يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين

10.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60687

⸱

ديسمبر 19, 2019

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

في هذه المقالة

ملخص

النهج الموصوف يجمع بين اختبارات الانبثاث الوريد الذيل التجريبية مع في الجسم الحية التصوير الحيواني للسماح الرصد في الوقت الحقيقي لتكوين ورم خبيث سرطان الثدي والنمو بالاضافه إلى التحديد الكمي للعدد الانبثاث وحجم في الرئتين.

الملخص

الانبثاث هو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان ، وهناك خيارات علاجيه محدوده للمرضي الذين يعانون من مرض منتشر. تحديد واختبار الأهداف العلاجية الجديدة التي من شانها ان تسهل تطوير علاجات أفضل للمرض المنتشر يتطلب السريرية في نماذج الجسم الطبيعي. يظهر هنا نموذج الماوس المتزامن لسلخ سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق. الخلايا السرطانية المنتشرة محوله بشكل ثابت مع ناقلات الفيروسية ترميز لوسيفيراز اليراع و zsgreen البروتينات. ثم يتم التلاعب بالجينات المرشحة بثبات في luciferase/ZsGreen-التعبير عن الخلايا السرطانية ومن ثم يتم حقن الخلايا في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي لفحص الاستعمار المنتشر والنمو. ثم يستخدم جهاز تصوير في الجسم الحي لقياس التلالؤ الإحيائي أو الفلوري للخلايا السرطانية في الاحياء الحيوانية من أجل قياس التغيرات في العبء المنتشر علي مر الزمن. التعبير عن البروتين الفلوري يسمح عدد وحجم الانبثاث في الرئتين ليتم تحديدها كميا في نهاية التجربة دون الحاجة إلى التقطيع أو تلطيخ النسيجية. يوفر هذا النهج طريقه سريعة وسهله نسبيا لاختبار دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو ، ويوفر قدرا كبيرا من المعلومات أكثر من الاختبارات التقليدية لورم خبيث في الوريد الخلفي. باستخدام هذا النهج ، ونحن نظهر ان الضربة القاضية في وقت واحد من نعم البروتين المرتبطة (ياب) والمنشط المشترك مع عزر PDZ ملزمه (تاز) في خلايا سرطان الثدي يؤدي إلى انخفاض عبء المنتشر في الرئتين وان هذا العبء المخفض هو نتيجة لضعف كبير في الاستعمار المنتشر وانخفاض نمو الانبثاث.

المقدمة

السرطان لا يزال السبب الرئيسي الثاني للوفاة في جميع انحاء العالم1 والانبثاث هو المسؤول عن غالبيه هذه الوفاات2,3. ومع ذلك ، فان الفهم المحدود للأليات الجزيئية التي تحكم الاستعمار المنتشر والنمو اللاحق أعاق تطوير علاجات فعاله للامراض المنتشرة. ويتطلب تحديد الأهداف العلاجية الجديدة فحصا لاختبار مدي تاثير التعبير المضطرب أو وظيفة الجينات المرشحة علي تكوين الأورام الخبيثة ونموها. بينما نماذج الماوس أصلي لها مزاياها ، فهي تستغرق وقتا طويلا ومكلفه لتوليد ، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتحقق من صحة الهدف بدلا من اكتشاف الهدف. نظم نموذج زرع فيها الجينات المرشح هو قلق في الخلايا السرطانية في المختبر ومن ثم يتم تقييم الآثار علي الإمكانات المنتشرة في الجسم المصاب ، هي اقل تكلفه واعلي من الانتاجيه من أصلي النماذج. الاضافه إلى ذلك ، النواقل الفيروسية للتسليم مستقره من RNAi ، CRISPR/كاس 9 ، والجينات هي متاحه علي نطاق واسع ، مما يجعل من السهل نسبيا للاضطراب تقريبا اي جين أو جينات الفائدة في خطوط الخلايا السرطانية. ويمكن أيضا استخدام هذا النهج لفحص دور الجينات المرشحة في الاستعمار المنتشر والنمو في خطوط الخلايا السرطانية البشرية عن طريق زرع الخلايا في الفئران المناعية أو أنسنه.

نوعين من المقايسات المستخدمة لاختبار تشكيل الانبثاث بالخلايا السرطانية المزروعة في الجسم الحيوي هي فحوصات الانبثاث العفوية واختبارات الانبثاث التجريبية. في اختبارات الانبثاث العفوية4،5، يتم حقن الخلايا السرطانية في الفئران ، ويسمح لتشكيل الورم الاولي ، وبعد ذلك تشكيل الانبثاث العفوي والنمو اللاحق يتم التهاوي. قوه هذا النموذج هو ان الخلايا يجب ان تكمل جميع خطوات العملية المنتشرة من أجل تشكيل الأورام المنتشرة. ومع ذلك ، فان العديد من خطوط الخلايا السرطانية لا تنتشر بكفاءة في نماذج الانبثاث العفوية ، وأي تلاعب في الخلايا التي تؤثر علي نمو الورم الاولي يمكن ان نخلط نتائج الفحص الانبثاث. يتم استخدام اختبارات الانبثاث التجريبية ، التي يتم حقن الخلايا السرطانية مباشره في الدورة الدموية ، لتجنب هذه المزالق. وتشمل اختبارات الانبثاث التجريبية الشائعة حقن الوريد الذيل6,7,8 (وأظهرت هنا), حقن داخل الشرايين9, والمدخل الوريد حقن10.

والغرض من البروتوكول المعروض هنا هو توفير اختبار الانبثاث التجريبية التي تسمح للباحث لرصد تشكيل الانبثاث والنمو في الوقت الحقيقي ، وكذلك لقياس نقطه نهاية عدد الانبثاث وحجم في الرئتين من نفس الماوس. لتحقيق ذلك ، يتم الجمع بين التجريبية التقليدية ذيل الوريد الانبثاث الاختبارات6،7،8 مع التصوير الحيواني الحية ، وذلك باستخدام جهاز التصوير في فيفو9،11،12،13،14. الخلايا السرطانية التي تعبر عن كل من لوسيفيراز والبروتين الفلوري يتم حقنها في الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي ومن ثم يتم استخدام جهاز التصوير في الجسم المجري لقياس التغيرات في العبء المنتشر في الرئتين مع مرور الوقت (الشكل 1). ومع ذلك ، فان الجهاز الحي في الجسم التصوير الحيواني لا يميز أو يقيس حجم النقائل الفردية. التالي ، في نهاية التجربة ، يتم استخدام مجسم الفلورسنت الفلورية لحساب عدد وقياس حجم الانبثاث الفلورسنت في الرئتين دون الحاجة إلى التماس والانسجه أو مناعي (الشكل 1). ويمكن استخدام هذا البروتوكول لاختبار كيفيه تغيير التعبير أو وظيفة الجينات مرشح يؤثر علي تكوين الانبثاث والنمو. يمكن أيضا اختبار المركبات العلاجية المحتملة مثل الجزيئات الصغيرة أو وظيفة حجب الأجسام المضادة.

لإظهار هذا النهج ، قمنا أولا باجراء دليل علي تجربه المفهوم الذي عامل النسخ المتماثل الاساسيه ، النسخ المتماثل البروتين A3 (RPA3) هو طرقت أسفل في خلايا سرطان الثدي الماوس المنتشر. ونحن نظهر ان الفئران حقن مع RPA3 الخلايا الضربة القاضية لديها عبء اقل بكثير المنتشر في كل نقطه زمنيه مقارنه مع الفئران حقن مع خلايا التحكم. ويبين تحليل الرئتين التي تحتوي علي الانبثاث ان هذا العبء المنتشر المنخفض هو نتيجة لانخفاض كبير في الاستعمار المنتشر وضعف النمو في النقائل التي تشكل. لمزيد من التدليل علي هذه التقنية ، اختبرنا ما إذا كانت الضربات المتزامنة للبروتين المرتبط بنعم (ياب) والمنشط المشترك مع عزر الربط PDZ (تاز) يضعف الاستعمار المنتشر أو النمو اللاحق. ياب و تاز هما المنشطات المشتركة ذات الصلة التي هي المستجيبين المصب الحرجة من مسار فرس النهر. نحن15,16 والبعض الآخر قد تورط ياب و تاز في الانبثاث (راجعت في17,18,19), مما يوحي بان هذه البروتينات هي الأهداف العلاجية الجيدة. باستمرار ، وجدنا ان الفئران حقن مع ياب/تاز الخلايا الضربة القاضية قد خفضت بشكل كبير العبء المنتشر. واظهر تحليل الرئتين ان الخلايا الضربة القاضية ياب/تاز شكلت العديد من الانبثاث اقل وان الانبثاث التي لم تشكل أصغر. توضح هذه التجارب كيف تسمح اختبارات الانبثاث التجريبية للباحث بان يختبر بسرعة وبطريقه غير مكلفه دور الجينات المرشحة في تكوين ونمو الورم الخبيث. وتبين أيضا كيف ان الاستخدام المشترك للتصوير الحيواني الحي والتحديد الكمي الفلوري للنقائل في الرئتين كلها يسمح للباحث بفهم الخطوات بشكل أفضل اثناء الاستعمار المنتشر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وينطوي هذا البروتوكول علي استخدام الفئران والمواد البيولوجية الخطرة ويتطلب الموافقة من لجان السلامة المؤسسية المناسبة. وقد تمت الموافقة علي كل من وصفها في العمل الفيفو هنا من قبل كليه الطب الباني المؤسسة الرعاية الحيوانية واستخدام اللجنة (IACUC).

ملاحظه: للحصول علي نظره عامه حول بروتوكول ، راجع التخطيطي في الشكل 1.

1. التعبئة والتغليف جميع الفيروسات الرجعية المطلوبة و لينتيفيروسيس

ملاحظه: يستخدم البروتوكول الموصوف ناقلات لينتيفيرال أو الفيروسات الارتجاعية للتعبير بثبات عن انزيم لوسيفيراز والبروتين الفلوري وكذلك للتلاعب بالتعبير عن جين مرشح. يتم تعبئتها هذه الفيروسات في الخلايا 293FT يشك كما هو موضح أدناه.

  1. اليوم الأول: الخلايا 293FT اللوحة علي 6-بئر لوحات في 2 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل (10 ٪ في DMEM مع 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 2 مم L-الجلوتامين) بحيث تكون 40-60 ٪ متموج في اليوم 2. احتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
  2. اليوم الثاني: بالنسبة لكل متجه فيروسي ليتم تعبئته ، transfect 40-60 ٪ متموج well من الخلايا يشيك-293FT مع الفيروسات القهقريه أو ناقلات لينتيفيرال والمتجات المناسبة ترميز معطف الفيروسية والبروتينات التعبئة والتغليف.
    ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول VSVG كبروتين معطف ، psPAX2 للتغليف اللينتيفيرال ، وهفوة-pol للتغليف الفيروسات القهقريه (انظر الجدول التكميلي 1 لقائمه ناقلات).
  3. جعل خليط النقل المشترك لكل بئر كما يلي:
    1. الجمع بين 4 μL من محلول الدهون للاستئصال (انظر جدول المواد) و 96 μl من العازلة الفاصلة واحتضان لمده 5 دقائق.
    2. أضافه 1 ميكروغرام من ناقلات الفيروسية, 0.5 ميكروغرام من البروتين معطف ناقلات (VSVG), و 0.5 ميكروغرام من ناقلات البروتين التعبئة والتغليف (psPAX2 أو هفوة-pol) واحتضان لمده 20 دقيقه.
    3. أضيفي الخليط برفق من الخطوة 1-3-2 إلى الخلايا 293FT المطلية في الخطوة 1.1 والمحتضنة في 37 درجه مئوية ، 5% CO2 بين عشيه وضحيها.
  4. اليوم الثالث: قم بازاله الوسائط التي تحتوي علي الازاحه من كل بئر وأضف 2 مل من وسائط النمو الكاملة إلى كل بئر. احتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة تقريبا.
  5. اليوم 4: جمع سوبرناتانت الفيروسية من كل بئر باستخدام حقنه 3 مل وتصفيه من خلال فلتر 0.45 μm في أنبوب الطرد المركزي 2 مل.
  6. اختياري: إذا كان من المرغوب فيه جمع دفعه ثانيه من الفيروس ، أضافه بلطف 2 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل لكل بئر واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 لمده 24 ساعة تقريبا.
  7. اليوم الخامس (اختياري): جمع الجولة الثانية من سوبرناتانت الفيروسية كما هو الوضع في الخطوة 1.5.
    ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا عن طريق تجميد سوبرناتانت الفيروسية.

2-توليد الخلايا السرطانية التي تعبر بثبات عن لوسيفيراز والبروتين الفلوري

ملاحظه: يصف البروتوكول التالي كيفيه أولا لتسميه بشكل ثابت الخلايا 4t1 مع لوسيفيراز اليراع والبروتين الفلوري (zsgreen) باستخدام اثنين من المتجات مع الجينات اختيار فريدة من نوعها. ثم يتم استخدام ناقلالفيروسية 3 للتلاعب التعبير عن الجينات مرشح. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام النواقل الفيروسية التي تقدم في الوقت نفسه البروتين الفلوري والتلاعب الجيني كبديل (كما هو الحال في التجارب التمثيلية أدناه). يمكن استخدام الخلايا السرطانية الأخرى ، ولكن يجب تحسين أرقام الخلايا للخطوات 2.1 و 2.7.1.

  1. لوحه 4T1 الخلايا في 1.5 × 105 خلايا/جيدا في لوحه 12 بئر في وسائل الاعلام النمو الكامل (10 ٪ في dmem مع 1 ٪ البنسلين/ستربتومايسين و 2 مم L-الجلوتامين) واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
  2. تصيب الخلايا 4t1 مع ماده طافي الفيروسية المتولدة في الخطوة 1 علي النحو التالي.
    1. يستنشق وسائل الاعلام النمو من الخلايا وأضافه 500 μl من لوسيفيراز الفيروسية ماده طافي و 500 μl من البروتين الفلوري ماده طافي الفيروسية لتصيب في وقت واحد الخلايا مع كل من لوسيفيراز والبروتين الفلورية ماده طافي الفيروسية.
    2. أضافه 1 μL من 8 ملغ/مل هيكادييمثريدين بروميد (انظر جدول المواد).
    3. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ حتى 75-90 ٪ متموج (عاده 24-48 ساعة).
  3. تريسينايز الخلايا 4T1 مع 500 μL من التريبسين لمده 2-5 دقيقه (يجب ان الخلايا شطف بحريه قباله الجزء السفلي من البئر). نقل جميع الخلايا إلى طبق 6 سم في 4 مل من وسائل الاعلام الاختيار (النمو الكامل وسائل الاعلام التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة) التالي تبريد التريبسين. طبق صحن 6 سم من خلايا التحكم غير المصابة في نفس وسائط التحديد.
    ملاحظه: يجب تحديد تركيز المضادات الحيوية المناسبة في وقت مبكر من خلال اختبار عده جرعات. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن أيضا استخدام الفرز الخلوي المنشط لتحديد الخلايا المسمية فلوريسسينتلي بدلا من اختيار المخدرات.
  4. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 في وسائل الاعلام الاختيار وتقسيم الخلايا عند الضرورة حتى جميع خلايا التحكم غير المصابة ميتة (تعتمد علي اختيار الجينات وخط الخلية).
  5. تاكد من ان الخلايا 4T1 المصابة هي التعبير عن ZsGreen بروتين الفلورسنت باستخدام الاثاره الخضراء (450-490 nm)/الانبعاثات (500-550 nm) مرشح تعيين علي المجهر الفلورسنت المقلوب في 50-100x التكبير.
  6. تاكد من ان الخلايا 4t1 المصابة تعبر عن لوسيفيراز باستخدام مجموعه النشاط لوسيفيراز المتاحة تجاريا علي النحو التالي.
    1. استخدام حجم الحد الأدنى من 1x السلبي تحلل العازلة ل lyse luciferase-التعبير عن الخلايا 4T1 والسيطرة علي الخلايا 4T1 التي لا تعبر عن luciferase ، تهتز بلطف لمده 30 دقيقه.
    2. أضافه 20 μl من الخلية محلله إلى لوحه بيضاء القاع 96 ومن ثم 50 μl من كاشف المقايسة لوسيفيراز من مجموعه النشاط لوسيفيراز.
    3. استخدام قارئ لوحه لقياس التلالؤ من الخلايا في جميع الأطوال الموجية في الطيف باستخدام اعداد التلالؤ.
      ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا بتجميد الخلايا المحولة بشكل ثابت.
  7. التلاعب بالتعبير عن الجينات المرشحة علي النحو التالي:
    1. لوحه 6 × 105 المسمية 4t1 الخلايا من الخطوة 2.6 علي طبق 60 مم في 4 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
    2. يستنشق وسائل الاعلام النمو من كل بئر وأضافه 2 مل من وسائل الاعلام النمو الكامل التي تحتوي علي 4 μL من 8 ملغ/مل هيكاديميثريدين بروميد.
    3. أضافه 2 مل من سوبرناتانت الفيروسية من الخطوة 1 إلى الخلايا مطلي من الخطوة 2.7.2 واحتضان في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2 بين عشيه وضحيها.
    4. تريسينايز الخلايا 4T1 مع 500 μL من التريبسين لمده 2-5 دقيقه (يجب ان الخلايا شطف بحريه قباله الجزء السفلي من البئر). نقل جميع الخلايا إلى طبق 10 سم في 10 مل من وسائل الاعلام الاختيار (النمو الكامل وسائل الاعلام التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة) التالي تبريد التريبسين. لوحه بعض السيطرة غير المصابة المسمي 4T1 الخلايا في نفس وسائط التحديد.
    5. احتضان الخلايا في 37 درجه مئوية ، و 5 ٪ CO2 في وسائل الاعلام الاختيار وتقسيم الخلايا عند الضرورة حتى تكون جميع الخلايا غير المصابة ميتة.
    6. أكدت ان التعبير من المرشح مورثه يكون غيرت يستعمل مقاربه معياريه مثل لطخه غربيه20 أو [قبكر]21.
    7. فحص التلالؤ والفلوري كما هو الحال في الخطوات 2.5-2.6 لتحديد مدي تشابهها في السيطرة والخلايا الضربة القاضية ، وهذا يمكن ان تتغير (انظر المناقشة).
      ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا بتجميد الخلايا المحولة بشكل ثابت.

3. الأمثل للتصميم التجريبي في الجسم الخاص

  1. تحسين عدد الخلايا المناسبة ومده التجربة للعبء المنتشر المطلوب علي النحو التالي.
    1. قم بتوسيع خلايا 4T1 الفلورية والملونة من الخطوة 2.6 في وسائط النمو الكاملة بحيث تتوفر الخلايا الزائدة في اليوم المطلوب من الحقن.
    2. اعداد الخلايا لحقن الوريد الذيل كما هو موضح في الخطوة 4.2. لتحديد رقم الخلية الأمثل للحقن ، أعاده تعليق الخلايا في عده تركيزات مختلفه في 100 μL من 1x تلفزيوني.
      ملاحظه: نوصي باختبار مجموعه من أرقام الخلايا/الماوس من 25,000 حتى 500,000.
    3. إبقاء تعليق الخلية علي الجليد حتى الحقن.
    4. حقن كل التخفيف من الخلايا 4T1 من الخطوة 3-1-2 إلى 3-4 الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي الموصوفة في الخطوة 4.3 (انظر أدناه).
    5. أعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل. وينبغي التحقق من الفئران لعلامات الم أو الاستغاثة 3x أسبوعيا.
    6. رصد الفئران لتشكيل الانبثاث والنمو لمده 3-6 أسابيع (خط الخلية وسلاله الماوس تعتمد) باستخدام جهاز في الجسم الحية التصوير الحيواني (انظر الخطوتين 5 و 6).
      1. موت ببطء الفئران 3-6 أسابيع بعد حقن الوريد الذيل وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية القياسية.
      2. اعداد الرئتين وتقييم حجم الانبثاث وعدد الموصوفة في الخطوة 7.
      3. اختر المدة الزمنيه المناسبة لنمو النقائل للحصول علي العبء المنتشر المطلوب (انظر المناقشة).

4. حقن الوريد الذيل من الخلايا السرطانية المسمية

ملاحظه: تم تحسين الخطوة 4.2.4 للخلايا 4T1 تنمو في الفئران BALB/c synجينه. إذا تم استخدام خطوط الخلايا السرطانية الأخرى وسلالات الماوس ، يجب ان يكون عدد الخلايا التي تم حقنها ، وطول الفحص الأمثل أولا.

  1. قم بتوسيع خطوط الخلايا 4T1 التي تم إنشاؤها في الخطوة 2 علي 2 15 سم الاطباق في وسائل الاعلام النمو الكامل بحيث تتوفر الخلايا الزائدة في يوم الحقن.
  2. اعداد الخلايا لحقن الوريد الذيل علي النحو التالي:
    1. يستنشق وسائل الاعلام وشطف لوحات الخلية مع 1x تلفزيوني.
    2. تريسينايز الخلايا مع 5 مل من التريبسين لكل لوحه 15 سم لمده 2-5 دقيقه (يجب ان الخلايا شطف بحريه قباله الجزء السفلي من البئر). نقل جميع الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل. يغسل الخلايا المتبقية من طبق ثقافة الانسجه مع ما يكفي من وسائل الاعلام النمو الكامل لإرواء التريبسين وأضافه الغسيل إلى نفس الأنبوب المخروطي.
    3. احسب الخلايا باستخدام عداد خليه تلقائي لتحديد رقم الخلية الإجمالي.
    4. الطرد المركزي الخلايا في 122 x g لمده 3 دقائق ، يستنشق supernatant ، وأعاده تعليق الخلايا في 1X تلفزيوني في التركيز المطلوب. هنا ، 2.5 x 10 يتم حقن4 خلايا في كل الماوس في 100 μl من تلفزيوني ، التالي فان أعاده التعليق الخلايا في 2.5 x 105 خلايا/مل. إبقاء تعليق الخلية علي الجليد حتى الحقن.
      ملاحظه: من المهم للحد من مقدار الوقت بين التريسينزيشن من الخلايا وحقن الوريد الذيل إلى ما يقرب من 1 ساعة.
  3. حقن الخلايا 4T1 من الخطوة 4.2.5 إلى الفئران عبر الوريد الذيل الجانبي علي النحو التالي:
    1. العمل في غطاء محرك السرير في منشاه الحيوانية, بلطف ولكن بشكل جيد خلط الخلايا عن طريق عكس الأنبوب أو باستخدام حقنه 1 مل لضمان ان يتم أعاده تعليقها بانتظام. تاكد دائما من أعاده تعليق الخلايا قبل تحميل الحقنه.
    2. تحميل 1 مل Luer-قفل حقنه مع تعليق الخلية وطرد فقاعات الهواء الزائدة. وضع 1/2 بوصه, 30-مقياس ابره علي حقنه مع شطبه وطرد فقاعات الهواء.
    3. وضع برفق الماوس في القوارض يقيد.
    4. يجب ان تكون الاورده الخلفية الجانبية مرئية ومتوسعة. إذا لم يكن كذلك ، قرصه برفق قاعده الذيل وتراجع الذيل في مياه الصنبور الدافئة لتمدد الاورده.
      ملاحظه: يمكن أيضا ان يتحقق تمدد الاورده عن طريق وضع قفص الماوس تحت مصباح التدفئة و/أو علي راس لوحه التدفئة.
    5. استخدام مسح الكحول لتنظيف الذيل. ادراج الابره في الوريد الذيل ، شطبه الجانب حتى ، وحقن 100 μL من تعليق الخلية.
      ملاحظه: إذا تم ادراج الابره بشكل صحيح في الوريد ، فانه يجب ان تنزلق بسهوله قليلا إلى الامام والخلف ، ويجب ان لا يكون هناك مقاومه عندما يتم دفع المكبس. الحقن الناجحة يجب ان يؤدي أيضا إلى "تدفق" في اللون الأزرق من الوريد يتحول الأبيض لبضع ثوان بعد الحقن.
  4. أزاله الابره ببطء واستخدام الشاش المعقمة ، وتطبيق الضغط علي موقع الحقن لوقف اي نزيف.
  5. أعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل. وينبغي التحقق من الفئران لعلامات الم أو الاستغاثة 3x أسبوعيا.
  6. رصد الفئران لتشكيل الانبثاث والنمو لمده 3-6 أسابيع (خط الخلية وسلاله الماوس تعتمد) باستخدام جهاز في الجسم الحية التصوير الحيواني (انظر الخطوتين 5 و 6).

5. رصد العبء المنتشر من قبل مضان مع الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه

ملاحظه: لا صوره الحيوانية لمضان مع اشاره الاناره النشطة.

  1. إذا فقط التصوير التلالؤ ، انتقل إلى الخطوة 6.
  2. قم بتشغيل جهاز تصوير الصور الحيوانية الحية.
  3. قم باعداد نظام التخدير الحي للتصوير الحيواني وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لتقديم ما بين 1.5 ٪ و 2 ٪ ايزوفلونان إلى غرفه التخدير وغرفه التصوير.
  4. تخدير الفئران مع فلوريسسينتلي المسمي الانبثاث من الخطوة 4 عن طريق وضعها في غرفه التخدير وتقديم 1.5-2.5 ٪ ايزوفلوراني.
  5. افتح برنامج الصور (انظر جدول المواد) وتسجيل الدخول.
  6. انقر فوق الزر تهيئه وانتظر الجهاز لتهيئه.
  7. تغيير حقل العرض إلى D.
    ملاحظه: يمكن أيضا استخدام حقل العرض C إذا كانت هناك حاجه إلى عرض أقرب للماوس ، ولكن هذا يحد من عدد الفئران التي يمكن ان تكون في نفس الوقت.
  8. بمجرد ان يشير البرنامج إلى ان الكاميرا قد وصلت إلى درجه الحرارة المناسبة ، انقر فوق زر معالج التصوير ، واختر الفلورية ثم اختر زوج الفلتر المناسب من القائمة المنسدلة.
    ملاحظه: إذا كان فلوكوفيري المستخدمة ليس خيارا ، اختر إدخال EX/EM واكتب الاثاره والانبعاثات المطلوبة.
  9. ضع الماوس في الغرفة كما هو موضح في الخطوة 3-2.
  10. انقر فوق الحصول علي تسلسل.
  11. بعد التصوير ، وأعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل.
  12. كرر الخطوة 5.2 والخطوات 5.7-5.9 مع ماوس واحد علي الأقل لا يحتوي علي الانبثاث. ملاحظه: سيتم استخدام هذا الماوس لقياس وطرح اشاره الخلفية اثناء التحليل (الخطوة 8).
  13. صوره 2-3 مرات أسبوعيا لمده التجربة.

6. رصد العبء المنتشر عن طريق التلالؤ الإحيائي مع الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه

  1. قم بتشغيل جهاز التصوير الحيواني الحي في الجسم واعداد البرنامج علي النحو التالي.
    1. افتح برنامج الصور (انظر جدول المواد) وتسجيل الدخول. انقر فوق الزر تهيئه وانتظر الجهاز لتهيئه. تغيير حقل العرض إلى D.
      ملاحظه: يمكن استخدام حقل طريقه العرض C للحصول علي طريقه عرض أقرب إلى صوره الجسم الماوس بالبالكامل; ومع ذلك ، هذا يحد من عدد الفئران التي يمكن ان تكون في وقت واحد.
    2. للاستخدام للمرة الاولي ، يمكنك تحرير إعدادات التعريض الضوئي كما يلي: انقر علي تعديل | التفضيلات | الاستحواذ | التعرض التلقائي وتغيير الحد الأقصى لوقت التعرض من الافتراضي 60 ثانيه إلى 300 ثانيه وانقر فوق OK.
      ملاحظه: لا تقم بتغيير إيه معلمات أخرى في علامة التبويب التعريض التلقائي.
  2. اعداد نظام التخدير وفقا لإرشادات الشركة المصنعة لتقديم ما بين 1.5 ٪ و 2 ٪ ايزوفلونان إلى غرفه التخدير وغرفه التصوير.
  3. تاكد من ان الكاميرا قد وصلت إلى درجه الحرارة المناسبة قبل الانتقال إلى الخطوة 6.4.
  4. تخدير الفئران التي تحتوي علي الانبثاث من الخطوة 4 عن طريق وضعها في غرفه التخدير وتقديم 1.5-2.5 ٪ ايزوفلوراني.
  5. اعداد الفئران للتصوير التلالؤ الإحيائي علي النحو التالي.
    1. تحميل حقنه 1 مل مع د-luciferin (30 ملغ/مل في مد--بودي) ومن ثم أضافه 1/2 بوصه 30-مقياس ابره إلى حقنه وطرد فقاعات الهواء.
    2. قياس وتسجيل كتله الفاره التخدير.
    3. كبح جماح الماوس عن طريق معسر الرقبة من رقبتهم باستخدام الإبهام ومؤشر الأصابع واستيعاب الذيل بين اصبع الخنصر وقاعده اليد. عكس الماوس في زاوية 45 درجه ، مع راسه وأشار إلى الأسفل.
    4. ادراج الابره ، شطبه الجانب حتى ، في الجانب الأيسر داخل الماوس (IP) الفضاء. تاكيد الإدخال في مساحة IP عن طريق سحب وحده تخزين صغيره. لا ينبغي ان يكون هناك لون في قاعده الابره عند الرسم مره أخرى في الفضاء IP.
    5. حقن الحجم المناسب من D-luciferin لجرعه من 150 ملغ/كغ.
    6. مباشره بعد أداره د-luciferin ، بدء جهاز ضبط الوقت ووضع الماوس شقه علي ظهرها في جهاز التصوير مع انفه في مخروط الأنف والتاكد من ان 1.5-2.5 ٪ ايزوفلوراني تدار. وضع فواصل بين كل الماوس إذا التصوير الفئران متعددة. تاكد من وضع الفئران كمسطحه قدر الإمكان (اي لا يميل إلى جانب واحد).
    7. انقر فوق مربعات الاناره والصور ثم انقر فوق اكتساب في لوحه التحكم الاستحواذ.
  6. الحصول باستمرار علي الصور البيولوجية الهادئة حتى يتم تحقيق اشاره الذروة واستخدام الصورة مع اشاره الذروة البيولوجية للتحليل.
  7. بعد التصوير ، وأعاده الماوس إلى قفصها ورصد لمده 15 دقيقه لضمان الشفاء الكامل.
  8. صوره 2-3 مرات أسبوعيا لمده التجربة.

7. القياس الكمي لعدد وحجم الانبثاث

ملاحظه: يجب تحديد طول الفترة الزمنيه المسموح بها لنمو الانبثاث لكل خط خليه وسلاله الماوس ، وسوف تتاثر بعدد الخلايا التي تم حقنها.

  1. موت ببطء الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية القياسية.
  2. عزل وأزاله الرئتين من كل الماوس وشطف في 1x تلفزيوني لأزاله الدم الزائد.
  3. افصل الرئتين برفق إلى فصوص.
  4. الحصول علي صور من الانبثاث ZsGreen في فصوص في 10x في حقل مشرق والفلورية باستخدام منظار الفلورسنت الفلورية مع فلتر العريضة GFP (الاثاره 470/40x).
    ملاحظه: الحفاظ علي نفس التكبير والسطوع لكافة العينات. قد يختلف التكبير المستخدم تبعا لحجم وعدد وسطوع النقائل بالاضافه إلى مجال الرؤية الخاص بالمجهر المستخدم.
  5. استخدام برنامج تحليل الصور لقياس حجم وعدد الانبثاث من الصور.
    ملاحظه: البروتوكول لتحليل الصور هو البرامج التابعة ويمكن ان يكون الأمثل مع الأورام من خطوه 3. بدلا من ذلك ، عد عدد الانبثاث في كل الرئة يدويا باستخدام المنظار الفراغي الفلورسنت. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا ويمكن القيام بالخطوة 8 في اي مرحله بعد جمع جميع الصور في الجسم الفيفو.

8. تجهيز وتحليل البيانات من الصور التي تم الحصول عليها مع الحية في جهاز التصوير الحيواني حيه

  1. فتح جميع ملفات الصور لكل الماوس في برنامج الصورة.
    ملاحظه: استخدام الصورة مع اشاره الذروة بيوكولوميننت للتحليل
  2. تاكد من ان الوحدات في الإشراق للبيانات البيولوجية والكفاءة لبيانات الفلورسنت عن طريق النقر علي السهم في الجانب العلوي الأيسر من نافذه الصورة وتغييره إلى الوحدة المناسبة.
  3. استخدم الصورة من النقطة الزمنيه الاخيره لإنشاء منطقه ذات فائده (ROI) علي النحو التالي.
    1. انقر فوق أدوات ROI في نافذه لوح الاداات . ادراج عائد استثمار واحد بالنقر فوق السهم وتحديد 1.
    2. انقر فوق حدود عائد الاستثمار وحركها فوق صدر الماوس. اضبط حجم عائد الاستثمار بحيث يغطي صدر الماوس ولا يستبعد الاشاره.
  4. انقر فوق قياس ROIs وانسخ أو اكتب الرقم الاولي في ورقه excel.
    ملاحظه: بالنسبة للبيانات البيولوجية الهادئة ، حدد التدفق الكلي (الفوتونات/الثانية) ، وهو مجموع التالق في عائد الاستثمار. وبما ان النقائل لا تنمو بالضرورة بشكل موحد ، فان التدفق الإجمالي يفضل علي الإشراق المتوسط لأنه يقيس مجموع العبء المنتشر. المثل ، بالنسبة لبيانات الفلورسنت ، ينبغي استخدام الكفاءة الاجماليه (الضوء المنبعث (الفوتون/الثاني)/ضوء الاثاره (الفوتونات/الثانية) بدلا من متوسط الكفاءة.
  5. انقر بزر الماوس الأيمن في ملف الصورة لنسخ عائد الاستثمار المستخدم في الخطوة 8.3 ولصقه في كل ملف الصورة.
    ملاحظه: عند التحديد الكمي للصور الفلورية ، يمكنك تحديد المنطقة نفسها علي الماوس الذي تم تصويره بدون ورم خبيث. استخدام هذه الاشاره كاشاره الخلفية وطرحها من كل صوره الماوس التي تحتوي علي الانبثاث الفلورسنت التي تم الحصول عليها.
  6. نقل ROIs التي تم لصقها عبر نفس المنطقة المحددة في الخطوة 8.3.4 لكل صوره وكرر الخطوة 8.4.
  7. ارسم البيانات الاوليه وحللها كما يلي (راجع الجدول التكميلي 2).
    1. قم بتسجيل10 تحويل البيانات الاوليه لكل ماوس باستخدام الصيغة المشار اليها (الجدول التكميلي 2) والمؤامرة كما في الشكل 2د والشكل 4و. التحول سجل10 يجعل منحني النمو الذي يميل إلى ان تكون هندسية ويقلل من هيتيروسسيداستيسيتي.
    2. باستخدام الانحدار الخطي ، حساب المنحدر من الخط المجهز إلى سجل10 تحويل البيانات لكل الماوس رسمها في الخطوة 8.7.1 (الجدول التكميلي 2). الرجوع إلى الصيغة في الجدول التكميلي 2 لتناسب الخط وحساب الميل في خطوه واحده.
    3. رسم القيم العددية للمنحدرات كما في الشكل 2ه والشكل 4ز. استخدم اختبار t للطالب أو ANOVA باتجاه واحد (لأكثر من مجموعتين) علي المنحدرات لتحديد الاهميه الاحصائيه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لإظهار النهج المذكور أعلاه ، قمنا باجراء دليل علي تجربه المفهوم الذي عامل النسخ المتماثل الحرجة ، RPA3 وقد أسقطت في خط خليه سرطان الثدي المنتشرة الفئران (4T122). في حين ان البروتوكول يصف وصف الخلايا مع كل من لوسيفيراز والبروتينات الفلورية قبل التلاعب الوراثية ، استخدمنا نهج معدله لان ناقلات rnai أيضا تسليم zsgreen (الشكل 2ا). أولا ، كانت خلايا 4t1 محوله بشكل ثابت مع لينتيفيرال بناء ترميز اليراع لوسيفيرياس ومقاومه هايجرومايسين (phage-لوسيفيراز-اليرس-hy...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الخطوات الهامه للأسلوب
من الاهميه بمكان لتحسين عدد الخلايا التي تم حقنها (الخطوة 3) لخط خليه معينه وسلاله الماوس لان هذا يمكن ان تؤثر بشكل كبير علي عدد الانبثاث التي تشكل وطول التجربة. إذا تم حقن خلايا كثيره جدا أو الانبثاث تنمو لفتره طويلة جدا ، قد يكون من الصعب علي الانبثاث العد مما يجعل من الصعب تقييم اثار التلاعب الوراثية. ومع ذلك ، إذا تم حقن عدد قليل جدا من الخلايا ، قد تكون قليله أو لا توجد الانبثاث. التالي ، ينبغي اجراء تجربه أوليه باستخدام اعداد مختلفه من الخلايا لتحديد العدد الأمثل وطول الوق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

شكر وتقدير

نشكر اميلي نورتون للمساعدة في العدوى الفيروسية والقراءة النقدية للمخطوطة. كما نشكر رايان كاناي علي المساعدة في الحصول علي صور الرئتين والمساعدة في تحليل الصور للنقائل الخضراء في الرئتين. ونشكر موظفي مرفق البحوث الحيوانية علي دعمهم ومساعدتهم في اعداد هذا الفيديو. وكان هذا العمل مدعوما من قبل سوزان g. Komen منحه الوظيفي محفز التي منحت لj.m.l. (#CCR17477184).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10٪ جل SDS-PAGEللبقعة الغربية
2.5٪ TrypsinGibco15090-046Trypsin لزراعة الأنسجة
96 لوحة فحص بيضاء ذات قاع مسطحجيدا Corning3922لقياس إشارة لوسيفيراز ورينيلا في الخلايا المستنبتة
مناديللتعقيم موقع الحقن قبل إنجيسيتون الوريد
الذيل BALB / C الفئران ( أنثى ، 6 أسابيع)TaconicBALB-Fللاستعمار النقيلي في وريد الذيل ومقايسات العبء
BSA العاديةVWR Ameresco97061-416للبقعة
الغربية تحلل الخلايا العازلةالخليةلجمع عينات البروتين
مرشحات حقنة Celltreat ، PES 30 مم ، 0.45 & mu ؛ مCelltreat40-229749-CSلتصفية المواد الطافية
الفيروسية CO2< / sub> وغرفةللقتل الرحيم للفئران
مجموعة فحص مراسل ثنائي اللوسيفيرازPromegaE1960لقياس إشارة لوسيفيراز ورينيلا في الخلايا المستنبتة
Dulbecco & 39; s فوسفات مخزن محلول ملحيHimediaTS1006ل PBS
EDTAVWR97061-406تستخدم لتخفيف التربسين لزراعة الأنسجة
FBS 100٪ من أصل أمريكيVWR97068-085مكون من وسائط النمو الكاملة
Fujifilm LAS-3000 هلام تصويرفوجي فيلمللبقعة الغربية
GAPDH (14C10) إشارات خلية Rabibit mAb2118ل اللطخة الغربية
الماعز المضادة للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، HRP المترافقThermo Scientific31460لخلايا
الكلى الجنينية البشرية الغربية ، HEK-293FTInvitrogenR70007خط الخلايا المستخدم لتعبئة الفيروس
HyClone DMEM / High clucoseGE Healthcare Life SciencesSH30243.01مكون من وسائط النمو الكاملة
Hygromycin B ، درجة نقية للغايةVWR Ameresco97064-810لاختيار المضادات الحيوية للخلايا المصابة
I3-P / i3 أجهزة جزيئية متعددة الأوضاع Microplate / EAلقياس إشارة لوسيفيراز ورينيلا في الخلايا المستنبتة
Isofluraneلتخدير الفئران
IVIS Lumina XRMS نظام التصوير في الجسم الحي (جهاز تصوير الحية في الجسم الحي)PerkinElmerCLS136340للتصوير في الجسم الحي للعبء النقيلي
Leica M205 FA & Lecia DCF3000 G (مرشحات GFP والمجال الساطع)Leica Microsystemsالمجهر والكاميرا لتصور وعد وأخذ أجزاء من النقائل في الرئتين ؛ تكبير 10X ، التعرض لمدة 3.5 ثانية ، 1.4 كسب
L-GlutamineGibco25030-081مكون من وسائط النمو
الكاملة تقنيات Lipofectamine 3000LifeL3000008لتعداء
مراسل YAP / TAZ-TEADصورة حية 3.2 (برنامج الصور)PerkinElmerلخلايا
سرطان الثدي IVIS Mouse ، 4T1معهد كارمانوس للسرطانAslakson ، CJ et al. ، 1992فأر خط خلية الثدي
متعدد المقاييس الإصدار 3.0Fujifilmلقياس كثافة نطاق اللطخة الغربية
Opti-MEM (عازلة تعداد)Gibco31985-062لتعبئة الفيروسات والتعداء
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15140-122مكون من وسائط النمو الكاملة
مجموعة فحص البروتين بيرس BCAThermo Scientific23225لقياس تركيز البروتين
بيرس فوسفاتيز أقراص صغيرةThermo ScientificA32957تمت إضافته إلى المخزن المؤقت لتحلل الخلايا
Pierce Protease Inhibitor أقراص صغيرةThermo ScientificA32953تمت إضافته إلى عازلة تحلل الخلية
Polybrene (بروميد سداسي ديميثرين)Sigma-Aldrich45-H9268للعدوى
PuromycinSigma-Aldrich45-P7255لاختيار المضادات الحيوية للخلايا المصابة
القوارضلكبح جماح الفئران أثناء تشغيل الوريد
الذيل SDS-PAGEللبقعة الغربية
TAZ (V3886) إشارات خلية الأجسام المضادة4883للبقعة الغربية
TBST العازلةللبقعة الغربية
TC20 عداد الخلايا الآليBio-Radلعد الخلايا
ناقلاتانظر الجدول 1 للحصول على قائمة كاملة بالنواقل
VWR مجهر التألق المقلوبVWR89404-464لتصور التألق في ZSGreen الخلايا المسماة
عازلةللبقعة الغربية
XenoLight D-Luciferin K + SaltPerkinElmer122799الركيزة المحقونة في الفئران لصور IVIS المضيئة بيولوجيا في الجسم الحي
X-tremeGENE 9 كاشف تعداء الحمض النووي (محلول دهني للتعدين)Roche6365787001لتغليف الفيروسات
YAP (D8H1X) XP Rabbit mAbCell Signaling14074للبقعة الغربية
كحولية إشارات القتل الرحيم Imagej تستخدم لتحليل الصور لنقائل الرئة: تم تعيين العتبة إلى 25 & 100 Immuno-Blot PVDF Membrane Biorad 1620177 للبقعة الغربية برنامج النقيلي برنامج تقييد النقل الغربي

المراجع

  1. Ferlay, J. S. I., et al. GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 11. , Available from: http://globocan.iarc.fr (2013).
  2. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  4. Wendt, M. K., Molter, J., Flask, C. A., Schiemann, W. P. In vivo dual substrate bioluminescent imaging. Journal of Visualized Experiments. (56), (2011).
  5. Moret, R., et al. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Journal of Visualized Experiments. (147), (2019).
  6. Lizardo, M. M., Sorensen, P. H. Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay. Journal of Visualized Experiments. (133), (2018).
  7. Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  8. Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clinical and Experimental Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
  9. Lim, E., et al. Monitoring tumor metastases and osteolytic lesions with bioluminescence and micro CT imaging. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  10. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  11. Cordero, A. B., Kwon, Y., Hua, X., Godwin, A. K. In vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer. Journal of Visualized Experiments. (42), (2010).
  12. Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  13. Lim, E., Modi, K. D., Kim, J. In vivo bioluminescent imaging of mammary tumors using IVIS spectrum. Journal of Visualized Experiments. (26), (2009).
  14. Oshima, G., et al. Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones. Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).
  15. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  16. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (37), 2441-2450 (2012).
  17. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers (Basel). 10 (4), (2018).
  18. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cell Signal. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  19. Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114 (4), 457-467 (2003).
  20. Journal of Visualized Experiments Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
  21. Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
  22. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Ressearch. 52 (6), 1399-1405 (1992).
  23. Fellmann, C., et al. Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Molecular Cell. 41 (6), 733-746 (2011).
  24. Reticker-Flynn, N. E., et al. A combinatorial extracellular matrix platform identifies cell-extracellular matrix interactions that correlate with metastasis. Nature Communications. 3, 1122(2012).
  25. Sun, Z., et al. Prognostic Value of Yes-Associated Protein 1 (YAP1) in Various Cancers: A Meta-Analysis. Public Library of Science One. 10 (8), 0135119(2015).
  26. Feng, J., Ren, P., Gou, J., Li, Z. Prognostic significance of TAZ expression in various cancers: a meta-analysis. Onco Targets and Therapy. 9, 5235-5244 (2016).
  27. Ge, L., et al. Yes-associated protein expression in head and neck squamous cell carcinoma nodal metastasis. Public Library of Science One. 6 (11), 27529(2011).
  28. Zhang, X., et al. The Hippo pathway transcriptional co-activator, YAP, is an ovarian cancer oncogene. Oncogene. 30 (25), 2810-2822 (2011).
  29. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  30. Kim, T., et al. MRTF potentiates TEAD-YAP transcriptional activity causing metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 36 (4), 520-535 (2017).
  31. Nallet-Staub, F., et al. Pro-invasive activity of the Hippo pathway effectors YAP and TAZ in cutaneous melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 134 (1), 123-132 (2014).
  32. Hsu, Y. L., et al. Angiomotin decreases lung cancer progression by sequestering oncogenic YAP/TAZ and decreasing Cyr61 expression. Oncogene. 34 (31), 4056-4068 (2015).
  33. Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. European Molecular Biology Organization Journal. 33 (5), 468-481 (2014).
  34. Gu, J. J., et al. Inactivation of ABL kinases suppresses non-small cell lung cancer metastasis. Journal of Clinical Investigation Insight. 1 (21), 89647(2016).
  35. Diepenbruck, M., et al. Tead2 expression levels control the subcellular distribution of Yap and Taz, zyxin expression and epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Science. 127, Pt 7 1523-1536 (2014).
  36. Han, S., et al. Suppression of miR-16 promotes tumor growth and metastasis through reversely regulating YAP1 in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 8 (34), 56635-56650 (2017).
  37. Yin, K., et al. Netrin-1 promotes metastasis of gastric cancer by regulating YAP activity. Biochemical Biophysical Research Communications. 496 (1), 76-82 (2018).
  38. Guo, L., et al. Knockdown of TAZ modifies triple-negative breast cancer cell sensitivity to EGFR inhibitors by regulating YAP expression. Oncology Reports. 36 (2), 729-736 (2016).
  39. Liu, