة الميكروبية لمحتويات الأمعاء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت قياس ملامح التعبير الجيني للخلايا واحدة التغايرية واسعة فينوتيبيك داخل الأنسجة. وقد أدى هذا التعقيد إلى تعقيد فهمنا للشبكات البيولوجية التي تحكم وظيفة الأنسجة. وقد استكشفت مجموعتنا وغيرها هذه الظاهرة في العديد من الأنسجة والظروف1،2،3،4،5،6. هذه التجارب لا تشير فقط إلى أن تنظيم شبكات التعبير الجيني تكمن وراء هذا التغاير ، ولكن أيضا أن دقة الخلية الواحدة يكشف عن تعقيد في وظيفة الأنسجة أن القرار على مستوى الأنسجة لا نقدر. في الواقع، مجرد أقلية صغيرة من الخلايا قد تستجيب لحالة محددة أو التحدي، ولكن تأثير تلك الخلايا على علم وظائف الأعضاء عموما قد يكون كبيرا. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لنهج بيولوجيا النظام الذي يطبق أساليب متعددة المتغيرات على مجموعات البيانات عالية الأبعاد من أنواع الخلايا والأنسجة المتعددة توضيح آثار العلاج على مستوى النظام.

نحن نجمع LCM وMICROfluidic RT-qPCR للحصول على مجموعات البيانات هذه. نحن نتخذ هذا النهج هنا على النقيض من جمع الخلايا المفردة عبر فرز الخلايا المنشط ة بالفلور (FACS) واستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) لقياس النسخ الخاصة بهم. ميزة LCM على FACS هي أنه يمكن توثيق التحديد التشريحي الدقيق للخلايا المفردة باستخدام LCM ، نسبيًا ومطلقًا. وعلاوة على ذلك، في حين أن الجيش الملكي النيبالي-seq يمكن قياس المزيد من الميزات التي RT-qPCR، microfluidic RT-qPCR هو أقل تكلفة ولديه حساسية أعلى وخصوصية7.

في هذه التجربة التمثيلية ، قمنا بالتحقيق في آثار الاعتماد على المواد الأفيونية وانسحاب المواد الأفيونية النالتريكسون المعجل على الخلايا العصبية الجرذانية ، microglia ، والتعبير الجيني الفلكي في النواة المركزية للأميغدالا (CeA) ووفرة البكتيريا الأمعاء4. تم تحليل أربع مجموعات العلاج: 1) وهمي، 2) المورفين، 3) نالتريكسون، و 4) الانسحاب(الشكل 1). وجدنا أن الاعتماد على المواد الأفيونية لم يغير بشكل كبير التعبير الجيني ، ولكن انسحاب المواد الأفيونية أدى إلى التعبير عن الجينات الالتهابية ، Tnf على وجه الخصوص. الخلايا الفلكية كانت أكثر أنواع الخلايا تضرراً. تأثر ميكروبيوم الأمعاء بشدة بانسحاب المواد الأفيونية كما هو مبين في انخفاض نسبة Firmicutes إلى البكتيريا ، وهي علامة ثابتة على خلل التنسج الأمعاء8،9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجريت هذه الدراسة وفقا لتوصيات لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) من جامعة توماس جيفرسون وكلية الطب في جامعة دريكسل. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل جامعة توماس جيفرسون وكلية الطب في جامعة دريكسل IACUC.

