يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش

7.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60671

⸱

مارس 3, 2020

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis, 2Integrative Genetics and Genomics Graduate Group, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

ينتشر السطح النووي هي أداة لا غنى عنها لدراسة الأحداث الكروموسومية أثناء الداء الميوي. هنا نُظهر طريقة لإعداد وتصور الكروموسومات الميوتيكية خلال المرحلة الأولى من الحيوانات المنوية من سمك حمار وحشي.

الملخص

Meiosis هو العملية الخلوية الرئيسية المطلوبة لإنشاء gametes haploid للتكاثر الجنسي. وقد كانت الكائنات الحية النموذجية مفيدة في فهم أحداث الكروموسوم التي تحدث خلال المرحلة المتوسطة، بما في ذلك الاقتران، وتشبج الاشتباك العصبي، والأحداث إعادة التركيب التي تضمن الفصل الكروموسومي السليم. في حين أن الماوس كان نموذجا هاما لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات ، وليس كل الأحداث meiotic في هذا النظام هي مماثلة لmeiosis الإنسان. لقد أظهرنا مؤخرًا الإمكانات المثيرة لسمك الحمار الوحشي كنموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. هنا نصف، بالتفصيل، أساليبنا لتصور الكروموسومات ميوتيك والبروتينات المرتبطة بها في الاستعدادات انتشار الكروموسوم. هذه الاستعدادات لديها ميزة السماح تحليل عالية الدقة من هياكل الكروموسوم. أولاً، نصف إجراء تشريح الخصيات من سمك الحمار الوحشي البالغ، يليه انفصام الخلايا، تحلل، وانتشار الكروموسومات. بعد ذلك ، نصف إجراء الكشف عن توطين بروتينات الكروموسومات المتوسطة ، عن طريق الكشف عن الفلور المناعي ، وتسلسل الحمض النووي ، عن طريق التهجين في الموقع (FISH). وتشمل هذه التقنيات مجموعة مفيدة من الأدوات للتحليل الخلوي لبنية الكروماتين ميوتيكية في نظام حمار وحشي. وينبغي أن يكون الباحثون في مجتمع سمك الحمار الوحشي قادرين على إتقان هذه التقنيات بسرعة ودمجها في تحليلاتهم القياسية للوظيفة الإنجابية.

المقدمة

الإنجاب الجنسي يستمر من خلال الجمع بين اثنين من الملة haploid، كل تحمل نصف الكروموسوم تكملة خلية جسدية. Meiosis هو قسم الخلايا المتخصصة التي تنتج الملة haploid من خلال جولة واحدة من تكرار الحمض النووي وجولتين متتاليتين من الفصل الكروموسوم. في المرحلة الأولى ، يجب أن تخضع الكروموسومات المتجانسة (homologs) للاقتران وإعادة التركيب والمشبك ، ويتميز هذا الأخير بتكوين مجمع synaptonemal الذي يتكون من محورين متجانسين يتم جسرهما بواسطة خيوط العرضية ، Sycp1(الشكل 1A ، B). الفشل في تنفيذ هذه العمليات بشكل صحيح يمكن أن يؤدي إلى إنتاج gametes aneuploid ، والتي هي السبب الرئيسي للإجهاض في البشر1. وقد تم تسهيل معرفتنا بالتنسيق بين الاقتران وإعادة التركيب والمشبك من خلال الدراسات في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، مثل الخميرة ، C. elegans، الماوس ، وDrosophila، من بين أمور أخرى2. في حين أن العملية العامة لاقتران الكروموسوم المتجانس تليها العزل يتم الحفاظ عليها بشكل جيد ، فإن اعتمادها على إعادة التركيب والمشبك ويختلف ترتيب هذه الأحداث.

Meiotic كسر حبلا مزدوجة (DSB) تشكيل، الذي يبدأ إعادة تركيب متجانسة، يحدث بالقرب من التيلوميرات تتجمع في باقة خلال اللبتوتين ومتشابك الاشتباك العصبي تستتبعه بعد وقت قصيرمن 3،4. هذا التكوين من تشكيل DSB وبدء المشبك هو أيضا سمة من سمات meiosis الذكور في البشر ولكن ليس في الماوس5،6،7،8، مما يشير إلى أن حمار وحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. وهناك أيضا العديد من المزايا العملية لدراسة الحمار الوحشي meiosis. يخضع كل من الذكور والإناث لتولد الخلايا في مرحلة البلوغ، ويمكن الوصول إلى الغدد التناسلية بسهولة، ويتم توليد المئات من النسل من صليب واحد. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الأجنة شفافة وتتطور خارجيًا ، مما يسهل الكشف المبكر عن الانحرافات في النمو الجنيني بسبب الملة الأنيوبلويد3،9. مساوئ استخدام حمار وحشي هي أنها بطيئة للوصول إلى النضج الجنسي (~ 60 يوما) ويجب جمع كمية المواد اللازمة لينتشر السطح النووي من الحيوانات البالغة ~ 10-20 ، اعتمادا على حجمها.

