هنا ، نقدم بروتوكولًا تم تجميعه لتقييم العدوى الجلدية للفئران المصابة بداء الليشمانيا الأمازوني. هذه طريقة موثوقة لدراسة فوعة الطفيليات ، مما يسمح برؤية نظامية لاستجابة المضيف الفقاري للعدوى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في Vivo العدوى مع الأمازون الليشمانيا لتقييم الفش الطفيلي في الفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الليشمانيا spp. هي الطفيليات الأولية التي تسبب الليشمانيات ، وهي أمراض تمثل مجموعة واسعة من المظاهر السريرية من الآفات الجلدية إلى الآفات الحشوية. وفي الوقت الراهن، يقدر أن 12 مليون شخص مصابون بداء الليشمانيا في جميع أنحاء العالم، وأن أكثر من بليون شخص يعيشون في خطر الإصابة. داء الليشمانيا الأمازوني متوطن في أمريكا الوسطى والجنوبية وعادة ما يؤدي إلى الشكل الجلدي للمرض ، والذي يمكن تصوره مباشرة في نموذج للحيوانات. ولذلك، L. سلالات amazonensis هي نماذج جيدة لدراسات داء الليشمانيات الجلدي لأنها تزرع أيضا بسهولة في المختبر. C57BL/6 الفئران تحاكي L. amazonensisالتي تحركها تطور المرض لوحظ في البشر وتعتبر واحدة من أفضل الفئران سلالات نموذج لداء الليشمانيات الجلدي. في المضيف الفقاري ، تسكن هذه الطفيليات الضامة على الرغم من آليات الدفاع عن هذه الخلايا. العديد من الدراسات استخدام في المختبر الكلية لعدوى المقالات لتقييم العدوى الطفيلي في ظل ظروف مختلفة. ومع ذلك ، يقتصر النهج المختبري على نظام خلية معزولة تتجاهل استجابة الكائن الحي. هنا ، نقوم بتجميع طريقة عدوى المورين في الجسم الحي التي توفر نظرة عامة فسيولوجية جهازية للتفاعل بين المضيف والطفيلي. البروتوكول التفصيلي للعدوى في الجسم الحي من الفئران C57BL/6 مع L. amazonensis يشمل تمايز الطفيليات في amastigotes المعدية، الفئران footpad الجلدية التطعيم، وتطوير الآفات، وتحديد تحميل الطفيليات. نقترح هذه الطريقة الراسخة باعتبارها الطريقة الأكثر ملاءمة للدراسات الفسيولوجية للاستجابات المناعية والأيضية للاستجابة للداء الليشماني الجلدي.
المقدمة
الليشمانيات هي الأمراض المعدية الطفيلية المنتشرة في جميع أنحاء العالم التي تمثل تحديات هامة في البلدان النامية، ومعترف بها كواحدة من أهم الأمراض المدارية المهملة من قبل منظمة الصحة العالمية1،2. تتميز الليشمانيات بمظاهر جلدية و/ أو مخاطية و / أو حشوية. وعادة ما يكون سبب داء الليشمانيات الجلدي من قبل L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica و L. aethiopica3. هذا الشكل من المرض هو في كثير من الأحيان الشفاء الذاتي في البشر بسبب تحريض الاستجابة المناعية الخلوية واقية. ومع ذلك ، قد تفشل الا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في معهد العلوم البيولوجية بجامعة ساو باولو (CEUA 342/2019)، وأجريت وفقا للتوصيات والسياسات لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية في ولاية ساو باولو (Lei Estadual 11.977، de 25/08/2005) والحكومة البرازيلية (لي الاتحادية 11.794، de 08/10/2008). وينبغي أن تنفذ جميع الخطوات الموصوفة في الأقسام 1-5 من العقيم داخل خزانات تدفق اللاصف. يجب استخدام معدات الحماية الشخصية أثناء التعامل مع طفيليات الليشمانيا الحية.
1. في Vitro Differentiation L. amazonensis Promastigotes في Axenic Amastigotes15،20
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
توجد طفيليات الليشمانيا البروتوزوان في شكلين نمائيين خلال دورة حياتها في المضيفين اللافقاريين والفقاريات: البروتماستيجوت ، الأشكال التكاثرية الموجودة في تجويف ذبابة الإناث . وamastigotes ، وأشكال التكاثر وجدت في vacuoles الطفيلية من الخلايا المضيفة الثدييات. البروتماستيجوت لديها جسم ممدود من حوالي 1.5 ميكرومتر واسعة و 20 ميكرون طويلة، مع العلم تخرج عادة من الطرف الأمامي. Amastigotes لديها هيئة مدورة أو ovoid تتراوح في الحجم من 2-6 ميكرون في الطول و 1.5-3 ميكرومتر في العرض، وتمتلك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يسمح إجراء تحليل العدوى في الجسم الحي الموصوف في هذا البروتوكول لأي باحث بتقييم داء الليشمانيات الجلدي الجسمي بالنظر إلى التفاعل بين المضيف والطفيلي في سيناريو نظامي. وقد استخدمت هذه المقالات من قبل العديد من المجموعات22،24،27،29،31،32،34،49 وهنا قمنا بتجمي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
نود أن نشكر البروفيسور الدكتور نيلز أولسن سارايفا كامارا من مركز الحيوان التابع لمعهد العلوم الطبية الحيوية بجامعة ساو باولو على الدعم والبروفيسورة الدكتورة سيلفيا ريني أوليانا لتوفيرطاحونة الأنسجة الزجاجية. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP - منحة MFLS 2017/23933-3).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 96 بئر لوحة | Greiner bio-ne | 655180 | لوحة مسطحة القاع للحد من فحص التخفيف |
| الأدينين | Sigma | A8626 | الملحق المضاف إلى M199 الفرجار |
| وسائط زراعة الخلايا Mitutoyo | 700-118-20 | الفرجار لقياس سمك | |
| قارورة ثقافة خلايا | وسادة القدم Corning | 353014 | قارورة ثقافة خلية بحجم 25 سم < سوب > 2 < / سوب> لزراعة الطرد المركزي طفيلي الليشمانيا |
| Eppendorf | 5804R | معدات تستخدم لفصل العينات بناء على كثافتها | |
| حاضنة CO2< / sub> 34 & deg; C | Thermo Scientific | 3110 | حاضنة لتمايز |
| الإيثانول | Merck | K50237083820 | مطهر للعناصر العامة |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | 12657-029 | ملحق يضاف إلى M199 وسائط زراعة |
| الخلايا أنبوب طاحونة الأنسجة الزجاجية | Thomas Scientific | 3431 E04 | أنبوب لجمع وتعطيل أنسجة |
| وسادة القدم المصابة | Synth | G1008.01.AH | إلى وسائط زراعة الخلايا M199 |
| برنامج GraphPad Prism | Software GraphPad | برنامج يستخدم لرسم البيانات وحساب الأهمية الإحصائية | |
| هيمين | سيجما | H-2250 | الملحق المضاف إلى وسائط زراعة الخلايا M199 |
| ملحق HEPES | Promega | H5303 | تمت إضافته إلى حاضنة وسائط زراعة الخلايا M199 |
| 25 ° C | Fanem | 347CD | حاضنة لزراعة promastigotes |
| المجهر المقلوب | نيكون | TMS | معدات تستخدم للتحليل البصري لمزارع promastigote و amastigote |
| isoflurane | مخدر مستنشق للفئران (3-5٪) | ||
| خزانة تدفق رقائقي | Veco | VLFS-09 | خزانة سلامة حيوية تستخدم لمنطقة العمل المعقمة |
| خلية M199 وسائط الاستزراع | Gibco | 31100-035 | وسائط زراعة الخلايا لزراعة |
| الليشمانيا أنبوب الطرد المركزي الدقيق | Axygen | MCT150C | أنبوب دقيق يستخدم لجمع العينات ومعالجتها وتخزينها |
| ماصة متعددة القنوات | Labsystems | F61978 | ماصة متعددة القنوات تستخدم للحد من مقايسة |
| التخفيف NaHCO3 | Merck | 6329 | تمت إضافة الملحق إلى وسائط زراعة الخلايا M199 |
| NaOH | Sigma | S8045 | الملحق المضاف إلى وسائط زراعة الخلايا M199 |
| غرفة Neubauer | HBG | 2266 | مقياس كثافة الدم لحساب المجهر البصري لتعليق الطفيلي |
| نيكون | E200 | معدات بصرية تستخدم لحساب الطفيليات | |
| Parafilm | Bemis | 349 | بلاستيك مرن ومقاوم لإغلاق لوحة |
| البنسلين / الستربتومايسين | جيبكو | 15140122 | مكمل غذائي يضاف إلى وسائط زراعة الخلايا M199 |
| أطباق بتري | TPP | 93100 | طبق معقم لتشريح مجموعة ماصات وسادة القدم |
| جيلسون | F167360 | مجموعة ماصات دقيقة تحتوي على أربعة ماصات (P2 ، P20 ، P200 ، P1000) | |
| مقياس | Quimis | BG2000 | معدات تستخدم لوزن وسادة القدم المجمعة الآفات |
| مشرط | Solidor | 10237580026 | مشرط لقطع وتجميع أنسجة وسادة القدم |
| ماصة مصلية 10 مل | Nest | 327001 | ماصة معقمة تستخدم لنقل أطراف أحجام المليلتر |
| Axygen | طرف ماصة يستخدم لنقل أحجام الميكرولتر | ||
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | صبغة تستخدم لحساب الطفيليات القابلة للحياة |
| التربتيكاز الببتون | Merck | إلى وسائط زراعة الخلايا M199 | |
| حقنة توبركولين | BD | 305945 | حقنة بإبرة 27G لتلقيح تعليق الطفيلي |
المراجع
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671(2012).
- Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-128....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