1. نموذج الحيوان

  1. إدراج اثنين 75 ملغ بطيئة الإفراج عن حبيبات كبريتات المورفين أو اثنين من الكريات وهمي تحت الجلد في الفئران الذكور الكبار سبراغ-داولي.
    1. استخدام ثوب والقفازات بشكل مناسب لجراحة العقيمة البسيطة. اُزل ّ دورسوم الجرذ مع المقصات إذا لزم الأمر.
    2. تطبيق مرهم الطبيب البيطري على عيون الحيوان. تهوّن الجرذ بحوالي 20 ق من استنشاق الإيزوفران. يتم تأكيد التخدير عن طريق فقدان الوعي.
    3. جعل شق خط الوسط في دورسوم الفئران مع مقص خرز ة معقمة حادة وفصل الأدمة من جدار الجسم مع مسبار خرزة تعقيمها. إدراج الكريات تحت الأدمة مع ملقط التعقيم عن بُرُب. خياطة شق مغلقة مع إبرة معقمة.
      ملاحظة: يستغرق الإجراء بأكمله حوالي 5 دقيقة لكل فأر. وتستخدم قفازات معقمة جديدة لكل الفئران.
    4. ضع الجرذ في قفص العزل للتعافي بعد الجراحة. تحقق من وجود نبض قلب وإيقاع تنفسية منتظم. مراقبة الفئران حتى يتم استعادة وعيه. تقييم لألم ما بعد الجراحة.
    5. تقييم الفئران 8 ح جراحة ما بعد وكل 12 ح بعد للشفاء والعدوى. وضع الفئران في قفص مع بقية الفوج عندما يتم استردادها تماما من الجراحة, حوالي 24 ساعة بعد الجراحة.
  2. إعطاء حقن النالتريكسون داخل البلتون (75 ملغ /كغ) إلى G والأفواج الانسحاب بعد 6 أيام من التعرض للمورفين.
    ملاحظة: كانت هناك أربعة أفواج فئران في هذه التجربة التمثيلية (انظر الشكل 1).

2- حصاد العينات

  1. حصاد الدماغ 6 أيام بعد إدراج بيليه أو 24 ساعة بعد حقن النالتريكسون.
    1. وضع الحيوان في غرفة الايفورلوران لحوالي 30 ثانية أو حتى يحدث فقدان الوعي، وأشار إلى نقص الحركة وانخفاض معدل التنفس.
    2. استخدام المقصلة حادة لقطع رأس الحيوان بسرعة.
    3. تشريح الدماغ من جمجمة الحيوان.
    4. استخدام شفرة حلاقة حادة المحمولة لجعل الشقوق الإجمالية التالية إلى الدماغ إزالتها: أولا، شريحة قبالة المخيخ والتخلص منها. ثانياً، فصل جذع الدماغ عن الدماغ الأمامي مع شق عرضي. ثالثا, hemisect الدماغ الأمامي و / أو brainstem مع شق القوس منتصف الخط.
    5. ضع الدماغ الأمامي وجذع الدماغ في قالب تضمين الأنسجة البلاستيكية مع 3-4 سم من مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) في الجزء السفلي من القالب. تغطية بقية العينة مع OCT.
    6. ضع على الفور قالب تضمين الأنسجة البلاستيكية مع العينة المغطاة بـ OCT في حمام يحتوي على الثلج الجاف والميثانول. لا تدع الميثانول يتسرب إلى قالب تضمين الأنسجة. الحفاظ على القالب التضمين مع عينة الدماغ في حمام الميثانول الجليد حتى يتم الانتهاء من جمع الأنسجة (~ 10-15 دقيقة كحد أقصى).
    7. ضع عينة الدماغ في ثلاجة -80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.
  2. حصاد عينات الأمعاء في وقت واحد.
    1. بعد قطع الرأس السريع، قم بعمل شق في منتصف بطن الحيوان باستخدام مشرط.
    2. العثور على أعور وقطع صلته اعلى القولون.
    3. اعصر محتويات السُقُل في أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. وضع فورا أنبوب مخروطي على الجليد الجاف ووضعها في الثلاجة -80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.
      ملاحظة: يمكن أيضًا جمع محتويات الأمعاء الدقيقة باستخدام نفس الطرق كتحكم سلبي.

