مقالة منهجية

نظام ثقافة الرئة المتعددة الأبعاد لنموذج سرطان الرئة الحرشفية

DOI:

10.3791/60644

⸱

مارس 17, 2020

 ,  ,  , 
1Oncology R&D group, Pfizer Worldwide Research and Development

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير نظام نموذج في المختبر لالتقاط التغيرات المعمارية الأنسجة أثناء سرطان الرئة الحرشفية (LUSC) التقدم في ثقافة 3-الأبعاد (3D) المشتركة مع الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). يوفر هذا النظام العضوي منصة فريدة من نوعها للتحقيق في أدوار التغيرات المتنوعة الجوهرية للخلايا السرطانية والخارجية التي تعدل النمط الظاهري للورم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب تفاعلات الورم وستروما دورًا حاسمًا في تطور سرطان الرئة الحرشفي (LUSC). ومع ذلك ، فإن فهم كيفية مساهمة هذه التفاعلات الديناميكية في التغيرات المعمارية للأنسجة التي لوحظت أثناء تكوين الورم لا يزال صعبًا بسبب عدم وجود نماذج مناسبة. في هذا البروتوكول، نصف إنشاء نموذج ثقافة مشاركة ثلاثية الأبعاد باستخدام ثقافة الخلية الأساسية LUSC المعروفة باسم TUM622. تم إنشاء خلايا TUM622 من xenograft المشتقة من المريض LUSC (PDX) ولها خاصية فريدة من نوعها لتشكيل هياكل تشبه acinar عندما بذرت في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. نحن نثبت أن TUM622 acini في الثقافة المشتركة ثلاثية الأبعاد لخص السمات الرئيسية لهندسة الأنسجة أثناء تقدم LUSC بالإضافة إلى التفاعلات الديناميكية بين خلايا LUSC ومكونات البيئة الدقيقة للورم (TME) ، بما في ذلك خارج الخلية مصفوفة (ECM) والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs). كما نقوم بتكييف بروتوكول نا الرئيسي 3D زراعة بيان كيف يمكن استخدام هذا النظام لمختلف التحليلات المصب. وعموما، يخلق هذا النموذج الأورغياني منصة غنية بيولوجيا وقابلة للتكيف تمكن المرء من الحصول على نظرة ثاقبة في الآليات الجوهرية للخلايا والخارجية التي تعزز تعطيل العمارات الظهارية أثناء تطور السرطان وسيساعد البحث عن أهداف علاجية جديدة وعلامات تشخيصية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاء العالم. سرطان الخلايا الحرشفية الرئة (LUSC) ، وهو ثاني أكثر أنواع سرطان الرئة غير الخلايا الصغيرة (NSCLC) ويمثل حوالي 30٪ من جميع سرطان الرئة ، غالبًا ما يتم تشخيصه في مراحل متقدمة ولديه تشخيص ضعيف1. خيارات العلاج للمرضى LUSC هي حاجة رئيسية غير ملباة التي يمكن تحسينها من خلال فهم أفضل للآليات الخلوية والجزيئية الكامنة التي تدفع LUSC الورم.

كما هو الحال مع معظم أنواع السرطان البشرية ، يتميز الإمراض في LUSC بتعطيل بنية الأنسجة الظهارية السليمة والمنظم بشكل جيد2. خلال هذه العملية ، يتم فقدان قطبية الخلايا القاعدية apical المناسبة ، والخلايا الخلية والاتصالات مصفوفة الخلية ، مما يسمح بالنمو غير المنضبط والسلوك الغازي للخلايا السرطانية. ومن الآن على نطاق واسع أن السمات الخبيثة للخلايا السرطانية لا يمكن أن تتجلى دون تفاعل مهم بين الخلايا السرطانية والبيئة الدقيقة للورم المحلي (TME)3. المكونات الرئيسية في TME بما في ذلك مصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) وكذلك الخلايا الفيوليلية والخلايا المناعية المتسللة تشكل بنشاط TME وتدفع الورم4. ومع ذلك، فهمنا الحالي لكيفية تفاعل الخلايا السرطانية وهذه المكونات الرئيسية في TME لدفع التغييرات المعمارية الأنسجة خلال تقدم LUSC محدودة جدا.

الثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) هي أداة هامة لدراسة الأنشطة البيولوجية للتغيرات الجوهرية الخلية والخارجية في تنظيم التغيرات المعمارية الأنسجة في كل من الأنسجة العادية والمريضة5. توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد السياق الهيكلي والوظيفي المناسب الذي عادة ما تفتقر له الثقافات التقليدية ثنائية الأبعاد(2D). الأبعاد المضافة لهذه النظم تحاكي بشكل أوثق الأنسجة في الجسم الحي في العديد من جوانب فسيولوجيا الخلايا والسلوكيات الخلوية ، بما في ذلك الانتشار والتمايز والهجرة والتعبير عن البروتين والاستجابة للعلاج من المخدرات. في السنوات الأخيرة ، أدت الجهود المبذولة من مختبرات مختلفة إلى تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر لكل من الرئة الطبيعية وكذلك NSCLC6،7،8. ومع ذلك ، لم يكن هناك نموذج لسرطان الرئة الحرشفي الذي يمكن تلخيص كل من التغيرات المعمارية الحيوية للأنسجة أثناء تكوين الورم وكذلك دمج المكونات السترومالية الرئيسية.

هنا ، ونحن نصف أساليب لإنشاء رواية 3 الأبعاد (3D) نظام الثقافة المشتركة باستخدام خلايا LUSC الأساسية المشتقة من PDX (يطلق عليها TUM622) وCAFs9،10. يتم اشتقاق كل من TUM622 و CAFs من مريض NSCLC المصاب بأورام متباينة بشكل سيئ10. عندما تكون جزءا لا يتجزأ من الخلايا واحدة في ECM، مجموعة فرعية نادرة من الخلايا TUM622 لديها القدرة على تشكيل organoids مع هياكل تشبه acinar التي تظهر القطبية الخلايا القاعدية apical السليم. هذه الهياكل مثل acinar هي فرط البلاستيك ، وعرض التعبير غير المتجانس من علامات مثل الجذعية والتمايز مماثلة للورم الأصلي في حين تبقى غير الغازية ، وبالتالي تحاكي المرحلة الأولى من التنمية LUSC. الأهم من ذلك، أظهرنا أن بنية الأنسجة من الهياكل مثل acinar يمكن تغييرها عن طريق تثبيط مسارات الإشارات الجوهرية الخلية مع مثبطات جزيء صغير أو إضافة المكونات الرئيسية في ECM مثل CAFs، وهذا الأخير يعزز تشكيل أشيني ويثير كذلك أشيني لتصبح الغازية عندما تكون على مقربة. معا، تشير هذه البيانات إلى أن هذا النظام 3D الثقافة المشتركة من الأعضاء LUSC يوفر منصة قيمة للتحقيق في المعاملة بالمثل الديناميكية بين خلايا LUSC وTME ويمكن تكييفها لرصد استجابة خلايا LUSC للعلاج من المخدرات11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Passaging وزراعة TUM622 الخلايا وCAFs في الثقافات 2D

  1. التصاريح وزراعة الخلايا TUM622
    1. الكواشف الدافئة متوسطة الثقافة والخلايا (انظر جدول المواد)لخلايا TUM622 عند 37 درجة مئوية.
    2. مرور TUM622 الخلايا في 80٪ التقاء في القوارير 2D. عادة، يحدث هذا بعد أسبوع واحد من المرور.
    3. تجاهل المتوسطة القديمة من قارورة T75 وغسل مرة واحدة مع 6 مل من المخزن المؤقت HEPES. تجنب الأنابيب مباشرة على الخلايا.
    4. اسشق المخزن المؤقت HEPES. إضافة 4 مل من التربسين / EDTA (0.25 ملغ / مل ، انظر جدول المواد)لشطف سريع وتجاهل التربسين / EDTA.
    5. إضافة 2 مل من التربسين / EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة. إزالة القوارير من الحاضنة والاستفادة من القوارير لتخفيف الخلايا دون خلق فقاعات الهواء والعودة القوارير إلى الحاضنة لمدة 5 دقيقة إضافية.
      ملاحظة: التعرض لفترات طويلة لالتربسين سوف تلحق ضررا لا رجعة فيه الخلايا وتغيير النمط الظاهري، وبالتالي فمن المستحسن للحد من الخلايا الزمنية التي تتعرض للالتربسين.
    6. تأكيد الخلايا قد انفصلت وانفصلت تحت المجهر الخفيف (4x أو 10x). إضافة 4 مل من المخزن المؤقت التحييد (المخزن المؤقت TNS) (انظر معلومات الكواشف الثقافة الفرعية في جدول المواد)متبوعاً 10 مل من وسط الثقافة ثلاثية الأبعاد (انظر جدول المواد).
    7. ماسيت صعودا وهبوطا بلطف لمزيد من فصل الخلايا باستخدام ماصة 10 مل. نقل التعليق من خلال مصفاة خلية 40 ميكرون إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    8. عد أرقام الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتو أو عداد الخلية الآلي.
    9. البذور 0.8 × 106 خلايا / T75 قارورة في 20 مل من وسط ثقافة 3D (انظر جدول المواد).
    10. إطعام الخلايا كل يومين عن طريق استبدال نصف المتوسط المستهلك مع المتوسطة الطازجة.
  2. تمرير وزراعة CAFs
    1. مرور CAFs عندما تصل الخلايا إلى التقاء. عادة، يحدث هذا بعد 5 أيام من التّسمع من انقسام 1:2.
    2. إعداد CAF المتوسطة باستخدام متوسط القاعديRPMI مع 20٪ مصل الأبقار الجنينية المعطل للحرارة، 1٪ L-الجلوتامين و 1٪ البنسلين / ستريبتومسين. دافئة المتوسطة إلى 37 درجة مئوية.
    3. في قارورة T75، شطف CAFs مع الفوسفات العازلة المالحة (PBS) مرة واحدة ثم إضافة 2 مل من التربسين / EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
    4. لاحظ تحت المجهر الخفيف لضمان انفصال الخلايا في القارورة (4x أو 10x). إذا لم يكن كذلك، تمديد الحضانة لمدة 2-3 دقيقة أخرى.
    5. مرة واحدة وقد فصل الخلايا وتفككت، إضافة 10 مل من متوسط ثقافة 3D لتحييد التربسين / EDTA وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لمزيد من التفكك CAFs.
    6. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتدور لأسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في حجم مناسب من وسط الثقافة 3D (انظر جدول المواد)والمرور إلى اثنين من قوارير T75 الجديدة.

2. طلاء TUM622 الخلايا في مصفوفة خارج الخلية ل3D التبول

  1. في اليوم السابق للتجربة، تذوب قوارير مصفوفة غشاء الطابق السفلي في ثلاجة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. ماسات بلاستيكية التبريد (2 مل) ونصائح في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: ليس كل الكثير من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لديها نفس القدرة على دعم النمو 3D من الخلايا TUM622. ولذلك، فمن الضروري الحصول على واختبار الكثير من مصفوفة غشاء الطابق السفلي لتحديد تلك التي تدعم تشكيل اسينى قوية. وعادة ما يتطلب هذا تركيز بروتين أعلى (16-18 ملغم/مل) في المصفوفة.
  2. في يوم التجربة ، متوسطة الثقافة ثلاثية الأبعاد الدافئة ، العازلة HEPES ، التربسين / EDTA والتربسين تحييد العازلة (TNS) في حمام مائي 37 درجة مئوية. مباشرة قبل إعداد الثقافة، واتخاذ مصفوفة غشاء الطابق السفلي مذاب ة من الثلاجة ووضع القارورة على الجليد.
  3. تبريد لوحات زراعة الأنسجة على برودة منصة معدنية وضعت على الجليد. ضع أنابيب الطرد المركزي على رف تبريد معدني على الجليد.
  4. باستخدام الخلايا TUM622 التي تم الحصول عليها من الخطوة 1.1.7، حساب العدد المطلوب من الخلايا اللازمة للطلاء. عادة، هناك حاجة إلى 15،000-30،000 الخلايا لكل بئر من لوحة 24 جيدا. الكثافة المنخفضة هي أكثر ملاءمة للتصوير والقياس الكمي، في حين يفضل الكثافة العالية عند جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي أو النشاف الغربي.
  5. نقل تعليق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي مبرد (كل أنبوب يحتوي على خلايا للطلاء ثلاثية) وتدور لأسفل في 300 × ز في جهاز طرد مركزي دلو معلقة عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
  6. استنشق الـ supernatant بعناية مع ماصة متصلة بطرف غير مفلتر (20 ميكرولتر) ، تاركًا حوالي 100 ميكرولتر من الوسط في الأنبوب (استخدم علامات على الأنبوب كدليل).
  7. اضغط بلطف على جانب الأنبوب لطرد وفك البيلية قبل إعادته إلى رف التبريد.
  8. باستخدام 2 مل ماصة قبل تبريدها، مزيج بلطف المصفوفة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات مع الحفاظ على قارورة في اتصال مع الجليد. ماصة في سرعة حتى ومعتدلة بحيث يتم إدخال أي فقاعات في المصفوفة خلال هذا الإجراء.
  9. نقل الحجم المناسب للمصفوفة إلى كل أنبوب طرد مركزي. للطلاء ثلاثية في لوحة 24-well، إضافة 1.1 مل من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى كل أنبوب.
  10. باستخدام نصائح ما قبل تبريد، ماصة المصفوفة في كل أنبوب صعودا وهبوطا حوالي 10 مرات لجعل تعليق الخلية موحدة.
  11. نقل 310 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة في كل بئر من لوحة 24-well المبردة مسبقًا. يتم وضع الماصة بزاوية 90 درجة على سطح اللوحة وإضافة التعليق إلى وسط البئر. يجب أن ينتشر التعليق ويغطي البئر بأكمله دون الحاجة إلى إمالة اللوحة.
  12. لتسهيل تحليل الفلورة المناعية في المراحل النهائية، قم بصفالة تعليق الخلية/المصفوفة بالتوازي مع شرائح الغرفة 2-well. نقل 100 ميكرولتر من تعليق الخلية / المصفوفة إلى وسط بئر من شريحة غرفة 2-well (انظر جدول المواد). وهذا يسمح للمصفوفة لتشكيل هيكل يشبه القبة مع حجم أصغر بكثير.
  13. عودة لوحة وغرفة الشريحة مرة أخرى إلى حاضنة زراعة الأنسجة واحتضان لمدة 30 دقيقة للسماح للمصفوفة لترسيخ. فحص لوحة / الشريحة تحت المجهر الخفيفة لضمان أن يتم توزيع خلايا واحدة بالتساوي داخل المصفوفة (4x أو 10x).
  14. إضافة 1 مل من الثقافة 3D ما قبل الحارة متوسطة كاملة في كل بئر و 1.5 مل من 3D ثقافة المتوسطة إلى كل بئر من الشريحة الغرفة ثم إعادتها إلى الحاضنة.

3. 3D Coculturing من الخلايا TUM622 وCAFs في مصفوفة خارج الخلية

  1. إعداد تعليق الخلايا من TUM622 وCAFs وفقا للقسم 2.
  2. عد كثافة الخلية CAF عن طريق اتخاذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية وخلطها مع 10 ميكرولتر من الأزرق trypan.
  3. أضف 10 ميكرولتر من الخليط إلى كل من الغرفتين على مقياس الهيماسي لعد وحساب كثافة الخلية.
    ملاحظة: CAFs لها أشكال غير منتظمة وقد لا يتم حسابها بدقة على عداد خلية تلقائي.
  4. التضمين المشترك لخلايا TUM622 وCAFs في مصفوفة غشاء الطابق السفلي
    1. استناداً إلى معلومات كثافة الخلية، احسب العدد المطلوب من الخلايا المستخدمة في الطلاء. يتم بذر CAFs بنسبة 2:1 من خلايا TUM622. على سبيل المثال، بالنسبة لـ 30,000 خلية TUM622 المصنفة، يتم تضمين 60,000 CAFs.
    2. نقل الحجم المناسب من TUM622 وكذلك CAFs تعليق الخلية في نفس أنبوب الطرد المركزي واتبع الخطوات 2.5-2.11 للطلاء في لوحات 24-well. بالنسبة للفلورية المناعية، قم بنقل 60 ميكرولتر من مزيج TUM622/CAFs إلى شرائح الغرفة كما هو موضح في الخطوة 2.12).
  5. Coculturing TUM622 مع CAFs متراكبة في مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد)
    1. إعداد TUM622 أحادية الثقافة وفقا للخطوات 2.5-2.13.
    2. نقل ضعف عدد تعليق CAFs (مقارنة بعدد خلايا TUM622 المصنفة) إلى أنبوب طرد مركزي والدوران لأسفل عند 300 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. اسشق supernatant وresuspend CAFs في 1 مل من وسط الثقافة 3D.
    4. نقل 1 مل من CAFs تعليق إلى البئر التي تحتوي على الخلايا TUM622 جزءا لا يتجزأ.

4. حصاد TUM622 Acini لاستخراج الحمض النووي الريبي / البروتين وفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)

  1. إعداد العازلة غسل وخلية الحصاد العازلة وفقا لبروتوكول مجموعة حصاد الخلية 3D في اليوم السابق والبرد بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  2. احتفظ بألواح على مبرد طبق يُبوّت وكواشف أخرى على الثلج قبل البدء في عملية الاستخراج.
  3. استعجل وسائل الإعلام من الآبار الثقافة 3D دون لمس المصفوفة وغسل بلطف البئر 3 مرات مع 1 مل من العازلة غسل.
  4. استشير الغسيل النهائي وإضافة 1 مل من خلية الحصاد العازلة إلى كل بئر.
  5. استخدام p1000 تلميح ماصة لكشط مصفوفة الخروج من كل بئر.
  6. ماسيت صعودا وهبوطا لمزيد من فصل المصفوفة.
  7. نقل 1 مل من هذا المزيج إلى أنبوب مخروطي 15 مل مبردة مسبقا. إضافة آخر 1 مل من الحصاد العازلة إلى نفس البئر.
  8. كرر الخطوات 4.5-4.7، ونقل كل مزيج من نفس جيدا في واحد 15 مل أنبوب مخروطي.
  9. كاب الأنابيب والصخور في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  10. ملء كل أنبوب مع الجليد الباردة PBS تصل إلى 10 مل ومن ثم الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  11. يستنشق السوبرناستان دون لمس بيليه. يجب أن يحتوي الـ supernatant على أجزاء مصفوفة ، ولكن يجب جمع جميع الأجزاء الكروية في الجزء السفلي من الأنبوب.
  12. أضف PBS البارد ة للثلج للغسيل الثاني. عكس الأنبوب عدة مرات لفصل بيليه. تدور أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة.
  13. أثناء الغزل، وإعداد العازلة اللايسليس لجمع البروتين والجيش الملكي النيبالي.
  14. يستنشق بعناية supernatant وإضافة العازلة تحليل لمعالجة المصب لجمع البروتين أو الحمض النووي الريبي. وبدلاً من ذلك، يمكن إعادة تعليق الخلايا لتحليل التدفق/فرز القوات المسلحة الكونغولية أو التمرير التسلسلي.

5. الفلور المناعي من TUM622 أشيني

  1. إعداد العازلة المناعية (IF العازلة: PBS مع 0.1٪ بومالفين مصل (BSA)، 0.2٪ تريتون X-100 و 0.05٪ Tween-20)، المخزن المؤقت المنع الأولي (IF المخزن المؤقت مع 10٪ مصل الماعز)، العازلة مانعة الثانوية (المخزن المؤقت المنع الأولي مع 20 ميكروغرام /مل الماعز المضادة للفأرة F (ab')2)
  2. يستنشق المتوسطة من 2-جيدا غرفة الشرائح، شطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وتعيين الشريحة على برودة لوحة معدنية على الجليد. يجب أن تبقى شريحة الغرفة على مبرد اللوحة المعدنية لبقية البروتوكول.
  3. إضافة مبردة مسبقا PFA 4٪ لإصلاح acini واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  4. إزالة 4٪ PFA وغسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني قبل المبردة لكل 5 دقيقة مع هزاز لطيف على الروك.
  5. اسشق برنامج تلفزيوني وpermeabilize مع 1.5 مل من 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني (مبردة مسبقا) لمدة 20 دقيقة. بحلول نهاية هذا الإجراء ، سيصبح الهيكل الشبيهة بالقبة فضفاضًا.
  6. يستنشق المخزن المؤقت permeabilization بلطف من شريحة الغرفة لتجنب فقدان العينة. ويتحقق ذلك عن طريق إضافة طرف رفيع (20 ميكرولتر) إلى ماصة الأنابيب والضغط على الطرف نحو زاوية الغرفة.
  7. غسل ثلاث مرات مع 2 مل من برنامج تلفزيوني قبل المبردة لكل من5 دقيقة مع هزاز لطيف على الروك.
  8. حظر العينة مع المخزن المؤقت حظر الأساسي على الجليد لمدة 1 ساعة.
  9. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر الأساسي وإضافة مخزن مؤقت ثانوي للحظر وكتلة لمدة 30 دقيقة.
  10. إضافة الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت حظر الأولية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز الأجسام المضادة المستخدمة هنا أعلى من المستخدمعادة لتلطيخ الخلايا في الثقافة 2D. يتم تخفيف معظم الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذه الدراسة في 1:100 تخفيف (انظر جدول المواد).
  11. إزالة الأجسام المضادة الأولية وغسل العينة 3 مرات مع 2 مل من العازلة IF الباردة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون العينات فضفاضة، واتخاذ الحذر إضافية عند aspirating.
  12. احتضان العينات في الأجسام المضادة الثانوية المخففة في المخزن المؤقت للحظر الأساسي لساعة واحدة في RT. يجب أن تكون الأجسام المضادة الثانوية المفضلة شديدة الامتصاص عبر للحد من تلطيخ الخلفية. يتم تخفيف معظم الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في هذه الدراسة في تخفيف 1:200.
  13. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وغسل العينة 3 مرات مع 2 مل من العازلة IF الباردة.
    ملاحظة: يمكن أن تكون العينات فضفاضة، واتخاذ الحذر إضافية عند aspirating.
  14. إضافة برنامج تلفزيوني مع DAPI (1:1,000 تخفيف) خلال غسل الماضي لوصمة عار النواة. أداء آخر 2 يُسَلّف في برنامج تلفزيوني.
  15. صورة العينات على المجهر البؤري في غضون 3 أيام.
    ملاحظة: نظرًا لحجم الأجهزة وحدود مسافة عمل الهدف ، عادة ما يتم صورة العينات بمعدل تكبير 10x أو 20x.

6. إعداد عينات الثقافة ثلاثية الأبعاد للكيمياء المناعية

  1. اسشق المتوسطة من 2-جيدا غرفة الشرائح وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  2. إصلاح الثقافات 3D في 4٪ PFA في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. إزالة 4٪ PFA، والثقافات المحيطة مع 2.5 مل من هلام عينة الأنسجة (انظر جدول المواد)ووضع الشريحة في 4 درجة مئوية لترسيخ لمدة ساعة واحدة على الأقل.
  4. نقل عينات محاطة هلام عينة الأنسجة إلى أشرطة الأنسجة ومعالجتها في معالج عينة الأنسجة الآلي بين عشية وضحاها.
  5. تضمين العينات في شمع البارافين والاستعداد للقسم12.

7. 3D السمية الخلويه فحص للفحص المركب (مثال للوحة واحدة 96 جيدا)

  1. قم بتعيين لوحة 96 بئرًا على مبرد لوحة، وخزان 25 مل على مبرد خزان وأنابيب مخروطية 15 مل على الجليد قبل بدء التجربة.
  2. إعداد تعليق مصفوفة الخلية من الخلايا TUM622 في أنبوب البولي بروبلين 15 مل المبردة مسبقا مخروطية عن طريق إضافة الحجم المناسب من مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الخلايا. الكثافة المطلوبة لخلايا TUM622 هي 10000 خلية لكل 70-75 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. ماسيت صعودا وهبوطا عدة مرات للسماح حتى خلط الخلايا داخل المصفوفة.
  3. نقل لوحة مع برودة لوحة وخزان مع برودة خزان بعيدا عن الجليد إلى سطح جاف لتجنب اتصال مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع الجليد أثناء النقل.
  4. نقل خليط خلية المصفوفة إلى خزان التبريد دون خلق فقاعات.
  5. باستخدام ماصة ميكانيكية متعددة القنوات (10-300 ميكرولتر)، نقل 70-75 ميكرولتر من خلايا المزيج إلى كل بئر مناسب من لوحة 96 بئر.
  6. لوحة احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لمدة 30 دقيقة لمصفوفة غشاء الطابق السفلي لترسيخ.
  7. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط في جميع الصفوف وأعد اللوحة إلى الحاضنة.
  8. بدء الدوس المركب في اليوم التالي أو في وقت لاحق اعتمادا على الهدف من التجربة.
  9. يمكن إعادة تغذية Spheroids وإعادة مُدوّنها كل 2-3 أيام لمدة تصل إلى 10 أيام ، عن طريق إزالة الوسائط المستهلكة مع مشعب فراغ 8 أو 12 بئرًا واستبداله بوسائط جديدة مع أو بدون المركبات المطلوبة.
  10. يمكن قياس عدد الكرويدات TUM622 باستخدام الصور ثلاثية الأبعاد وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TUM622 وCAFs في الثقافة 2D
يعرض الشكل 1 الشكل النموذجي لخلايا TUM622 وCAFs في الثقافة 2D. يتم تقريب خلايا TUM622 مع نواة كبيرة في حين CAFs مسطحة وممدودة. يمكن أن تصل خلايا TUM622 إلى 80٪ -90٪ التقاء في الثقافة. ويؤدي المزيد من الانتشار إلى المزيد من الخلايا الصغيرة المجمعة في مستعمرات لا تلامس هاوية مباشرة. وعلى النقيض من ذلك، تفضل الخلايا المرتفعة الكثافة أن تنمو بكثافة أعلى من الخلايا وستستمر في التكاثر عند التقاء كامل إذا تم توفير ما يك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأورام هي أنسجة غير متجانسة تتكون من الخلايا السرطانية تتعايش جنبا إلى جنب مع الخلايا المترالية مثل الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والخلايا الفيوذيلية والخلايا المناعية داخل ECM. معا، هذه المكونات المتنوعة عبر الحديث والتأثير على البيئة الدقيقة الورم، ولعب دور نشط في دفع الورم، وهي العملية التي تنطوي على تغييرات تدريجية في الهندسة المعمارية الورم. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون نموذج المختبر لتطوير الورم قادرًا على التقاط التغيرات المعمارية الديناميكية للأنسجة التي لوحظت في الأورام البشرية في الجسم الحي ، والتفاعل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصاحبا البلاغ هما موظفون ومساهمون في شركة فايزر

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ماغالي غوفروي، وجون كريغر، وستيفاني بيسولكو من مجموعة علم الأمراض الأنسجة في شركة فايزر-الأورام ومجموعة العلامات البيولوجية لدعم علم الأمراض/الأنسجة ومايكل أرينزمان للمراجعة النقدية للمخطوطة. كما نشكر برنامج ما بعد الدكتوراه من Pfizer ومجموعة البحث والتطوير في مجال الأورام، وعلى وجه التحديد روبرت أبراهام، وبوجا سابرا، وكارين ويدبين، وجنيفر تيجيدا على دعمهم للبرنامج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نمو ظهارة الشعب الهوائية متوسطLonzaCC-3170BEGM
مصفاة خلية 40umThermoFisher352340لتمرير خلايا TUM622
Cparkd Caspase 3تقنية إشارات الخلاياالمضادة 9661 (RRID: AB_2341188)Rabbit
CoolRack CFT30BiocisionBCS-138لثقافة ثلاثية الأبعاد
CoolSink XT96FBiocisionBCS-536للثقافة ثلاثية الأبعاد
Cultrex 3D Cell Harvesting KitBio-Techne3448-020-K
Cultrex (مفضل للثقافة المشتركة)Bio-Techne3443-005-01للثقافة ثلاثية الأبعاد
الجسم المضاد CXCR4AbcamAb124824 (RRID: AB_10975635)الأرانب
E-cadherin الأجسام المضادةBD Biosciences610182 (RRID: AB_397581)الماوس
GelCountOxford Optronixلأعداد وقياسات Acini
الأجسام المضادة GM130BD Biosciences610822 (RRID: AB_398141)
مختبرات ناقلاتمصل الماعزS1000 (RRID: AB_2336615)للتألق المناعي
FBSGibco10082-147لجل عينة الأنسجة CAFs
ريتشارد آلان ScientificHG-4000-012للتألق المناعي
Integrin alpha 6Millipore SigmaMab1378 (RRID: AB_2128317) الجسم
المضاد للجرذ InvolucrinAbcam Ab68(RRID: AB_305656)الفأر
Ki67 الجسم المضادAbcam Ab15580(RRID: AB_443209) Rabbit
Lab-Tec II chambered # 1.5 نظام الغطاء الألمانيNalge Nunc International155379 (2)لثقافة 3D
Lab-Tec II غرفة # 1.5 نظام الغطاء الألمانيNalge Nunc International155409 (8)للثقافة ثلاثية الأبعاد
L-GlutamineGibco25030-081ل CAFs
Matrigel (مفضل للثقافة الأحادية)Corning 356231لثقافة 3D
p63 تقنية إشارات الخلية للجسم المضاد13109 (SRRID: AB_2637091)
قلم أرنب / StrepGibco15140-122لكواشف CAFs
كواشف الزراعة الفرعية LonzaCC-5034لتفكك الخلايا TUM622
RPMIThermoFisher11875-093لتقنية
إشارات خليةالأجسام المضادةSox2 3579 (RRID: AB_2195767)Rabbit
TrypLE ExpressGibco12604-021لتفكك CAF
Vi-CellBechman Coulterالتلقائي عداد الخلايا
Vimentin الجسم المضادAbcamAb92547 (RRID: AB_10562134) Rabbit
& beta & cateninتقنية إشارات الخلايا2677s (RRID: AB_1030943)الماوس
للجسم المضاد CAFs

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization of squamous cell lung cancers. Nature. 489 (7417), 519-525 (2012).
  2. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of Extracellular Matrix, Scaffolds, and Signaling: Tissue Architecture Regulates Development, Homeostasis, and Cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (1), 287-309 (2006).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. Journal of Cell Science. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  5. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116 (Pt 12), 2377-2388 (2003).
  6. Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. Human bronchial epithelial cells differentiate to 3D glandular acini on basement membrane matrix. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 44 (6), 914-921 (2011).
  7. Godugu, C., Singh, M. AlgiMatrix-Based 3D Cell Culture System as an In Vitro Tumor Model: An Important Tool in Cancer Research. Methods in Molecular Biology. 1379, 117-128 (2016).
  8. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511(2014).
  9. Chen, S., et al. Cancer-associated fibroblasts suppress SOX2-induced dysplasia in a lung squamous cancer coculture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), E11671-E11680 (2018).
  10. Damelin, M., et al. Delineation of a cellular hierarchy in lung cancer reveals an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Cancer Research. 71 (12), 4236-4246 (2011).
  11. Sapra, P., et al. Long-term tumor regression induced by an antibody-drug conjugate that targets 5T4, an oncofetal antigen expressed on tumor-initiating cells. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (1), 38-47 (2013).
  12. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, pdb.prot4989(2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TUM622

مقالات ذات صلة