تعد مستحضرات انتشار الكروموسوم اتّهات أداة حيوية لدراسة ديناميكيات الكروموسوم عبر جميع الكائنات الحية النموذجية، حيث يمكن استكشاف التواقيع الرئيسية لديناميكيات الكروموسومات المتوسطة. في حمار وحشي ، تم تشريح الجوانب الرئيسية لتطور البرنامج meiotic والمنظمة النووية من خلال استكشاف ينتشر السطح النووي ، ويشار إليه هنا باسم ينتشر الكروموسوم ، مع الأجسام المضادة للكشف عن الفلور المناعي للبروتينات و / أو الأحماض النووية من قبل FISH3،4،9،10،11،12. في الواقع ، يمكن الحفاظ على توطين الاستقطاب من التيلوميرات المجمعة في باقة في إعداد انتشار(الشكل 1C). في الآونة الأخيرة ، استخدمنا كروموسوم الحيوانات المنوية الحمار الوحشي ينتشر جنبا إلى جنب مع طرق الكشف عن الفلورسوووإكسينس والمجهر الفائق الدقة لتوضيح التقدم التفصيلي لديناميكيات تيلومير حمار وحشي ، اقتران كروموسوم متجانس ، توطين كسر حبلا مزدوج ، وتشابك الاشتباك العصبي في التحولات الرئيسية meiotic3. هنا نقدم طرق لإعداد ينتشر الكروموسوم من الحيوانات المنوية من الخصيتين حمار وحشي ووصمها في وقت لاحق مع الفلورسنت الببتيد النووي (السلطة الوطنية الفلسطينية) تحقيقات لتسلسل التيلومير المتكرروالكشف عن الفلوروسوم البروتينات المرتبطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الأساليب التي تنطوي على حمار وحشي باستخدام المعايير الأخلاقية المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة كاليفورنيا في ديفيس.

1. إجراء انتشار الكروموسوم

ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لإنشاء 4-6 شرائح، مع مئات من النوى ميوتيك انتشار لكل شريحة. وستتوقف أعداد الخصيات المستخدمة على حجم السمك. نتوقع استخدام 20 الحيوانات في ~ 60 يوما بعد الإخصاب (dpf) و 15 الحيوانات في ~ 6 أشهر بعد الإخصاب (mpf). بالنسبة لسمك الحمار الوحشي الكبير (على سبيل المثال، 12 مليون متر فف) يجب أن تكون 10 الحيوانات كافية. كن على علم بأن الخصيات من بعض المسوخ meiotic (على سبيل المثال، spo11-/-)ستكون أصغر إلى حد ما3. في هذا البروتوكول، يعتبر تجمع واحد من الخصيتين كعينة واحدة. من المستحسن ألا يتم إعداد أكثر من 4 عينات بالتوازي.