3. تشريح

  1. شريحة الدماغ الفئران hemisected باستخدام cryostat.
    1. قم بإزالة قالب التضمين البلاستيكي مع الدماغ الأمامي من الفريزر -80 درجة مئوية ووضعه في cryostat -20 درجة مئوية.
    2. قم بإزالة عينة الدماغ الأمامية المضمّنة من التضمين. استخدام شفرة حلاقة لشريحة زوايا البلاستيك تضمين العفن عموديا إذا لزم الأمر. جبل الدماغ الأمامي لrostral لتشريح الإكليل caudal على تشاك cryostat باستخدام OCT.
      ملاحظة: المعالم التشريحية لتحديد CeA تشمل الجهاز البصري والمحطة الطرفية stria(الشكل 2B). فروع الجهاز البصري من chiasm البصرية والمسارات الظهرية الجانبية كما هو شرائح الدماغ rostral إلى caudal. عندما يكون الجهاز البصري لديه مورفولوجيا مماثلة لما ينظر إليه في أطلس الدماغ الفئران bregma -2.12 ملم10، يمكن عرض شرائح الاختبار تحت المجهر. يمكن التحقق من الجهاز البصري ومورفولوجيا المحطة الطرفية stria في أطلس دماغ الفئران10 لتحديد bregma وما إذا كان CeA يحيط بمحطات stria.
    3. شريحة 10 ميكرومتر المقاطع الإكليلية سميكة من rostral الدماغ الأمامي hemisected إلى caudal حتى يتم الوصول إلى المقاطع التي تحتوي على CeA.
      ملاحظة: عرض وارتفاع المقاطع حوالي 200 مم.
    4. جمع 10 ميكرومتر أقسام تحتوي على CeA، أو منطقة الدماغ المفضلة، عن طريق ذوبان تركيب 10 مقاطع ميكرومتر على الشرائح الزجاجية العادية. وضع على الفور الشرائح الزجاجية على مقلاة معدنية يستريح على الجليد الجاف. وضع الشرائح مع أقسام الدماغ في الثلاجة -80 درجة مئوية في أقرب وقت ممكن.
      ملاحظة: قد يتم وضع شرائح متعددة على نفس الشريحة. إذا كنت تستخدم بقعة نوع خلية مختلفة للشرائح على نفس الشريحة، اترك حوالي 100 مم بين الشرائح بحيث يمكن استخدام القلم الكاره للماء لفصل حلول الأجسام المضادة الخاصة بنوع الخلية على الشريحة. اترك حوالي 20 مم من حافة الشريحة على كل جانب من الشريحة.

4. تلطيخ الفلورة المناعية

  1. وصمي أقسام الدماغ الأمامي لخلية الدماغ التي تختارها (على سبيل المثال، الخلايا العصبية، microglia، الخلايا الفلكية، الخ) باستخدام الفلورة المناعية.
    1. قم بإزالة شريحة واحدة أو أكثر مع أقسام 10 ميكرومتر من CeA من الفريزر -80 درجة مئوية.
    2. إصلاح الشرائح مع الإيثانول 75٪ لمدة 30 s. إزالة السائل الزائد.
    3. منع شرائح لمدة 30 ثانية مع 2٪ مستضد مصل البقر (BSA) في 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS). غسل 1x مع برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة حل الأجسام المضادة الأولية إلى الشريحة لمدة 2 دقيقة. غسل 1x مع 2٪ محلول BSA.
      ملاحظة: يتكون محلول الأجسام المضادة الأساسي من 2% الأجسام المضادة الأولية، 1% RNase Out، و 96% من نفس حل PBS BSA لخطوة الحجب أعلاه (الخطوة 4.1.3). واستخدمت التجربة التمثيلية جسماً مضاداً لـ "نوين"، وجسماً مضاداً لـ Cd11α، وجسماً مضاداً مضاداً لـ "جي إف بي" بالكميات التالية: 3 ميكرولتر من المواد الأولية، و1.88 ميكرولتر من مثبطات الحمض النووي الريبي، و145.12 ميكرولتر من محلول BSA.
    5. إضافة حل الأجسام المضادة الثانوية إلى الشريحة لمدة 3 دقيقة. غسل 1x مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يتكون محلول الأجسام المضادة الثانوي من 1 ميكرولتر من علامة الفلورسنت المضادة للفأرة 488 نانومتر (1:500)، و2.5 ميكرولتر من مثبط الحمض النووي الريبي، و1.3 ميكرولتر من DAPI (1:10,000)، و196.5 ميكرولتر من 2٪ BSA.

5. الإيثانول وسلسلة الجفاف زيلين

  1. تراجع الشرائح في الإيثانول 75٪ لمدة 30 ثانية مباشرة بعد، تراجع الشرائح في 95٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية مباشرة بعد، تراجع الشرائح إلى 100٪ الإيثانول لمدة 30 ثانية مباشرة بعد، تراجع الشرائح في حاوية ثانية تحتوي على الإيثانول 100٪ لمدة 30 ثانية.
  2. بعد سلسلة الجفاف الإيثانول، تراجع الشرائح في xylene سكب حديثا لمدة 1 دقيقة. مباشرة بعد، تراجع الشرائح في حاوية ثانية من زيلين لمدة 4 دقيقة.
  3. إزالة الشرائح من حمام زيلين والسماح للهواء الجاف في الظلام لمدة 5 دقيقة.
  4. ضع الشرائح في مجفف لمدة 5 دقيقة لتجف أكثر.

6. التقاط الليزر microdissection

  1. إذا ملطخة، ضع الشريحة في المجهر والعثور على المنطقة ذات الاهتمام (CeA) باستخدام المعالم التشريحية (أي شيام البصرية والمحطة الطرفية stria).
  2. استخدام الفلورسينس لتحديد نوع الخلية الملطخة ونوتها في المنطقة ذات الاهتمام. اختر خلية واحدة أو خلايا متعددة إذا كنت تقوم بعينات مجمعة لخلية واحدة. وضع علامة على الخلايا ذات الاهتمام باستخدام برنامج LCM.
  3. ضع غطاء LCM فوق الشريحة على المنطقة المثيرة للاهتمام.
  4. استخدم لقطات اختبار ليزر الأشعة تحت الحمراء (IR) لضبط قوة الليزر بالأشعة تحت الحمراء وحجمها والمدة بحيث تذوب مادة غطاء LCM فقط على مساحة الخلية المفردة المحددة. وهذا يضمن أنه لن يتم جمع أي خلايا أخرى غير الخلايا المحددة.
    ملاحظة: في هذه التجربة التمثيلية، تم استخدام 10 تجمعات خلايا من نفس نوع الخلية كعينة واحدة للحد من التباين بين الخلية والخلية في التعبير الجيني بين العينات بنفس العلاج. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة لتجارب الخلية المفردة الحقيقية1،3.
  5. حدد الخلايا الفردية التي سيتم جمعها للتحليل باستخدام أدوات برامج LCM(الشكل 2C). يجب أن تكون الخلايا المختارة في المنطقة التشريحية لـ CeA (أو منطقة الدماغ المختارة) استنادًا إلى أطلس دماغ الفئران والبريجة10. يجب أن تكون الخلايا على الأقل 3 ميكرومتر من النوى الملطخة المجاورة.
  6. اطلاق النار على الليزر الأشعة تحت الحمراء لجمع الخلايا واحدة محددة.
  7. ضع الغطاء في محطة مراقبة الجودة (QC) وعرضها لضمان تحديد الخلايا المطلوبة فقط. إذا تم اختيار خلايا أخرى عن طريق الخطأ، يمكن استخدام الليزر فوق البنفسجي لتدمير الخلايا غير المرغوب فيها بينما يبقى الغطاء في محطة مراقبة الجودة.
  8. التقاط صورة لقسم الأنسجة من حيث تم جمع الخلية لتوثيق خصوصيتها التشريحية. تسجيل مسافة الشريحة من البريجما إذا كان ذلك مناسبا باستخدام أطلس الدماغ الفئران كمرجع10.
  9. قم بإزالة غطاء LCM من محطة مراقبة الجودة، وإرفاق جهاز استخراج العينة، وميكروس 5.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للانسياليس على العينة.
    ملاحظة: يتكون محلول العازلة للإنحلال من 0.5 ميكرولتر من محسن الليزس و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعادة التعليق.
  10. تناسب الجهاز ExtracSure على أنبوب الطرد المركزي الدقيقة 0.5 مل ووضعها على لوحة ساخنة في 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  11. قم بتدوير العينة والمخزن المؤقت للانفصال لمدة 30 ث بسرعة منخفضة (0.01-0.02 x g)ووضع العينة التي تم جمعها في ثلاجة -80 درجة مئوية.

7. خلية واحدة microfluidic RT-qPCR

  1. Preamplification من مرنا خلية واحدة ل96.96 رقاقة الصفيف الديناميكي
    1. الجمع بين التمهيديات الجينية mRNA qPCR إلى الأمام والخلف لجميع الجينات التي يتم تعيينها في تجمع التمهيدي لpreamplification (تركيز 500 nM كل التمهيدي). على سبيل المثال، 1 ميكرولتر من 100 ميكرومتر في 80 ميكرولتر بالإضافة إلى 120 ميكرولتر من عازل تعليق الحمض النووي.
      ملاحظة: يمكن العثور على تسلسل التمهيدي المستخدمة للتجربة التمثيلية في أوسوليفان وآخرون4.
    2. في لوحة جديدة 96 × 96 PCR، إضافة 1 ميكرولتر من 5x VILO إلى كل بئر.
    3. إزالة عينات الخلية الواحدة LCM من العينات المخزنة في -80 درجة مئوية، والسماح للذوبان لفترة وجيزة، والطرد المركزي لفترة وجيزة بسرعة منخفضة (0.01-0.02 × ز)،وإضافة 5.5 ميكرولتر من عينة خلية واحدة لخلية واحدة إلى لوحة PCR. يتم إضافة كل عينة إلى بئر الخاصة بها.
    4. ضع لوحة PCR مع العينات وفيلو في cycler الحرارة والحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. قم بتدوير اللوحة لمدة دقيقة واحدة عند 1300 × ز عند 4 درجات مئوية ووضع اللوحة على الجليد.
    5. إضافة 0.15 ميكرولتر من 10x cDNA التوليف مزيج رئيسي، 0.12 ميكرولتر T4 جين 32 البروتين، و 0.73 ميكرولتر من الحمض النووي تعليق العازلة إلى كل بئر.
    6. ضع لوحة PCR في cycler وتشغيل البروتوكول التالي: 25 درجة مئوية لمدة 5 سنوات، 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 55 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة، 60 درجة مئوية لمدة 5 سنوات، 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 4 درجات مئوية لإنهاء.
    7. إضافة 7.5 ميكرولتر من مزيج ماجستير من طاقة البوليميراز إلى كل بئر.
    8. أضف 1.5 ميكرولتر من تجمع التمهيدي (انظر أعلاه) إلى كل بئر.
    9. ضع لوحة PCR في cycler وتشغيل بروتوكول preamplification التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، تليها 22 دورة من 96 درجة مئوية لمدة 5 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 4 ثوان.
    10. إضافة 0.6 ميكرولتر من exonuclease أنا رد فعل العازلة 10x، 1.2 ميكرولتر exonuclease I، و 4.2 μL من الحمض النووي تعليق العازلة إلى كل بئر.
    11. ضع لوحة PCR في cycler وتشغيل البروتوكول التالي: 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    12. إضافة 54 ميكرولتر من العازلة TE إلى كل بئر. قم بتدوير لوحة PCR عند 1300 × ز عند 5 درجات في المتجر عند درجة حرارة 4 درجة مئوية إذا استمر على الفور في الخطوة التالية. تخزين في -20 درجة مئوية إذا كان الانتظار أكثر من 12 ساعة للخطوة التالية.
  2. إعداد لوحة العينة لرقاقة الصفيف الديناميكي 96.96.
    1. في لوحة جديدة 96 جيدا PCR، إضافة 0.45 ميكرولتر من 20x صبغة ملزمة الحمض النووي و 4.55 ميكرولتر من mastermix ROX منخفضة إلى كل بئر.
    2. إضافة 3 ميكرولتر من عينة مضخمة إلى كل بئر، تدور لوحة PCR في 1300 × ز،ثم وضع لوحة على الجليد.
  3. إعداد لوحة الاسهي لرقاقة 96.96 صفيف ديناميكي.
    1. في لوحة جديدة 96 جيدا PCR، إضافة 3.75 ميكرولتر من 2x GE فحص تحميل كاشف و 1.25 ميكرولتر من الحمض النووي تعليق العازلة إلى كل بئر.
    2. أضف 2.5 ميكرولتر من 10 ميكرومتر qPCR التمهيدي لكل بئر المقابلة. قم بتدوير لوحة PCR عند 1300 × ز لمدة 5 سنوات.
  4. تحميل وتشغيل 96.96 رقاقة الصفيف الديناميكي.
    1. رئيس رقاقة مع السائل خط التحكم.
    2. ضع الشريحة في وحدة تحكم مؤسسة التمويل الدولية HX وتشغيل البرنامج النصي Prime (136X).
    3. أضف 6 ميكرولتر من العينة من لوحة عينة PCR إلى آبار العينة المقابلة في شريحة الصفيف الديناميكي 96.96.
    4. أضف 6 ميكرولتر من العينة من لوحة تحليل PCR إلى آبار العينات المقابلة في شريحة الصفيف الديناميكي 96.96.
    5. استخدام الإبر لموسيقى البوب أي فقاعات الهواء في الآبار من 96.96 رقاقة الصفيف الديناميكي.
    6. ضع شريحة الصفيف الديناميكي 96.96 في وحدة تحكم IFC HX وتشغيل برنامج Load Mix (136x).
    7. قم بإزالة الشريحة من وحدة تحكم IFC HX، وقشر الملصق الواقي، ووضع شريحة الصفيف الديناميكي 96.96 في منصة RT-qPCR microfluidic. تشغيل بروتوكول جنرال إلكتريك السريع 96 × 96 PCR (30 دورة).
      ملاحظة: يتم تقييم جودة الحمض النووي الريبي وصلاحية النتائج من خلال طرق متعددة، بما في ذلك التحقق من صحة القياس عن طريق الكهربية الهلامية، ومنحنيات درجة الحرارة الذوبان، وعينة وعينات يكرر، ومخططات سلسلة تخفيف القياسية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن التحقق من صحة النتائج النسخية من خلال طرق مستقلة على تشريح الدماغ بما في ذلك بقع اللطخة الغربية واختبارات الفلورالمناعي.

8. قياس وفرة البكتيرية مع microfluidic RT-qPCR

  1. استخراج الحمض النووي البكتيري بعد الاتجاهات من طقم استخراج الحمض النووي البراز.
  2. تقدير تركيز الحمض النووي البكتيري باستخدام qPCR.
  3. أضف الحمض النووي البكتيري المستخرج إلى لوحة PCR جديدة. إضافة 1 ميكرولتر من الحمض النووي البكتيري المستخرج و 9 ميكرولتر من المخزن المؤقت تعليق الحمض النووي.
  4. إعداد لوحة التقطيع لرقاقة الصفيف الديناميكي 48.48 (انظر الخطوات 7.2.1-7.2.2)
  5. إعداد لوحة العينة لرقاقة الصفيف الديناميكي 48.48 (انظر الخطوات 7.3.1-7.3.2)
    1. في لوحة جديدة 96 جيدا PCR، إضافة 0.45 ميكرولتر من 20x صبغة ملزمة الحمض النووي و 4.55 ميكرولتر من ماجستير روكس منخفضة إلى 48 الآبار.
    2. أضف 3 ميكرولتر من العينة من لوحة PCR التي تحتوي على الحمض النووي البكتيري إلى الآبار الـ 48 وتدور أسفل لوحة PCR عند 1300 × ز لمدة 5 دقيقة.
  6. تحميل وتشغيل رقاقة الصفيف الديناميكي 48.48 (انظر الخطوات 7.4.1-7.4.7).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التحقق من صحة اختيار الخلايا المفردة بصريًا وجزيئيًا. بصريا، تم عرض مورفولوجيا الخلوية قبل جمع الخلايا. ثم تم عرض الخلايا التي تم جمعها في محطة مراقبة الجودة وتداخلت وصمة النواة الخلوية (DAPI) مع علامة اختيار الخلية الواحدة. يوضح الشكل 2A صورًا تمثيلية لشريحة تحتوي على الدماغ الأمامي للفئران المنقسمة التي تحتوي على CeA. الصور اللاحقة(الشكل 2B-D)تظهر اختيار الخلايا المفردة وإزالتها من الأنسجة ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت البيولوجيا وحيدة الخلية عدم تجانس الأنماط الظاهرية الخلوية ومتانة وظيفة الأنسجة. وقد وفرت هذه النتائج نظرة ثاقبة على تنظيم النظم البيولوجية على المستويين الكلي والجزئي. هنا ، نصف الجمع بين طريقتين ، LCM وqPCR microfluidic ، للحصول على مقاييس النسخ أحاديالخلية التي توفر خصوصية تشريحية ودقة النسخ بتكلفة منخفضة نسبيًا(الشكل 1). تأخذ مجموعتنا نهجًا بيولوجياً للأنظمة وغالباً ما تقيس أنسجة متعددة في نفس الحيوان. ونجد أن هذه الأساليب مرنة ومثمرة في تحديد كيفية استجابة النظم البيولوجية لمخ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل العمل المقدم هنا من خلال المعاهد القومية للصحة HLB U01 HL133360 الممنوحة لJS و RV، NIDA R21 DA036372 منحت لJS و EVB، وT32 AA-007463 منحت ليان هوك دعما لSJO's.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
20X DNA ملزمة صبغةFluidigm100-7609NA
2x GE فحص تحميل كاشفFluidigm85000802-RNA
48.48 المصفوفة الديناميكية IFC للتعبير الجينيFluidigmBMK-M-48.48NA
96.96 المصفوفة الديناميكية IFC للتعبير الجينيFluidigmBMK-M-96.96NA
Anti-Cd11 & beta ؛ الأجسام المضادةGenway BiotechCCEC48Microglia Stain
الأجسام المضادة للنيو ، استنساخ A60EMD MilliporeMAB377Neuronal Stain
ArcturusXT نظام التشريح الدقيق بالليزرArcturusNANA
Biomark HDFluidigmNART-qPCR منصة
مصل الأبقار مستضدSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect طقم qRT-PCR بخطوةمحلول المخزن المؤقت للتحللThermoFisher Scientific
11753500 DAPIThermoFisher Scientific62248Nucleus
Stain DNA Suspension BufferTEKnovaT0221
Exonuclease INew Englnad BioLabs، Inc.M0293SNA
ExtracSure جهاز استخراج العينةThermoFisher ScientificLCM0208NA
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesThermoFisher Scientific22-037-246شرائح زجاجية عادية
GeneAmp أنبوب تفاعل رقيق الجدرانThermoFisher ScientificN8010611
GFAP أحادي النسيلة الأجسام المضادةThermoFisher ScientificA-21294Astrocyte Stain
Goat المضاد للفأر IgG (H + L) ، Superclonal & Trade ؛ الجسم المضاد الثانوي المؤتلف ، Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA28175Seconadry الأجسام المضادة
IFC ControllerFluidigmNANA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix مع Low RoxBio-RadPN 172-5211Rox Master mix
SuperScript VILO cDNA SynthesisKit ThermoFisher يحتويScientific 11754250على VILO و SuperScript
T4 Gene 32 ProteinNew Englnad BioLabs، Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp ماستر ميكسThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
واحدة مكونات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  4. O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة