يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في Vivo العدوى مع الأمازون الليشمانيا لتقييم الفش الطفيلي في الفئران

8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60617

⸱

فبراير 20, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Institute of Bioscience, University of Sao Paulo

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولًا تم تجميعه لتقييم العدوى الجلدية للفئران المصابة بداء الليشمانيا الأمازوني. هذه طريقة موثوقة لدراسة فوعة الطفيليات ، مما يسمح برؤية نظامية لاستجابة المضيف الفقاري للعدوى.

الملخص

الليشمانيا spp. هي الطفيليات الأولية التي تسبب الليشمانيات ، وهي أمراض تمثل مجموعة واسعة من المظاهر السريرية من الآفات الجلدية إلى الآفات الحشوية. وفي الوقت الراهن، يقدر أن 12 مليون شخص مصابون بداء الليشمانيا في جميع أنحاء العالم، وأن أكثر من بليون شخص يعيشون في خطر الإصابة. داء الليشمانيا الأمازوني متوطن في أمريكا الوسطى والجنوبية وعادة ما يؤدي إلى الشكل الجلدي للمرض ، والذي يمكن تصوره مباشرة في نموذج للحيوانات. ولذلك، L. سلالات amazonensis هي نماذج جيدة لدراسات داء الليشمانيات الجلدي لأنها تزرع أيضا بسهولة في المختبر. C57BL/6 الفئران تحاكي L. amazonensisالتي تحركها تطور المرض لوحظ في البشر وتعتبر واحدة من أفضل الفئران سلالات نموذج لداء الليشمانيات الجلدي. في المضيف الفقاري ، تسكن هذه الطفيليات الضامة على الرغم من آليات الدفاع عن هذه الخلايا. العديد من الدراسات استخدام في المختبر الكلية لعدوى المقالات لتقييم العدوى الطفيلي في ظل ظروف مختلفة. ومع ذلك ، يقتصر النهج المختبري على نظام خلية معزولة تتجاهل استجابة الكائن الحي. هنا ، نقوم بتجميع طريقة عدوى المورين في الجسم الحي التي توفر نظرة عامة فسيولوجية جهازية للتفاعل بين المضيف والطفيلي. البروتوكول التفصيلي للعدوى في الجسم الحي من الفئران C57BL/6 مع L. amazonensis يشمل تمايز الطفيليات في amastigotes المعدية، الفئران footpad الجلدية التطعيم، وتطوير الآفات، وتحديد تحميل الطفيليات. نقترح هذه الطريقة الراسخة باعتبارها الطريقة الأكثر ملاءمة للدراسات الفسيولوجية للاستجابات المناعية والأيضية للاستجابة للداء الليشماني الجلدي.

المقدمة

الليشمانيات هي الأمراض المعدية الطفيلية المنتشرة في جميع أنحاء العالم التي تمثل تحديات هامة في البلدان النامية، ومعترف بها كواحدة من أهم الأمراض المدارية المهملة من قبل منظمة الصحة العالمية1،2. تتميز الليشمانيات بمظاهر جلدية و/ أو مخاطية و / أو حشوية. وعادة ما يكون سبب داء الليشمانيات الجلدي من قبل L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica و L. aethiopica3. هذا الشكل من المرض هو في كثير من الأحيان الشفاء الذاتي في البشر بسبب تحريض الاستجابة المناعية الخلوية واقية. ومع ذلك ، قد تفشل الاستجابة المناعية الخلوية ، ويمكن أن يتطور المرض إلى انتشار داء الليشمانيات الجلدي4،5. لا يوجد لقاح متاح بسبب التنوع بين أنواع الليشمانيا والخلفيات الوراثية المضيفة6،7. خيارات العلاج محدودة أيضا لأن معظم الأدوية المتاحة حاليا هي إما مكلفة، سامة، و / أو قد تتطلب العلاج على المدى الطويل8،9. الى جانب ذلك، كانت هناك تقارير عن مقاومة الدواء ضد العلاجات المتاحة10،11.

العامل المسبب للليشمانيات هو طفيلي الليشمانياالبروتوزواني. يقدم الطفيلي شكلين مورفولوجية متميزين في دورة حياته: البروتماستيوجوت ، الشكل المشوه الموجود في ذبابة الوعيد. وamastigotes، شكل داخل الخلايا وجدت في vacuoles الطفيلية من الضامة المضيف الثدييات12،13. أماستيوجوتس' القدرة على غزو, البقاء على قيد الحياة, وتكرار على الرغم من آليات الدفاع من الضامة المضيف الفقارية تخضع للعديد من الدراسات14,15,16,17. ونتيجة لذلك، كانت العديد من المجموعات البحثية تصف في المختبر تحليل العدوى الضامة لتقييم تأثير عوامل بيئية محددة، فضلا عن الطفيليات والجينات المضيفة على العدوى الطفيلية. يقدم هذا الطرح العديد من المزايا، مثل القدرة على تكييف الدراسات مع شكل إنتاجية عالية، وفترة زمنية أقصر نسبيا للحصول على النتائج، وانخفاض عدد الحيوانات المختبرية التي ضحتبـ 18. ومع ذلك ، فإن نتائج المقالات المختبرية محدودة لأنها لا تتكرر دائمًا في دراسات الجسم الحي14،19،20،21. في التجارب في الجسم الحي توفر نظرة عامة فيزيولوجية نظامية للتفاعل المضيف الطفيلي ، والتي لا يمكن محاكاة كاملة من خلال المقالات المختبرية. على سبيل المثال ، يمكن إجراء الدراسات المناعية من خلال الاختبارات الكيميائية المناعية من أقسام أنسجة لوحة القدم التي تم جمعها أو حتى من الغدد الليمفاوية البوليتية لتحليل الخلايا المناعية المستردة22.

وغالبا ما تستخدم الحيوانات كنموذج للأمراض البشرية في البحوث البيولوجية والطبية الحيوية لفهم أفضل للآليات الفسيولوجية الكامنة وراء الأمراض23. في حالة داء الليشمانيات ، يؤثر الطريق أو الموقع أو جرعة التطعيم على نتيجة المرض24،25،26،27. وعلاوة على ذلك ، فإن قابلية العدوى في البشر والفئران ومقاومتها تنظمها الخلفيات الوراثية للمضيف والطفيلي4،5،22،28،29،30،31. فئران BALB/c معرضة بشدة للعدوى الجلدية ل. الأمازون، مما يظهر تطور ًا سريعًا للمرض مع انتشار الطفيليات إلى الغدد الليمفاوية والطحال والكبد32. كما قد تقدم المرض إلى الانبثاث الجلدي، يمكن أن تكون العدوى قاتلة. في المقابل ، غالبًا ما تتطور فئران C57BL/6 إلى آفات مزمنة مع أحمال طفيلية مستمرة في الملوثات الضارة بمتلازمة الأمازون L. 33. وبالتالي، L. عدوى الأمازون مع هذا النوع من الفئران خاصة وقد اعتبرت نموذجا ممتازا لدراسة الأشكال المزمنة من داء الليشمانيات الجلدي في البشر، لأنه يحاكي تطور المرض أفضل من التهاب الفئران BALB/c نموذج5،34.

وبالتالي ، نقترح أن المورين في عدوى الجسم الحي هو وسيلة مفيدة للدراسات الفسيولوجية الليشمانية المنطبة المطبقة على الأمراض البشرية ، مما يسمح برؤية جهازية للتفاعل بين المضيف والطفيلي. إعادة النظر في المقالات الراسخة22، نقدم هنا بروتوكولًا مجمعًا خطوة بخطوة من عدوى الجسم الحي لفئران C57BL/6 مع L. amazonensis التي تضم تمايز الطفيليات إلى amastigotes الفأسية ، تلقيح الفئران الجلدية ، تطور الآفات ، وتحديد حمولة الطفيليات. يمكن تكييف هذا البروتوكول مع سلالات الفئران الأخرى وأنواع الليشمانيا التي تسبب الليشمانيات الجلدية. في الختام ، فإن الطريقة المعروضة هنا حاسمة في تحديد أهداف ولقاحات جديدة للأدوية المضادةللليشمانيا ، وكذلك في الدراسات الفسيولوجية للاستجابات المناعية والأيضية المضيفة لعدوى الليشمانيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في معهد العلوم البيولوجية بجامعة ساو باولو (CEUA 342/2019)، وأجريت وفقا للتوصيات والسياسات لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية في ولاية ساو باولو (Lei Estadual 11.977، de 25/08/2005) والحكومة البرازيلية (لي الاتحادية 11.794، de 08/10/2008). وينبغي أن تنفذ جميع الخطوات الموصوفة في الأقسام 1-5 من العقيم داخل خزانات تدفق اللاصف. يجب استخدام معدات الحماية الشخصية أثناء التعامل مع طفيليات الليشمانيا الحية.

1. في Vitro Differentiation L. amazonensis Promastigotes في Axenic Amastigotes15،20،35،36،37،38

ملاحظة: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269)(La)تم استخدام الطفيلي في هذا المنظار. اعتمادا على الغرض من الدراسة ، يمكن الحصول على شكل طفيلي معدي إما عن طريق تنقية الشكل التلوسي باستخدام تدرج الكثافة ، كما هو موضح سابقًا14، أو عن طريق تمييز البوماستيجوت في الأماستيجوت الفأسي ، وفقًا للبروتوكول التالي.

  1. تنمو لا promastigotes في 25 سم2 قارورة الخلايا الثقافة التي تحتوي على 10 مل من المتوسطة للpromastigotes (الموالية المتوسطة) (درجة الحموضة = 7.0).
  2. احتضان في 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام.
    ملاحظة: استخدام الثقافات promastigote التي تم تمريرها في المختبر أقل من 10x لتجنب فقدان الفوعة والتغيرات aneuploidy الطفيليات39،40،41،42،43،44.
  3. ماسيت 5 مل من مرحلة النمو اللوغاريتمي promastigote الثقافة في قارورة جديدة 25 سم2.
  4. أضف 5 مل من الأماستيجوت المتوسط للأماستيجوت (ama-medium) (درجة الحموضة = 5.2).
  5. احتضان في 34 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
  6. تقسيم الثقافة عن طريق تخفيف مع ama المتوسطة بنسبة 1:3 إلى قارورة 25سم جديدة.
  7. احتضان في 34 درجة مئوية لمدة 3-5 أيام.
    ملاحظة: احتضان amastigotes axenic لمدة تصل إلى 5 أيام، كما أنه يمثل نهاية النضج37.

2. C57BL/6 عدوى القدم مع L. amazonensis

ملاحظة: تم الحصول على أنثى C57BL/6 الفئران (6-8 أسابيع من العمر) والحفاظ عليها في مركز الحيوان التابع لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو. تلقت الحيوانات الطعام والماء الإعلانية libitum.

  1. عد ثقافة amastigotes axenic عن طريق نقل aliquot من تعليق الطفيلي المخفف في برنامج تلفزيوني إلى غرفة نيوباور (أي، مقياس الهيموسيتومتر). عد الطفيليات غير المعلّمة ، والتي تمثل أشكال الأماستيجوت.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن استخدام أزرق تريبان (1:1) لحساب عدد الأماستيجوت القابل للتطبيق (أي تلك غير الملطخة باللون الأزرق التربان).
  2. تمييع amastigotes axenic في PBS وفقا لجرعة التلقيح المطلوبة وعدد من inoculums المقصود (1 × 106 amastigotes axenic في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني) ويوصى).
  3. تحميل حقنة الدرنة مع إبرة 27 G مع تعليق الطفيلي المعدة.
  4. تطفل ماوس C57BL/6 باستخدام 3-5٪ isoflurane، كما أوصت جامعة جونز هوبكنز رعاية الحيوانات ولجنة الاستخدام45. تقييم عمق التخدير عن طريق اختبار استجابة الماوس لقرصة إصبع القدم.
  5. Inoculate 50 ميكرولتر من تعليق الطفيليات المتجانسة (1 × 106 amastigotes axenic أو جرعة التلقيح المطلوبة) في الأنسجة الفرعية من القدم الخلفية اليسرى ، وذلك باستخدام حقنة الدرنكولين المحملة سابقا (الخطوة 2.3).

3. الماوس فوتباد تطوير الآفات

  1. قياس تطور الآفة مرة واحدة في الأسبوع عن طريق قياس سمك منصات القدم اليسرى (المصابة) واليمنى (غير المصابة) باستخدام الفرجار.
  2. حساب الفرق في سمك بين الأيمن والأيمن الأيمن الأيمن الخلفي القدمين أسبوعيا لتقييم تطور الآفة.
  3. رسم الاختلافات المحسوبة على المحور ص ووقت العدوى على المحور X وحساب الأهمية الإحصائية.
    ملاحظة: وفقًا لتوصيات لجان رعاية الحيوانات واستخدامها ، يجب التضحية بالحيوانات قبل أن تصبح الآفة المصابة متقرحة ، لأن قرحة الجلد يمكن أن تؤدي إلى عدوى ثانوية. كما هو موضح في الشكل التكميلي 1، يستغرق حوالي 10 أسابيع للآفات لتقديم علامات التقرح مع جرعة الطفيليات (106 amastigotes الفأسي) وسلالة المضيف (C57BL/6) المستخدمة في هذا البروتوكول. يجب التضحية بالفئران لاستخراج الآفة قبل ملاحظة علامات التقرح.

4. الفئران Footpad استخراج الآفات والطفيليات الحد من التخفيف

  1. إعداد لوحة بئر 96 (أسفل مسطح) لحدود تخفيف اقهة46،47 عن طريق إضافة 180 ميكرولتر من الموالية المتوسطة لجميع الآبار.
    ملاحظة: استخدم أربعة ممرات لوحات (نصف اللوحة) لكل الحيوان، تمثل مقالات رباعية (أي الحيوان 1 = الممرات A-D؛ الحيوان 2 = الممرات E-H).
  2. أضف 1 مل من الوسط المؤيد في أنبوب طاحونة الأنسجة الزجاجية لكل آفة ووزن الأنبوب.
    ملاحظة: يجب أن تبقى أنبوب معقم، لذلك استخدام غطاء معقم وتزن أنبوب مع غطاء مغلق، إذا وزنها خارج مجلس الوزراء تدفق لامينار.
  3. التضحية بالحيوان في غرفة CO2 ، بناء على توصيات لجان رعاية الحيوان واستخدامه. تطهير الحيوان عن طريق الرش مع الإيثانول 70٪.
  4. استئصال قدم الحيوان في ذلك الكعب لاستخراج القدم المصابة ورذاذ الإيثانول 70٪ على سفح للتطهير. ضمان تعقيم المقص والملقط عن طريق الاحتفاظ بها غارقة في الإيثانول 70٪.
  5. ضع سند القدم المصاب في طبق بيتري معقم وتشريح باستخدام ملقط معقم ومشرط لجمع جميع الأنسجة الرخوة. تجاهل العظام.
    ملاحظة: يوصى بالتوحيد في خطوة التشريح لتجنب استعادة الأنسجة المتحيزة.
  6. نقل الأنسجة التي تم جمعها إلى أنبوب طاحونة الأنسجة الزجاجية مع الموالية المتوسطة، ثم تزن الأنبوب مرة أخرى لتحديد وزن الآفة.
    ملاحظة: تجنب وضع ملقط ومشرط مباشرة في الوسط، كما يمكن إزالة كميات صغيرة، مما أدى إلى وزن الأنسجة أقل من ذلك. يتم حساب وزن الآفة عن طريق طرح وزن الأنبوب الذي يحتوي على وسط مؤيد للأنسجة التي تم جمعها من وزن الأنبوب الذي يحتوي على وسيط فقط.
  7. تجانس الأنسجة 10x باستخدام طاحونة لاضطراب الأنسجة كاملة.
  8. السماح للخليط إلى الرواسب لمدة 10 دقيقة، ثم جمع 20 ميكرولتر من supernatant.
  9. تحميل 20 ميكرولتر من supernatant في العمود1 من حارة1 من لوحة جيدة 96 أعدت في الخطوة 4.1. كرر هذا للممرات الثلاثة التالية أن يكون رباعية لكل الحيوان (أي، للحصول على الحيوان 1 إضافة 20 ميكرولتر إلى كل بئر والتسمية A1، B1، C1، و D1).
  10. تجانس كل بئر في العمود1 st 10x باستخدام ماصة متعددة القنوات. ثم، نقل 20 ميكرولتر من العينات المخففة من العمود1 إلى العمودالثاني 2.
    ملاحظة: من المهم تجانس كل بئر 10x من عمود واحد إلى آخر.
  11. كرر الخطوة 4.10 إلى جميع الأعمدة المتبقية حتى العمود الأخير (12th)وتجاهل 20 ميكرولتر النهائي من العينة المخففة.
    ملاحظة: تغيير النصائح بعد كل تخفيف لتجنب التلوث المتبادل.
  12. ختم لوحات مع فيلم واحتضان في 25 درجة مئوية لمدة 7 أيام في غرفة رطبة.

5. آفة طفيل تحديد الحمل

  1. تحليل لوحات بعد 7 أيام من الحضانة باستخدام المجهر المقلوب لتحديد البئر الأخيرة التي تحتوي على الطفيليات لكل حارة.
    ملاحظة: من الممكن أيضًا الحصول على مؤشر على نمو الطفيليات ، أو كثافة الخلايا ، من خلال التحليل البصري لتغيرات اللون وتعكر الوسط.
  2. حساب حمولة الأنسجة الطفيلية لكل حارة عن طريق تقسيم عامل التخفيف لكل وزن الآفة.
    ملاحظة: في حارة محددة ، إذا كانت الطفيليات موجودة فقط في الأعمدة 1-5 (أي أن الآبار A1-A5 إيجابية لنمو الطفيليات) ، وهذا يعني أن العمود 5 يحتوي على طفيلي واحد فقط ، والعمود 4 يحتوي على 10 طفيليات ، وما إلى ذلك ، في مضاعفات عشرة. سيحتوي العمود 1 على 104 طفيليات ، وهو ما يمثل عدد الطفيليات في 20 ميكرولتر الأولي من supernatant (العينة غير المخففة في الخطوة 4.7). لأن هذا 20 ميكرولتر تم تخفيفها مع 180 ميكرولتر من الموالية للوسط، الأنبوب الأولي يحتوي على 5 × 105 الطفيليات: (1 × 104)/ (0.02 مل) = 5 × 105 طفيليات / 1 مل. بعد ذلك ، يمكن حساب حمولة الطفيل في تلك الآفة عن طريق قسمة التركيز الأولي للطفيلي على وزن الآفة: (5 × 105)/ وزن الآفة (انظر الخطوة 4.6).
  3. رسم متوسط النتيجة رباعية لكل الحيوان مع سجل Y-scale.

6 - التحليل الإحصائي

  1. تمثل البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري باستخدام ما لا يقل عن خمسة الحيوانات لكل مجموعة تجريبية كما يكرر.
  2. إجراء تحليل إحصائي باستخدام اختبار ثنائي الذيل غير المتماشي، مع الأخذ في الاعتبار قيمة p < 0.05 كقيمة كبيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

توجد طفيليات الليشمانيا البروتوزوان في شكلين نمائيين خلال دورة حياتها في المضيفين اللافقاريين والفقاريات: البروتماستيجوت ، الأشكال التكاثرية الموجودة في تجويف ذبابة الإناث . وamastigotes ، وأشكال التكاثر وجدت في vacuoles الطفيلية من الخلايا المضيفة الثدييات. البروتماستيجوت لديها جسم ممدود من حوالي 1.5 ميكرومتر واسعة و 20 ميكرون طويلة، مع العلم تخرج عادة من الطرف الأمامي. Amastigotes لديها هيئة مدورة أو ovoid تتراوح في الحجم من 2-6 ميكرون في الطول و 1.5-3 ميكرومتر في العرض، وتمتلك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يسمح إجراء تحليل العدوى في الجسم الحي الموصوف في هذا البروتوكول لأي باحث بتقييم داء الليشمانيات الجلدي الجسمي بالنظر إلى التفاعل بين المضيف والطفيلي في سيناريو نظامي. وقد استخدمت هذه المقالات من قبل العديد من المجموعات22،24،27،29،31،32،34،49 وهنا قمنا بتجمي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

نود أن نشكر البروفيسور الدكتور نيلز أولسن سارايفا كامارا من مركز الحيوان التابع لمعهد العلوم الطبية الحيوية بجامعة ساو باولو على الدعم والبروفيسورة الدكتورة سيلفيا ريني أوليانا لتوفيرطاحونة الأنسجة الزجاجية. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة ساو باولو للأبحاث (FAPESP - منحة MFLS 2017/23933-3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
96 بئر لوحةGreiner bio-ne655180لوحة مسطحة القاع للحد من فحص التخفيف
الأدينينSigmaA8626الملحق المضاف إلى M199 الفرجار
وسائط زراعة الخلايا Mitutoyo700-118-20الفرجار لقياس سمك
قارورة ثقافة خلاياوسادة القدم Corning353014قارورة ثقافة خلية بحجم 25 سم < سوب > 2 < / سوب> لزراعة الطرد المركزي طفيلي الليشمانيا
Eppendorf5804Rمعدات تستخدم لفصل العينات بناء على كثافتها
حاضنة CO2< / sub> 34 & deg; CThermo Scientific3110حاضنة لتمايز
الإيثانولMerckK50237083820مطهر للعناصر العامة
مصل الأبقار الجنينيGibco12657-029ملحق يضاف إلى M199 وسائط زراعة
الخلايا أنبوب طاحونة الأنسجة الزجاجيةThomas Scientific3431 E04أنبوب لجمع وتعطيل أنسجة
وسادة القدم المصابةSynthG1008.01.AHإلى وسائط زراعة الخلايا M199
برنامج GraphPad PrismSoftware GraphPadبرنامج يستخدم لرسم البيانات وحساب الأهمية الإحصائية
هيمينسيجماH-2250الملحق المضاف إلى وسائط زراعة الخلايا M199
ملحق HEPESPromegaH5303تمت إضافته إلى حاضنة وسائط زراعة الخلايا M199
25 ° CFanem347CDحاضنة لزراعة promastigotes
المجهر المقلوبنيكونTMSمعدات تستخدم للتحليل البصري لمزارع promastigote و amastigote
isofluraneمخدر مستنشق للفئران (3-5٪)
خزانة تدفق رقائقيVecoVLFS-09خزانة سلامة حيوية تستخدم لمنطقة العمل المعقمة
خلية M199 وسائط الاستزراعGibco31100-035وسائط زراعة الخلايا لزراعة
الليشمانيا أنبوب الطرد المركزي الدقيقAxygenMCT150Cأنبوب دقيق يستخدم لجمع العينات ومعالجتها وتخزينها
ماصة متعددة القنواتLabsystemsF61978ماصة متعددة القنوات تستخدم للحد من مقايسة
التخفيف NaHCO3Merck6329تمت إضافة الملحق إلى وسائط زراعة الخلايا M199
NaOHSigmaS8045الملحق المضاف إلى وسائط زراعة الخلايا M199
غرفة NeubauerHBG2266مقياس كثافة الدم لحساب المجهر البصري لتعليق الطفيلي
نيكونE200معدات بصرية تستخدم لحساب الطفيليات
ParafilmBemis349بلاستيك مرن ومقاوم لإغلاق لوحة
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122مكمل غذائي يضاف إلى وسائط زراعة الخلايا M199
أطباق بتريTPP93100طبق معقم لتشريح مجموعة ماصات وسادة القدم
جيلسونF167360مجموعة ماصات دقيقة تحتوي على أربعة ماصات (P2 ، P20 ، P200 ، P1000)
مقياسQuimisBG2000معدات تستخدم لوزن وسادة القدم المجمعة الآفات
مشرطSolidor10237580026مشرط لقطع وتجميع أنسجة وسادة القدم
ماصة مصلية 10 ملNest327001ماصة معقمة تستخدم لنقل أطراف أحجام المليلتر
Axygenطرف ماصة يستخدم لنقل أحجام الميكرولتر
Trypan blueGibco15250-061صبغة تستخدم لحساب الطفيليات القابلة للحياة
التربتيكاز الببتونMerckإلى وسائط زراعة الخلايا M199
حقنة توبركولينBD305945حقنة بإبرة 27G لتلقيح تعليق الطفيلي
تمت إضافة مكمل الجلوكوز تمت إضافة مكمل

المراجع

  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PloS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Ashford, R. W. The leishmaniases as emerging and reemerging zoonoses. International Journal for Parasitololy. 30 (12-13), 1269-1281 (2000).
  3. Burza, S., Croft, S. L., Boelaert, M. Leishmaniasis. Lancet. 392 (10151), 951-970 (2018).
  4. Scorza, B. M., Carvalho, E. M., Wilson, M. E. Cutaneous Manifestations of Human and Murine Leishmaniasis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), e1296(2017).
  5. Afonso, L. C., Scott, P. Immune responses associated with susceptibility of C57BL/10 mice to Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 61 (7), 2952-2959 (1993).
  6. Khamesipour, A., Rafati, S., Davoudi, N., Maboudi, F., Modabber, F. Leishmaniasis vaccine candidates for development: a global overview. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 423-438 (2006).
  7. Kumar, R., Engwerda, C. Vaccines to prevent leishmaniasis. Clinical & Translational Immunology. 3 (3), e13(2014).
  8. Murray, H. W., Berman, J. D., Davies, C. R., Saravia, N. G. Advances in leishmaniasis. Lancet. 366 (9496), 1561-1577 (2005).
  9. Hotez, P. J., Bottazzi, M. E., Franco-Paredes, C., Ault, S. K., Periago, M. R. The neglected tropical diseases of Latin America and the Caribbean: a review of disease burden and distribution and a roadmap for control and elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 2 (9), e300(2008).
  10. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clinical Microbiology Reviews. 19 (1), 111-126 (2006).
  11. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052(2017).
  12. Teixeira, D. E., et al. The cell biology of Leishmania: how to teach using animations. PLoS Pathogens. 9 (10), e1003594(2013).
  13. Sunter, J., Gull, K. Shape, form, function and Leishmania pathogenicity: from textbook descriptions to biological understanding. Open Biology Journal. 7 (9), 170165(2017).
  14. Laranjeira-Silva, M. F., et al. A MFS-like plasma membrane transporter required for Leishmania virulence protects the parasites from iron toxicity. PLoS Pathogens. 14 (6), e1007140(2018).
  15. Aoki, J. I., et al. L-arginine availability and arginase activity: Characterization of amino acid permease 3 in Leishmania amazonensis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006025(2017).
  16. Probst, C. M., et al. A comparison of two distinct murine macrophage gene expression profiles in response to Leishmania amazonensis infection. BMC Microbiology. 12, 22(2012).
  17. Dillon, L. A., et al. Simultaneous transcriptional profiling of Leishmania major and its murine macrophage host cell reveals insights into host-pathogen interactions. BMC Genomics. 16, 1108(2015).
  18. Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. Journal of Visualized Experiments. (133), e57486(2018).
  19. Mittra, B., Laranjeira-Silva, M. F., Miguel, D. C., Perrone Bezerra de Menezes, J., Andrews, N. W. The iron-dependent mitochondrial superoxide dismutase SODA promotes. The Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12324-12338 (2017).
  20. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 ferric iron reductase of Leishmania amazonensis is essential for the generation of infective parasite forms. The Journal of Biological Chemistry. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  21. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PloS One. 7 (3), e34022(2012).
  22. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Current Protocols in Immunology. , (1998).
  23. Andersen, M. L., Winter, L. M. F. Animal models in biological and biomedical research - experimental and ethical concerns. Anais da Academia Brasileira de Ciências. 91, e20170238(2019).
  24. Ribeiro-Gomes, F. L., et al. Site-dependent recruitment of inflammatory cells determines the effective dose of Leishmania major. Infection and Immunity. 82 (7), 2713-2727 (2014).
  25. Mahmoudzadeh-Niknam, H., Khalili, G., Abrishami, F., Najafy, A., Khaze, V. The route of Leishmania tropica infection determines disease outcome and protection against Leishmania major in BALB/c mice. The Korean Journal of Parasitology. 51 (1), 69-74 (2013).
  26. Oliveira, D. M., et al. Evaluation of parasitological and immunological parameters of Leishmania chagasi infection in BALB/c mice using different doses and routes of inoculation of parasites. Parasitology Research. 110 (3), 1277-1285 (2012).
  27. Côrtes, D. F., et al. Low and high-dose intradermal infection with Leishmania major and Leishmania amazonensis in C57BL/6 mice. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 105 (6), 736-745 (2010).
  28. Blackwell, J. M., et al. Genetics and visceral leishmaniasis: of mice and man. Parasite Immunology. 31 (5), 254-266 (2009).
  29. Loeuillet, C., Bañuls, A. L., Hide, M. Study of Leishmania pathogenesis in mice: experimental considerations. Parasites & Vectors. 9, 144(2016).
  30. Alexander, J., Brombacher, F. T Helper1/T Helper2 Cells and Resistance/Susceptibility to Leishmania Infection: Is This Paradigm Still Relevant? Frontiers in Immunology. 3, 80(2012).
  31. Sacks, D., Noben-Trauth, N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature Reviews Immunology. 2 (11), 845-858 (2002).
  32. Bogdan, C., et al. Experimental Cutaneous Leishmaniasis: Mouse Models for Resolution of Inflammation Versus Chronicity of Disease. Methods in Molecular Biology. 1971, 315-349 (2019).
  33. Jones, D. E., Ackermann, M. R., Wille, U., Hunter, C. A., Scott, P. Early enhanced Th1 response after Leishmania amazonensis infection of C57BL/6 interleukin-10-deficient mice does not lead to resolution of infection. Infection and Immunity. 70 (4), 2151-2158 (2002).
  34. Velasquez, L. G., et al. Distinct courses of infection with Leishmania (L.) amazonensis are observed in BALB/c, BALB/c nude and C57BL/6 mice. Parasitology. 143 (6), 692-703 (2016).
  35. de Menezes, J. P., et al. Leishmania infection inhibits macrophage motility by altering F-actin dynamics and the expression of adhesion complex proteins. Cellular Microbiology. 19 (3), 1266(2017).
  36. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathogens. 12 (1), e1005340(2016).
  37. Zilberstein, D., Nitzan Koren, R. Host-Free Systems for Differentiation of Axenic Leishmania. Methods in Molecular Biology. 1971, 1-8 (2019).
  38. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annual Review of Microbiology. 48, 449-470 (1994).
  39. Dumetz, F., et al. Modulation of Aneuploidy in Leishmania donovani during adaptation to different in vitro and in vivo environments and its impact on gene expression. MBio. 8 (3), e00599-e00517 (2017).
  40. Sinha, R., et al. Genome Plasticity in Cultured Leishmania donovani: Comparison of Early and Late Passages. Frontiers in Microbiology. 9, 1279(2018).
  41. Magalhães, R. D., et al. Identification of differentially expressed proteins from Leishmania amazonensis associated with the loss of virulence of the parasites. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (4), e2764(2014).
  42. Lei, S. M., Romine, N. M., Beetham, J. K. Population changes in Leishmania chagasi promastigote developmental stages due to serial passage. Journal of Parasitology. 96 (6), 1134-1138 (2010).
  43. Ali, K. S., Rees, R. C., Terrell-Nield, C., Ali, S. A. Virulence loss and amastigote transformation failure determine host cell responses to Leishmania mexicana. Parasite Immunology. 35 (12), 441-456 (2013).
  44. Rebello, K. M., et al. Leishmania (Viannia) braziliensis: influence of successive in vitro cultivation on the expression of promastigote proteinases. Experimental Parasitology. 126 (4), 570-576 (2010).
  45. Johns Hopkins Animal Care and Use Program. , The Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee. http://web.jhu.edu/animalcare/index.html (2019).
  46. Titus, R. G., Marchand, M., Boon, T., Louis, J. A. A limiting dilution assay for quantifying Leishmania major in tissues of infected mice. Parasite Immunology. 7 (5), 545-555 (1985).
  47. Lima, H. C., Bleyenberg, J. A., Titus, R. G. A simple method for quantifying Leishmania in tissues of infected animals. Parasitology Today. 13 (2), 80-82 (1997).
  48. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. , (1997).
  49. Sacks, D., Kamhawi, S. Molecular aspects of parasite-vector and vector-host interactions in leishmaniasis. Annual Review of Microbiology. 55, 453-483 (2001).
  50. Reimão, J. Q., et al. Parasite burden in Leishmania (Leishmania) amazonensis-infected mice: validation of luciferase as a quantitative tool. Journal of Microbiological Methods. 93 (2), 95-101 (2013).
  51. Buckley, S. M., et al. In vivo bioimaging with tissue-specific transcription factor activated luciferase reporters. Scientific Reports. 5, 11842(2015).
  52. Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. Journal of Visualized Experiments. (41), e1980(2010).
  53. Roberts, S. C., et al. Arginase plays a pivotal role in polyamine precursor metabolism in Leishmania. Characterization of gene deletion mutants. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23668-23678 (2004).
  54. Boitz, J. M., et al. Arginase Is Essential for Survival of Leishmania donovani Promastigotes but Not Intracellular Amastigotes. Infection and Immunity. 85 (1), e00554(2017).
  55. Rosas, L. E., et al. Genetic background influences immune responses and disease outcome of cutaneous L. mexicana infection in mice. International Immunology. 17 (10), 1347-1357 (2005).
  56. Belkaid, Y., et al. Development of a natural model of cutaneous leishmaniasis: powerful effects of vector saliva and saliva preexposure on the long-term outcome of Leishmania major infection in the mouse ear dermis. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1941-1953 (1998).
  57. Titus, R. G., Ribeiro, J. M. Salivary gland lysates from the sand fly Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science. 239 (4845), 1306-1308 (1988).
  58. Lima, H. C., Titus, R. G. Effects of sand fly vector saliva on development of cutaneous lesions and the immune response to Leishmania braziliensis in BALB/c mice. Infection and Immunity. 64 (12), 5442-5445 (1996).
  59. Theodos, C. M., Ribeiro, J. M., Titus, R. G. Analysis of enhancing effect of sand fly saliva on Leishmania infection in mice. Infection and Immunity. 59 (5), 1592-1598 (1991).
  60. Kaur, S., et al. Effect of dose and route of inoculation on the generation of CD4+ Th1/Th2 type of immune response in murine visceral leishmaniasis. Parasitology Research. 103 (6), 1413-1419 (2008).
  61. Rolão, N., Melo, C., Campino, L. Influence of the inoculation route in BALB/c mice infected by Leishmania infantum. Acta Tropica. 90 (1), 123-126 (2004).
  62. Kébaïer, C., Louzir, H., Chenik, M., Ben Salah, A., Dellagi, K. Heterogeneity of wild Leishmania major isolates in experimental murine pathogenicity and specific immune response. Infection and Immunity. 69 (8), 4906-4915 (2001).
  63. Baldwin, T. M., Elso, C., Curtis, J., Buckingham, L., Handman, E. The site of Leishmania major infection determines disease severity and immune responses. Infection and Immunity. 71 (12), 6830-6834 (2003).
  64. Aoki, J. I., et al. RNA-seq transcriptional profiling of Leishmania amazonensis reveals an arginase-dependent gene expression regulation. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), e0006026(2017).
  65. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. International Journal for Parasitology. 35 (7), 757-764 (2005).
  66. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Experimental Parasitology. 99 (2), 97-103 (2001).
  67. Aoki, J. I., Laranjeira-Silva, M. F., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M. The impact of arginase activity on virulence factors of Leishmania amazonensis. Current Opinion in Microbiology. 52, 110-115 (2019).
  68. Jackson, A. P. The evolution of amastin surface glycoproteins in trypanosomatid parasites. Molecular Biology and Evolution. 27 (1), 33-45 (2010).
  69. Rochette, A., et al. Characterization and developmental gene regulation of a large gene family encoding amastin surface proteins in Leishmania spp. Molecular and Biochemical Parasitology. 140 (2), 205-220 (2005).
  70. Rochette, A., Raymond, F., Corbeil, J., Ouellette, M., Papadopoulou, B. Whole-genome comparative RNA expression profiling of axenic and intracellular amastigote forms of Leishmania infantum. Molecular and Biochemical Parasitology. 165 (1), 32-47 (2009).
  71. Schneider, P., Rosat, J. P., Bouvier, J., Louis, J., Bordier, C. Leishmania major: differential regulation of the surface metalloprotease in amastigote and promastigote stages. Experimental Parasitology. 75 (2), 196-206 (1992).
  72. Ji, J., Sun, J., Qi, H., Soong, L. Analysis of T helper cell responses during infection with Leishmania amazonensis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 66 (4), 338-345 (2002).
  73. Ji, J., Sun, J., Soong, L. Impaired expression of inflammatory cytokines and chemokines at early stages of infection with Leishmania amazonensis. Infection and Immunity. 71 (8), 4278-4288 (2003).
  74. Felizardo, T. C., Toma, L. S., Borges, N. B., Lima, G. M., Abrahamsohn, I. A. Leishmania (Leishmania) amazonensis infection and dissemination in mice inoculated with stationary-phase or with purified metacyclic promastigotes. Parasitology. 134 (12), 1699-1707 (2007).
  75. Laranjeira-Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Floeter-Winter, L. M., Markus, R. P. Melatonin attenuates Leishmania (L.) amazonensis infection by modulating arginine metabolism. Journal of Pineal Research. 59 (4), 478-487 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

وسادة قدم الفأرالليشمانيا الجلديةتطور الآفةتحديد الحمل الطفيليالأميغوتات اللاخلويةالتلقيح تحت أخمص القدممقايسة التخفيف المحدود
في Vivo العدوى مع الأمازون الليشمانيا لتقييم الفش الطفيلي في الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.