  1. جعل الحلول التالية قبل البدء في إجراء الانتشار
    ملاحظة: من المناسب إعداد الحلول التالية في الكميات المحددة للاستخدام في تجارب الانتشار المستقبلية.
    1. إعداد محلول السكروز 0.1 M عن طريق حل 3.42 غرام من السكروز في 100 مل من الماء المقطر. جلب محلول السكروز إلى درجة الحموضة 8 باستخدام 1 M Tris-HCl الذي هو أيضا في درجة الحموضة 8. ثم تصفية تعقيم محلول السكروز. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    2. جعل 10x الفوسفات المخزنة على محلول المحلول المالح (PBS) إلى تركيز نهائي من 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 و 27.6 m KH2PO4 في 1.8 لتر من الماء المقطر. يُحرّك المزيج حتى يذوب، ثم يُعدّل درجة الحموضة إلى 7.3 باستخدام NaOH والأوتوكلاف. تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    3. جعل 400 ميكروغرام / مل DNase I الحل في الماء المقطر المعقم. تخزين في -20 درجة مئوية. من المستحسن إعداد 5 مل من هذا الحل ثم تخزينها ك100 ميكرولتر aliquots.
  2. تقديم الحلول التالية في يوم بروتوكول الانتشار
    ملاحظة: لكفاءة الوقت، فمن الأفضل لجعل محلول الكولاجين فورا بعد تشريح جميع الخصيتين ومن ثم جعل المحاليل التربسين والتربسين المانع خلال الوقت الذي يتم علاج العينات في الكولاجين.
    1. حل 4 ملغ من الكولاجين في 200 ميكرولتر من متوسط النسر المعدل ة Dulbecco (DMEM) لكل عينة (2٪ ث / v تركيز الكولاجين النهائي). الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. سوف الكولاجين فصل الخصيات.
    2. حل 1.4 ملغ من التربسين في 200 ميكرولتر من DMEM لكل عينة (0.7٪ ث / ث تريبسين التركيز النهائي). الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. وسوف يساعد التربسين فصل الخلايا.
    3. حل 10 ملغ من مثبطات التربسين في 500 ميكرولتر من DMEM لكل عينة (2٪ ث / ث مثبط التربسين التركيز النهائي). الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. مثبط التربسين يمنع التربسين من تدهور الخلايا.
    4. إعداد محلول الفورمالديهايد بنسبة 1٪ (من محلول مسبق الصنع بنسبة 16٪) مع 0.15٪ تريتون X-100 في الماء المقطر المعقم. الحفاظ على الجليد حتى الحاجة. يمكن إعداد الفورمالديهايد بنسبة 1٪ أثناء معالجة الخصيتين بالتريبسين وDNase I (أي خلال الخطوة 1.4.7 من إجراء الانتشار).
      تنبيه: الفورمالديهايد خطر.
  3. تشريح الخصيات من سمك الحمار الوحشي الذكور البالغين
    1. القتل الرحيم سمك الحمار الوحشي الذكور (> 60 dpf) عن طريق غمرها في الماء المثلج. يمكن الاحتفاظ بالأسماك في الماء المثلج حتى تصبح جاهزة للتشريح ، ولكن يجب تشريحها في أقرب وقت ممكن.
      ملاحظة: يتم استخدام سلالة AB من النوع البري لهذا الإجراء، ولكن يجب أن تكون السلالات البرية الأخرى قابلة أيضاً. أطول وقت لدينا حفظ الأسماك في الماء المثلج قبل تشريح هو 3 ح دون أي تأثير ملحوظ على البروتوكول.
    2. قطع رأس سمكة واحدة في وقت واحد مع مقص صغير ومن ثم استخدام مقص صغير لقطع على طول خط الوسط البطني لفضح تجويف الجسم.
    3. تشريح testis باستخدام ملقط (انظر جدول المواد)في التكبير 1.65x تحت المجهر. تنفيذ تشريح في طبق بيتري المغلفة بالسيليكون مع تغطيتها من قبل بركة ضحلة من 1x PBS.
      ملاحظة: يقع الخصية بين المثانة السباحة والأمعاء وسوف تظهر أخف وزنا من الأنسجة العضلية(الشكل 2A). يجب أن يكون الخصية 2 فصوص عند إزالتها من حمار وحشي(الشكل 2B).
    4. إزالة أكبر قدر ممكن من الدهون والأنسجة المحيطة بها من الخصية. ثم إضافة كل testis تشريح مباشرة في أنبوب 5 مل مع 2 مل من DMEM والحفاظ على الجليد.
      ملاحظة: يجب إتقان الخطوات 1.3.3 و 1.3.4 قبل إجراء أي تجارب.
  4. انفصال خلايا الخصيات
    1. ما قبل الحارة 100 مل من 0.1 M محلول السكروز إلى 37 درجة مئوية.
    2. أضف 200 ميكرولتر من محلول الكولاجين إلى أنبوب 5 مل مع الخصية. خلط الحل عن طريق عكس ذلك عدة مرات.
    3. هز الخصيتين برفق في حاضنة شاكر أفقيا في 100 دورة في الدقيقة في 32 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة إلى ساعة حتى DMEM غائم والخصيتين في قطع صغيرة. عكس بسرعة أنبوب كل 10 دقيقة لتسهيل التفكك.
    4. لغسل الكولاجين، إضافة DMEM إلى حجم 5 مل النهائي وعكس الأنبوب عدة مرات. بيليه الخصيتين في ~ 200 × ز لمدة 3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة 3 مل من supernatant بحيث يبقى فقط 2 مل.
      ملاحظة: تتم إضافة وإزالة ونقل DMEM مع ماصة نقل البلاستيك لكامل إجراء انتشار الكروموسوم.
    5. كرر الخطوة 1.4.4 مرتين أكثر لما مجموعه 3 مهابDM. لا إعادة تعليق بيليه بين DMEM washes. بعد غسل DMEM الماضي، وإزالة 4 مل من supernatant بحيث يبقى فقط 1 مل.
    6. أضف 1 مل من DMEM لحجم إجمالي قدره 2 مل وإضافة 200 ميكرولتر من محلول التربسين و 20 ميكرولتر من محلول DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط الحل.
    7. هز الأنبوب أفقياً عند 32 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة عند 100 دورة في الدقيقة حتى يحتوي حل DMEM على كتل قليلة فقط. عكس بسرعة أنبوب كل 5 دقيقة لتسهيل التفكك.
      ملاحظة: يجب أن تكون الكتل أصغر بكثير بعد الاهتزاز.
    8. إضافة 500 ميكرولتر من محلول مثبط التربسين و 50 ميكرولتر من حل DNase I. عكس أنبوب عدة مرات لخلط، ثم تدور لفترة وجيزة إلى أسفل في ~ 200 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة السائل أو الكتل التي قد تلتزم غطاء أنبوب أو جانب الأنبوب.
    9. وضع أنبوب على الجليد وإعادة تعليق تعليق الخلية عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا مع ماصة نقل البلاستيك لمدة 2 دقيقة لتسهيل التفكك من أي كتل المتبقية. لا تدع تعليق الخلية تذهب إلى لمبة من ماصة النقل. بعد 2 دقيقة, ماصة التعليق مرة أخرى إلى أنبوب 5 مل.
    10. قبل الرطب مصفاة خلية 100 ميكرومتر مع DMEM ووضعها على رأس أنبوب 50 مل على الجليد.
    11. نقل تعليق الخلية من خلال مصفاة قطرة واحدة في وقت واحد باستخدام ماصة نقل البلاستيك. تأكد من أن تعليق الخلية لا يذهب إلى لمبة ماصة النقل.
    12. نقل filtrate باستخدام ماصة نقل البلاستيك إلى أنبوب جديد 5 مل وإضافة DMEM إلى حجم نهائي من 5 مل. تأكد من جمع الخلايا المجمعة المرفقة بالجانب السفلي من الفلتر مع ماصة نقل بلاستيكية نظيفة. بيليه الخلايا في ~ 200 × ز لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    13. إزالة أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج بيليه.
    14. إضافة 5 ميكرولتر من DNase I الحل مباشرة في بيليه. ثم خلط بيليه مع الحل DNase الأول عن طريق كشط بلطف الجزء السفلي الخارجي من أنبوب 4-5 مرات على طول فارغة 1.5 مل رف أنبوب الطرد المركزي الدقيق. يمكن أن يؤدي الكشط بقسوة شديدة إلى تقليل فروق الأسعار المستردة.
    15. إضافة DMEM إلى حجم نهائي من 5 مل وخلط الحل عن طريق عكس الأنبوب عدة مرات. من الشائع أن تظل الكتل موجودة بعد أول علاج DNase I.
    16. بيليه تعليق الخلية في ~ 200 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    17. كرر الخطوات 1.4.13-1.4.16 1-3 مرات إضافية حتى بيليه إعادة تعليق لا تتجمع عند إضافة DMEM. بعد الدوران الأخير، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الخارقة دون إزعاج الكريات.
      ملاحظة: نتوقع انخفاضا في حجم بيليه مع كل علاج DNase الأول; تجاوز 4 DNase مجموع أنا washes قد يؤدي إلى فقدان كبير للخلايا. إذا لم يكن هناك بيليه مرئي بعد خطوات علاجات DNase I ، فلا تمضي في الإجراء. تجاهل أي DNase I غير المستخدمة.
    18. إضافة 1 مل من 1x PBS وإعادة تعليق بيليه عن طريق كشط بلطف الجزء السفلي الخارجي من الأنبوب على طول رف أنبوب فارغة 1.5 مل.
    19. بيليه تعليق الخلية في ~ 200 × ز لمدة 5 دقيقة ثم إزالة أكبر قدر من supernatant ممكن دون إزعاج بيليه.
    20. قطع ~ 3 ملم من نهاية تلميح ماصة 200 ميكرولتر لتوسيع الفتحة وإعادة تعليق بيليه في ~ 80 ميكرولتر من 0.1 M محلول السكروز عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مع تلميح ماصة قطع. السماح لتعليق الخلية الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقيقة.
  5. انتشار الكروموسومات على الشرائح الزجاجية
    1. معطف شريحة واحدة مع 100 ميكرولتر من 1٪ الفورمالديهايد مع 0.15٪ تريتون X-100 مع الجانب من تلميح ماصة. ثم أضف 18 ميكرولتر من تعليق خلية السكروز إلى مركز الشريحة في خط مستقيم عمودي على الحافة الطويلة. إمالة الشريحة ذهابا وإيابا (~ 60 درجة) لتسهيل انتشار تعليق الخلية إلى جميع الزوايا.
    2. ضع الشرائح مسطحة لأسفل في غرفة رطوبة مفتوحة متصدعة قليلاً(الشكل 3)لمنع محلول الفورمالديهايد من التجفيف. ضع غرفة الرطوبة في درج مظلم بين عشية وضحاها.
    3. أزل الغطاء من غرفة الرطوبة واترك الشرائح جافة تمامًا.
    4. ضع الشرائح في جرة كوبلين ثم ملء جرة كوبلين بالماء المقطر واحتضان لمدة 5 دقيقة مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يمكن وضع الشرائح في جرة كوبلين في نمط متعرج لزيادة عدد الشرائح لكل جرة كوبلين. تأكد من وجود مساحة للسائل لتمرير بين جميع الشرائح.
    5. صب الماء وملء جرة مع 1:250 وكيل التبول (انظر جدول المواد). اغسل مرتين لمدة 5 دقيقة مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    6. السماح للشرائح لتجف تماما وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى يتم تلطيخها.
      ملاحظة: أطول لدينا الشرائح المخزنة دون أي تدهور ملحوظ من الكروموسومات هو ~ 2 أشهر.

2. Telomere السلطة الوطنية الفلسطينية التحقيق تلطيخ

ملاحظة: يمكن تلطيخ يكرر التيلومير باستخدام تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية المترافقة الفلوروفورية التي تهجين إلى تكرار التيلومير حبلا (CCCTAA). تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية لديها العمود الفقري محايدة، مما يزيد من تقارب التهجين إلى الحمض النووي المشحون ة سلبا، مما أدى إلى القليل من الخلفية أو لا. خطوة التحقيق التيلومير اختيارية. للشروع في تلطيخ الأجسام المضادة ، وإعادة ترطيب الشرائح في 1x PBS كما هو مبين في الخطوة 2.2.2.، ثم انتقل مباشرة إلى "تلطيخ الأجسام المضادة الأولية".

  1. جعل الكواشف التحقيق السلطة الوطنية الفلسطينية قبل البدء في تلطيخ التيلومير
    ملاحظة: من المناسب إعداد الحلول التالية في الكميات المحددة للاستخدام في التجارب المستقبلية. وترد أدناه ملاحظة ظروف التخزين.
    1. إعداد 2 لتر من محلول سترات الصوديوم المالحة 20x (SSC) مع تركيز نهائي قدره 3 م NaCl و 0.3 M سترات الصوديوم. الأوتوكلاف وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
    2. جعل 50 مل من محلول ما قبل التهجين التي تحتوي على نقل الحمض النووي الريبي إلى تركيز نهائي من 50٪ formamide، 5x SSC، 50 ميكروغرام/مل الهيبارين، 500 ميكروغرام/مل نقل الجيش الملكي النيبالي، 0.1٪ توين 20 وإضافة 460 ميكرولتر من 1 M حمض الستريك لجلب الحل إلى درجة الحموضة ~ 6. تخزين في -20 درجة مئوية.
      تنبيه: فورماميد خطير. إعداد الحل في غطاء الدخان.
    3. جعل 50 مل من حل ما قبل التهجين أعدت بنفس الطريقة كما هو الحال في الخطوة 2.1.2 دون إضافة نقل الجيش الملكي النيبالي. تخزين في -20 درجة مئوية.
    4. يتم إعداد مسابير telC-Cy3 و TelC-Alexa647 كمخزون 50 ميكرومتر في formamide حسب تعليمات الشركة المصنعة. تخزين تحقيقات السلطة الوطنية الفلسطينية كما 8 μL aliquots في -80 درجة مئوية.
    5. جعل ما لا يقل عن 1 مل من 100 ملغ / مل حل الأسهم من الزلال مصل البقر (BSA) في الماء المقطر المعقم. تخزين في -20 درجة مئوية. إذا كان إعداد أكثر من 1 مل من المخزون BSA، وتخزين الحل كما 1 مل aliquots.
    6. باستخدام أنبوب 2 مل، قم بإعداد 2 مل من محلول التهجين بإضافة 27 ميكرولتر من 100 ملغم/مل BSA و8 ميكرولتر من مسبار 50 ميكرومتر من السلطة الوطنية الفلسطينية إلى 1.965 مل من محلول ما قبل التهجين الذي يحتوي على نقل الحمض النووي الريبي. تخزين في الظلام في -20 درجة مئوية.
  2. السلطة الوطنية الفلسطينية telomere التحقيق تلطيخ
    1. سخني الفرن الهجين إلى 82 درجة مئوية.
    2. إعادة الشرائح هيدرات مع 500 ميكرولتر من 1x PBS لكل شريحة لمدة 5 دقيقة في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة برنامج تلفزيوني عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    3. سخني الشرائح وأنبوب 2 مل الذي يحتوي على محلول التهجين مباشرة على سطح معدني في فرن التهجين الساخن لمدة دقيقتين.
    4. مع الحفاظ على الشرائح على السطح المعدني، أضف 100 ميكرولتر من محلول التهجين لكل شريحة ثم قم بتغطية الشرائح بقسائم تغطية بلاستيكية (~ 25 مم × 75 مم) لقطع الشكل من كيس الأوتوكلاف. السماح للشرائح الجلوس في 82 درجة مئوية لمدة 10-12 دقيقة.
    5. ضع الشرائح في غرفة رطوبة في الظلام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة. من هذه النقطة إلى الأمام وتلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية ، يجب أن تبقى الشرائح في الظلام لتجنب التبييض الضوئي لإشارة الفلورية. بعد فترة الحضانة ، يمكن إعداد الكواشف لتلطيخ الأجسام المضادة خلال الخطوة 2.2.9.
    6. قم بإزالة قسائم التغطي اتّصال بطرف ماصة.
      ملاحظة: لتسهيل إزالة قسيمة الغطاء، يمكن الاستغناء عن 50-100 ميكرولتر من محلول التهجين بدون نقل الحمض النووي الريبي بلطف بين الشريحة وقسيمة الغطاء أثناء رفع قسيمة التغطي.
    7. ماسيت 500 ميكرولتر من محلول ما قبل التهجين مع عدم نقل الحمض النووي الريبي على كل شريحة ووضع الشرائح في غرفة الرطوبة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
      ملاحظة: حل ما قبل التهجين مع عدم نقل RNA لا يتم تسخينها مسبقاً قبل إضافتها على كل شريحة.
    8. ماسيت 500 ميكرولتر من 50٪ حل ما قبل التهجين مع عدم نقل الجيش الملكي النيبالي في 1x PBS إلى كل شريحة ووضع الشرائح في غرفة الرطوبة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المحلول عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    9. نقل الشرائح إلى جرة كوبلين وغسل 3 مرات في 1x PBS مع اهتزاز لطيف لمدة 15 دقيقة لكل غسل في درجة حرارة الغرفة.
    10. إزالة الشرائح من جرة كوبلين وإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية. ثم انتقل إلى الخطوة 3.2 "تلطيخ الأجسام المضادة الأولية".

3. تلطيخ الأجسام المضادة

ملاحظة: يمكن استخدام الأجسام المضادة التي أثيرت إلى البروتينات المتوسطة المعروفة للكشف عن الفلورالمناعي في الاستعدادات كروموسوم انتشار. تسمح الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفوريات المختلفة بتلطخ بروتينات متعددة في وقت واحد ، إذا كانت الأجسام المضادة الأولية قد أثيرت في الحيوانات المختلفة.

  1. جعل الحلول التالية في يوم تلطيخ الأجسام المضادة الأولية والثانوية
    1. جعل 1 لتر من PBT مع 1x PBS و 0.1٪ تريتون X-100 المخفف في الماء المقطر. تخزينها في درجة حرارة الغرفة. ويمكن إعداد ذلك في وقت مقبل وبكميات كبيرة لإجراء تجارب الانتشار في المستقبل.
    2. إعداد 500 ميكرولتر من كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة إلى تركيز نهائي من 2 ملغ / مل من BSA و 2٪ مصل الماعز في PBT.
    3. لجعل 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية أو الثانوية لكل شريحة، إضافة الأجسام المضادة المناسبة في التركيز الصحيح (انظر جدول المواد)في كتلة الأجسام المضادة.
      ملاحظة: قد يحتاج تركيز الأجسام المضادة إلى تحديد تجريبي. في المناقشة ، ونحن ندرج قائمة من الأجسام المضادة حاولنا بنجاح (مع تخفيف / تركيزات) وتلك التي حاولنا دون نجاح.
  2. تلطيخ الأجسام المضادة الأولية
    ملاحظة: أرنب المضادة للإنسان SCP3 والدجاج المضادة للحمار الوحشي Sycp1 وعادة ما تستخدم لتلطيخ الأجسام المضادة الأولية.
    1. بعد إزالة برنامج تلفزيوني الزائدة من الشرائح، إضافة 500 ميكرولتر من كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة ووضع الشرائح في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.
    2. إزالة كتلة الأجسام المضادة عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    3. أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الأولية في كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة وقم بتغطية الشرائح بقسيمة غلاف بلاستيكية مصنوعة من كيس الأوتوكلاف. ضع الشرائح في غرفة رطوبة بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    4. قم بإزالة القسائم بطرف ماصة واغسل الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق كحد أدنى مع 1x PBS في جرة كوبلين مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    5. قم بإزالة برنامج تلفزيوني عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
  3. تلطيخ الأجسام المضادة الثانوية
    ملاحظة: تستخدم الماعز المترافق المضادة للأرانب والأجسام المضادة للدجاج لمختلف الفلوروفوريات للتلطيخ عند تركيز 1:1000.
    1. أضف 500 ميكرولتر من كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة وضع الشرائح في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 5 دقيقة.
    2. قم بإزالة كتلة الأجسام المضادة عن طريق النقر على جانب الشريحة على منشفة ورقية.
    3. أضف 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة الثانوية في كتلة الأجسام المضادة لكل شريحة وقم بتغطية الشرائح بقسيمة غلاف بلاستيكية مصنوعة من كيس الأوتوكلاف. ضع الشرائح في غرفة رطوبة لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة القسائم بطرف ماصة واغسل الشرائح 3 مرات لمدة لا تقل عن 5 دقيقة مع 1x PBS في جرة كوبلين مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    5. شطف الشرائح مرة واحدة لمدة لا تقل عن 2 دقيقة مع الماء المقطر في جرة كوبلين مع اهتزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    6. الهواء الجاف الشرائح يميل، لتسهيل التجفيف.
    7. ضع 20 ميكرولتر من الجانب المضاد للتلاشي مع أو بدون DAPI (انظر جدول المواد)كـ 3 نقاط متباعدة بالتساوي على قسائم التغطيات الزجاجية (24 مم × 60 مم).
    8. ضع الشرائح على الشرائح أسفل القسائم الزجاجية ثم ختم القسائم مع طلاء الأظافر على حافة متداخلة نهاية متجمد من الشريحة.
    9. تخزين الشرائح المعدة في 4 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للتصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لقد حددنا طريقة لإعداد وتصور حمار وحشي الحيوانات المنوية الاستعدادات انتشار. عندما يؤديها بشكل صحيح، لدينا إجراءات تسفر عن انتشار جيد، والنوى غير متداخلة. لاستعادة هذه النوى ، من المهم أن يكون المبلغ المناسب من المواد بدءا (أي الخصيتين) ، وعلاج الخصيتين لفترة كافية من الوقت في التربسين وعدد كاف من العلاجات DNase الأول. ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه السبريدات ملطخة بالتيلوميرات والبروتينات الميوتيكلدراسة تطور الميوتي خلال المرحلة الأولية I. يصور الشكل 1 أمثلة لمست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا نصف طرق للتحقيق في موقع التيلوميرات والبروتينات المرتبطة الكروموسوم في السطح النووي ينتشر من الحيوانات المنوية معزولة عن الخصيتين حمار وحشي. نتوقع أن تكون هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتحليل الحيوانات المنوية في الأنواع الأخرى teleost مع التكيف مع حجم الخصية.

في حين تم رفع عدد قليل فقط من الأجسام المضادة إلى البروتينات ميوتيك حمار وحشي، لقد كان النجاح باستخدام الأجسام المضادة التالية التي أثيرت إلى الإنسان (ح) أو الماوس (م) البروتينات. وقد أثار مختبرنا الأجسام المضادة لحمار وحشي Sycp1 البروت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

نشكر ترينت نيومان وماسودا شريفي على تعليقاتهما على المخطوطة و"نغوين" للمساعدة في تحسين طرق نشر وتلطيخ الكروموسومات من مقلدات الحمار الوحشي. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM079115 الممنوحة لS.M.B.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل العديدمن العلامات التجارية المتاحة
أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملالعديد من العلامات التجارية المتاحة
16٪ فورمالديهايد ، خالي من الميثانولThermoFisher Scientific28908
2 ملالعديد من العلامات التجارية المتاحة
أغطية زجاجية مقاس 24 × 50 ممكورنينج2980-245
24 × 60 مم زجاجي الغطاءVWR International16004-312
50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةThermoFisher Scientific363696
حقيبة الأوتوكلافالعديد من العلامات التجارية المتاحةتستخدم لصنع أغطية بلاستيكية.
ألبومين مصل الأبقار (BSA)فيشر ScientificBP1605-100تحضير محلول مخزون 100 مجم / مل في ماء مقطر معقم.
مصفاة الخلية ، 100 & ميكرو ؛ مفيشر Scientific08-771-19
CF405M الماعز المضاد للدجاج IgY (H + L) ،البيوتيومللغاية 203775-500uLاستخدم في الساعة 1: 1000
دجاج مضاد ل zfSycp1تم إنشاؤه بواسطة مختبر بورغيسN / Aاستخدم في 1: 100
كولاجيناز من Clostridium< / em> histolyticumSigma-AldrichC0130-500MG
جرة كوبلنعدة العلامات التجارية المتاحة
DNase I ، الدرجة الثانية من البنكرياس البقريRoche Diagnostics10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Fisher ScientificMT10014CV
Dumont رقم 5 FulpsFine ScienceTools 11252-30مطلوبان لتشريح الخصيتين.
أنابيب Eppendorf ، 5 ملVWR International89429-308
فورماميدفيشر ScientificBP228-100
جسم مضاد ثانوي مضاد للماعز IgY (H + L) مضاد للدجاج ، Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11039استخدم عند 1: 1000
جسم مضاد ثانوي مضاد للماعز مضاد للدجاج IgY (H + L) ، Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11042استخدم في 1: 1000
الماعز المضاد ل hDMC1سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-8973لا يعمل في أيدينا
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز عبر الماعز ، Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11008استخدم في 1: 1000
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012استخدم عند 1: 1000
مصلالماعزSigma-AldrichG9023-10mL
ملح الصوديوم الهيبارينSigma-AldrichH3393-100KU
غرفة الرطوبةفيشر Scientific50-112-3683
فرن التهجينVWR International230401V (موديل 5420)
حاضنة شاكرنيو برونزويك النموذج العلميكلاسيك C25
KClفيشر ScientificP217-500
KimwipesKimerbly-Clark Professional34155تستخدم لغرفة الرطوبة
KH2< / sub>PO4< / sub>Fisher ScientificP285-500
المجهرالعديد من العلامات التجارية المتاحةأي مجهر قياسي قادر على التكبير ~ 1.65X على الأقل.
شرائح المجهرفيشر Scientific12-544-7
ماوس مضاد للهامسترSCP3Abcamab97672لا يعمل في أيدينا
الماوس المضاد ل hMLH1BD Biosciences550838لا يعمل في أيدينا
الماوس المضاد ل hRPASigma-AlrichMABE285يعمل في أيدينا
Na2HPO4 · 7 H2< / sub>OFisher ScientificS373-500
NaClFisher ScientificS271-3
Photo-Flo 200 حلعلوم المجهر الإلكتروني74257
ماصات نقل البلاستيكالعديد من العلامات التجارية المتاحة
PNA TelC-Alexa647PNA Bio IncF1013تحضير حسب الشركة المصنعة تعليمات ق.
PNA TelC-Cy3PNA Bio IncF1002قم بالتحضير وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ProLong Diamond Antifade MountantThermoFisher ScientificP36970
ProLong Diamond Antifade Mountant مع DAPIThermoFisher ScientificP36971
أرنب مضاد ل hRPABethylA300-244Aاستخدم في الساعة 1: 300
أرنب مضاد ل hSCP3Abcamab150292استخدم في 1: 200
أرنب مضاد ل hRad51GeneTexGTX100469استخدم في الساعة 1:300
سترات الصوديومفيشر ScientificS279-500
السكروزفيشر ScientificS5-500
مقص Supercut ، زاوية 30 درجة ، 10 سمفيشر Scientific50-822-353يمكن أيضا استخدام أي زوج من المقصات الصغيرة.
مجموعة سيلجاردفيشر NC9897184 العلميتحضير حسب تعليمات الشركة المصنعة.
تريتون X-100فيشر ScientificBP151-100خفف في الماء المقطر المعقم لعمل محلول عمل بنسبة 20٪. يحفظ في درجة حرارة الغرفة. يشكل Triton X-100 راسب عند تخفيفه في الماء ؛ يذوب الراسب بين عشية وضحاها.
التربسينورثينجتون للكيمياء الحيويةLS003708
التربسين من بياض بيض الدجاجسيجما ألدريتشT9253-500MG
توين 20بيو170-6531يخفف في الماء المقطر المعقم لصنع محلول عمل بنسبة 20٪. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
مقص زنبركي فاناس - 4 مم (مقص صغير)أدوات العلوم الدقيقة15018-10
رف المتصاص يكفي لا مثبط راد

المراجع

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730(2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075(2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442(2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تشريح الخصيتينتفكيك الخلايانشر الكروموسوماتالكشف بالفلورة المناعيةالتهجين الموضعي المتألقالمعالجة بـ DNase Iمحلول السكروزفورمالدهيد تريتون X-100
إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.