مقالة منهجية

تحديد مثبطات التفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام الفحص التحليلي المنقسم

DOI:

10.3791/60652

⸱

ديسمبر 21, 2019

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Graduate School of Medicine, The University of Tokyo, 2Research Fellow of Japan Society for the Promotion of Science

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم طريقه لفحص العوامل الفيروسية المضادة للتهاب الكبد B التي تمنع تفاعل HBx-DDB1 باستخدام نظام المقايسة الخاص بالانقسام. هذا النظام يسمح بسهوله الكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين وهو مناسب لتحديد مثبطات مثل هذه التفاعلات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك حاجه ماسه للعوامل العلاجية الجديدة للعدوى بفيروس التهاب الكبد B (HBV). علي الرغم من ان النظائر المتوفرة حاليا النيونوس (t) ide تمنع النسخ المتماثل الفيروسية ، فانها ليس لها تاثير مباشر علي التعبير عن البروتينات الفيروسية المنقولة من الحمض النووي الفيروسي الدائري المغلق (cccDNA). كما تحميل مستضد الفيروسية عاليه قد تلعب دورا في هذا السرطان المزمنة وذات الصلة HBV, الهدف من العلاج HBV هو القضاء علي البروتينات الفيروسية. HBV البروتين التنظيمية X (HBx) بربط البروتين الحمض النووي المضيف الضرر الملزمة 1 (DDB1) البروتين لتتحلل الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، مما ادي إلى تفعيل النسخ الفيروسي من cccDNA. هنا ، باستخدام نظام الفحص المتكامل لمسح البيانات ، نقدم نظاما شاملا للفحص المركب للتعرف علي مثبطات تفاعل HBx-DDB1. بروتوكولنا يتيح الكشف السهل لديناميكيات التفاعل في الوقت الحقيقي داخل الخلايا الحية. قد تصبح هذه التقنية فحصا رئيسيا لاكتشاف العوامل العلاجية الجديدة لعلاج عدوي HBV.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيروس التهاب الكبد B (HBV) العدوى هي مصدر قلق رئيسي في مجال الصحة العامة في جميع انحاء العالم ، مع التقديرات السنوية 240,000,000 الأشخاص المصابين بامراض مزمنة مع HBV و 90,000 الوفاات بسبب مضاعفات العدوى ، بما في ذلك تليف الكبد وسرطان الخلايا الكبدية (اتش سي سي)1. علي الرغم من ان العوامل العلاجية المضادة لHBV الحالية, النيونوس (ر) نظائرها ide, تمنع بما فيه الكفاية النسخ العكسي الفيروسية, انها نادرا ما تحقيق القضاء علي البروتينات الفيروسية, وهو الهدف السريري علي المدى الطويل. تاثيرها الفقراء علي القضاء علي البروتين الفيروسي ويرجع ذلك إلى عدم وجود تاثير مباشر علي النسخ الفيروسية من الفيروسات الفيروسية بشكل دائري مغلقه الحمض النووي (cccDNA) minichromosomes في نواه الخلايا الكبدية2.

يتم تنشيط النسخ HBV من قبل HBV التنظيمية X (HBx) البروتين3. وكشفت الدراسات الحديثة ان hbx يحط من الصيانة الهيكلية لكروموسومات 5/6 (Smc5/6) ، وهو عامل تقييد المضيف الذي يمنع HBV النسخ من cccdna ، عن طريق اختطاف DDB1-CUL4-ROC1 E3 اوبيكويتين يغاز مجمع4،5،6. ولذلك ، ويعتقد ان خطوه حاسمه في تعزيز النسخ الفيروسي من cccDNA هو التفاعل HBx-DDB1. المركبات القادرة علي تثبيط الربط بين hbx و DDB1 قد منع النسخ الفيروسية ، وفي الواقع تم تحديد نيتازوكسانيد كمثبط للتفاعل hbx-DDB1 عن طريق نظام الفرز المتقدمة في المختبر لدينا7.

هنا ، ونحن نقدم نظام الفرز لدينا مريحه تستخدم لتحديد مثبطات التفاعل hbx-DDB1 ، والتي تستخدم المقايسة التكميلية الانقسام لوسيفيراز7،8. وتنصهر وحدات الوحدات الفرعية لتقسيم لوسيفيراز إلى hbx و DDB1 ، ويجلب تفاعل hbx-DDB1 الوحدات الفرعية إلى القرب القريب لتشكيل انزيم وظيفي يولد اشاره مضيئه ساطعه. وبما ان التفاعل بين الوحدات الفرعية قابل للعكس ، فان هذا النظام يمكنه الكشف بسرعة عن البروتينات DDB1 (الشكل 1). وباستخدام هذا النظام ، يمكن فحص مكتبه مجمعه كبيره بسهوله ، مما قد يؤدي إلى اكتشاف مركبات جديده قادره علي تثبيط تفاعل DDB1 بكفاءة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظه: يبين الشكل 1(ا) التمثيل التخطيطي لفحص البيانات التحليلية المجزاه ، وترد عمليه الفحص في الشكل 1باء. ويمكن قياس ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي دون تحلل الخلية.

1. اعداد الخلية

  1. الحفاظ علي الخلايا الHEK293Tه المستزرعة في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM) تستكمل مع 10 ٪ v/v الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1x البنسلين/ستربتوميسين في 37 درجه مئوية في 20 ٪ O2 و 5 ٪ CO2.
  2. بذور 5 × 106 خلايا في صحن 100 ملم مع 10 مل من dmem واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
  3. Transfect عابره 1 ميكروغرام من HBx و DDB1 مع الluciferases الانقسام في الخلايا وفقا للأسلوب التالي.
    ملاحظه: قد يعتمد مبلغ الحمض النووي البلازميد علي الوصي المستخدم. يجب تحديد الوضع الأمثل لانقسام لوسيفيراز إلى البروتين المستهدف مسبقا. في هذه الحالة, hbx تنصهر إلى lgbit في C-المحطة من hbx (hbx-lgbit) و DDB1 تنصهر إلى smbit في N-تيرمينوس من DDB1 (smbit-DDB1) قدمت أفضل النتائج (اي, ألمع إشارات لوسيفيراز). وقد تم الإبلاغ عن هذه العملية سابقا بالتفصيل7.
    1. تمييع 1 ميكروغرام من hbx-lgbit التعبير عن البلازميد الحمض النووي و 1 ميكروغرام من smbit-DDB1 التعبير عن الحمض النووي البلازميد (جدول المواد) في العازلة الحمض النووي التكثيف (جدول المواد) إلى حجم إجمالي 300 μl.
    2. أضافه 16 μL من حل محسن (جدول المواد) ومزيج من vortexing ل 1 s.
    3. احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 3 دقائق.
    4. أضافه 60 μL من الكاشف ترانسفيكشن (جدول المواد) إلى العينة ومزيج من قبل vortexing ل 10 s.
    5. احتضان العينة في درجه حرارة الغرفة لمده 8 دقائق.
    6. اثناء الحضانة ، يستنشق الوسط الثقافي من الطبق (أعدت في الخطوة 1.2) ، ويغسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة (تلفزيوني). أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح وأضافه 7 مل من DMEM.
    7. أضف 3 مل من DMEM إلى الأنبوب الذي يحتوي علي المجمعات الناقلة. اخلطيها بالأنابيب واضفي المجمعات الناقلة إلى الخلية في طبق 10 سم.
  4. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية في حاضنه تحت 5 ٪ CO2 لمده 10 ساعة.
  5. Reseed الخلايا في لوحه بيضاء 96 جيدا في 5 × 104 خلايا/بئر في 50 μl متوسطه/جيدا وفقا للأسلوب التالي.
    1. أزلت ال ينفق خليه ثقافة متوسطه ويغسل خلايا مع 5 [مل] من [ببس].
    2. أزاله تلفزيوني عن طريق الطموح ، أضافه 1 مل من 0.25 ٪ تريبسين-أدتا ، واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق لفصل الخلايا.
    3. أضافه 4 مل من DMEM وتفريق المتوسطة عن طريق التنضيد علي سطح طبقه الخلية عده مرات. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب.
    4. خلايا الطرد المركزي في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    5. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من تلفزيوني.
    6. الطرد المركزي تعليق الخلية في 500 x g لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة وتجاهل supernatant.
    7. تمييع الخلية بيليه مع مخزنه الخلية المتوسطة الثقافة (الجدول من المواد) تستكمل مع 10 ٪ لكثافة البذر من 1.0 x 106 خلايا/مل.
    8. ماصه 50 μL من تعليق الخلية في كل بئر من لوحه جيده 96 وأعاده الخلايا إلى الحاضنة.
  6. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية تحت 5 ٪ CO2 لمده 10 ساعة.

2. الفحص المركب

  1. اثناء الحضانة ، تمييع مركبات الفحص (جدول المواد) والمذيبات (ثنائي ميثيل سولفوكسيد [dmso]) في تركيز 13.5 x. علي سبيل المثال ، إذا كان المخزون هو 10 ملم وتركيز الفرز هو 10 μM ، أضافه 1 μL من الحل الأسهم إلى 73.1 μL من المتوسطة الخلية الثقافة.
  2. أضافه 12.5 μL من الركيزة الاناره (جدول المواد) إلى كل بئر واحتضان لمده 5 دقائق في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: كما الضوابط السلبية ، ينبغي ان الآبار في كلا طرفي لوحه (اي ، الاعمده 1 و 12) لا تحتوي علي الركيزة الاناره.
  3. قياس التلالؤ الأساسي باستخدام مقياس الاناره (جدول المواد).
  4. مباشره بعد القياس الاولي ، أضافه 5 μL من المركبات والتحكم DMSO المخفف في الخطوة 2.1 إلى كل بئر.
    ملاحظه: سيكون التركيز النهائي 10 μM.
  5. قياس قيم التلالؤ كل 30 دقيقه لمده 2 ساعة.
    ملاحظه: يجب احتضان لوحه في الظلام في درجه حرارة الغرفة.
  6. حساب الآثار المثبطة بالمقارنة مع السيطرة DMSO العلاج بعد التطبيع إلى إشارات خط الأساس.
    ملاحظه: يمكن ان يؤدي فحص كل مركب في تكرار أو ثلاث نسخ إلى تقليل التباين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وترد النتائج التمثيلية بعد استخدام هذا البروتوكول في الشكل 2الف وباء. وكانت نسبه الاشاره إلى الخلفية أكبر من 80 وكان عامل Z '9 (مؤشر الجودة القياسي الذهبي للفحص العالي الانتاجيه) أكبر من 0.5 ، مما يشير إلى ان نظام الفحص هذا كان مقبولا للفحص العالي الانتاجيه. مع تعيين عتبه > 40 ٪ تثبيط مقارنه مع السيطرة (dmso فقط) ، حددنا نيتازوكسانيد كدواء مرشح7. باستخدام هذا النظام ، يمكن العثور علي أفضل الا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قمنا بتطوير طريقه فحص مريحه باستخدام اختبار المسح الذي تم تقسيمه للعثور علي مثبطات DDB1 الملزمة من HBx. ويمكن الكشف عن ديناميات التفاعل في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية دون الحاجة إلى تحلل الخلية. تثبيط التفاعل HBx-DDB1 يؤدي إلى استعاده Smc5/6 ، مما يؤدي إلى قمع النسخ الفيروسية ، والتعبير عن البروتين ، و cccDNA الإنتاج7. هذه اليه الجديدة للعمل المضاد للفيروسات قد تتغلب علي أوجه القصور في علاجات HBV الحالية.

علي الرغم من ان هناك عددا من الطرق المتاحة للتحقيق في تفاعلات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حظي هذا العمل بدعم من المنح المساعدة المقدمة من وزاره التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا واليابان (#19H03430 و #17K09405 إلى الأسلوب الذي و#19J11829 إلى K.S.) ، من خلال منحه المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره (#18H05024 إلى الأسلوب) ، من قبل برنامج البحوث المتعلقة بالتهاب الكبد من الوكالة اليابانية للبحوث الطبية والتنمية ، AMED (إلى الأسلوب ، #JP19fk021005) ، من خلال برنامج التنمية المبتكرة وتطبيق الادويه الجديدة للتهاب الكبد #JP19fk0310102 المؤسسة اليابانية لانزيمات التطبيقية ومن مؤسسه كوباياشي لأبحاث السرطان (إلى الأسلوب) ، من قبل GSK اليابان منحه البحوث 2018 (إلى K.S.) ، ومنحه من مؤسسه ميياكاوا للبحوث التذكارية (إلى K.S.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صفيحة مجهرية لزراعة الخلايا ، 96 بئر ، PS ، F-bottomGreiner-Bio-One GmbH655098
DMEMSigma AldrichD6046
DMSOTocris Bioscience3176
كاشف تعداء EffecteneQiagen301425يتضمن المخزن المؤقت لتكثيف الحمض النووي ومحلول محسن وكاشف التعداء
FBSNichirei175012
GloMax 96 ميكرولويت لومينومترPromegaE6521
HBx & ndash ؛ LgBit يعبر عن بلازميد الحمض النوويمختبرنامتاح عند الطلب
HEK293T الخلايامجموعة الثقافة من النوع الأمريكيCRL-11268
أنظمة بدء تشغيل NanoBiT PPIيتضمن PromegaN2015كاشف الخلايا الحية Nano-Glo
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021الموصوفة بأنها "وسط زراعة الخلايا المخزنة" في المخطوطة
PBSTakaraT900
Penicillin-StreptomycinSigma AldrichP0781
Screen-Well مكتبة الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية V2 الإصدار 1.0Enzo Life SciencesBML-2841كانت المركبات المستخدمة هنا على النحو التالي: الميكينول ، هيدرات المركابتوبورين ، ميسنا ، ميسترانول ، ميتابروتيرينول هيميسولفات ، ميتارامينول بيتارترات ، ميتاتالون ، كلوريد الميثاكولين ، الميثازولاميد ، ميثينامين هيبورات ، ميثوكاربامول ، ميثوتريكسات ، ميثوكسالين ، ميثسكوبولامين بروميد ، ميثسوكسميد ، ميثيكلوثيازيد ، ميثيل أمينوليفولينات & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، ميثيل يرجونوفين ماليات ، ميتولازون ، ميتيرابون ، مكسيليتين & ميددوت ؛ حمض الهيدروكلوريك ، الميكافيونين ، ميكونازول ، ميدودرين & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، ميجليتول ، ميلناسيبران & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، ميرتازابين ، ميتوتان ، موإكسيبريل & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، موميتازون فوروات ، موبيروسين ، نادولول ، نافسيلين & middot ؛ Na ، naftifine · ؛ حمض الهيدروكلوريك ، ناراتريبتان & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، الناتاميسين ، نيبيفولول & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، نيلارابين ، نيبافيناك ، نيفيرابين ، نياسين ، نيكوتين ، نيلوتينيب ، نيلوتاميد ، نيتازوكسانيد ، نيتيسينون ، نيتروفورانتوين ، نيزاتيدين ، نورتريبتيلين & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، أولسالازين & middot ؛ Na ، أورليستات ، أوكسابروزين ، أوكسترفيلين ، أوكسي بيوتينين كلوريد ، أوكسي تتراسيكلين & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، باليبيريدون ، بالونوسترون & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، كبريتات باروموميسين ، بازوبانيب & middot ؛ حمض الهيدروكلوريك ، ثنائي الصوديوم بيميريكسيد ، بيميرولاست البوتاسيوم ، البنسيلامين ، البنسلين جي البوتاسيوم ، البنتاميدين إيزيثيونات ، البنتوستاتين ، بيريندوبريل إربومين ، بيرميثرين ، بيرفينازين ، كبريتات فينيلزين ، فينيليفرين ، فيتوناديديون ، بيميكروليموس ، بيتافاستاتين الكالسيوم ، وبودوفيلوكس
سمبيت & - نداش. DDB1 يعبر عن بلازميد الحمض النوويمختبرنامتاح عند الطلب
Trypsin-EDTASigma AldrichT4049

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, L. S. Y., Covert, E., Wilson, E., Kottilil, S. Chronic hepatitis B infection: a review. The Journal of the American Medical Association. 319, 1802-1813 (2018).
  2. Sekiba, K., et al. Hepatitis B virus pathogenesis: Fresh insights into hepatitis B virus RNA. World Journal of Gastroenterology. 24, 2261-2268 (2018).
  3. Slagle, B. L., Bouchard, M. J. Hepatitis B virus X and regulation of viral gene expression. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 6, a021402(2016).
  4. Murphy, C. M., et al. Hepatitis B Virus X Protein Promotes Degradation of SMC5/6 to Enhance HBV Replication. Cell Reports. 16, 2846-2854 (2016).
  5. Decorsière, A., et al. Hepatitis B virus X protein identifies the Smc5/6 complex as a host restriction factor. Nature. 531, 386-389 (2016).
  6. Niu, C., et al. The Smc5/6 complex restricts HBV when localized to ND10 without inducing an innate immune response and is counteracted by the HBV X protein shortly after infection. PLoS One. 12, e0169648(2017).
  7. Sekiba, K., et al. Inhibition of HBV Transcription From cccDNA With Nitazoxanide by Targeting the HBx-DDB1 Interaction. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7, 297-312 (2019).
  8. Eggers, C. T., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11, 400-408 (2015).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  10. Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. Protein-protein interaction detection: Methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014. 2014, 147648(2014).
  11. Michael, S., et al. A Robotic Platform for Quantitative High-Throughput Screening. ASSAY and Drug Development Technologies. 6, 637-657 (2008).
  12. Skwarczynska, M., Ottmann, C. Protein-protein interactions as drug targets. Future Medicinal Chemistry. 7, 2195-2219 (2015).
  13. de Chassey, B., Meyniel-Schicklin, L., Vonderscher, J., André, P., Lotteau, V. Virus-host interactomics: New insights and opportunities for antiviral drug discovery. Genome Medicine. 6, 115(2014).
  14. Prasad, M., et al. Virus-Host Interactions: New Insights and Advances in Drug Development Against Viral Pathogens. Current Drug Metabolism. 18, 942-970 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HBx DDB1 InteractionSplit Luciferase AssayCompound ScreeningProtein Protein InteractionHBV Therapeutic AgentsHEK293T Cell TransfectionLuminescence MeasurementZ Prime ScoreNitazoxanide InhibitionReal Time Detection

مقالات ذات صلة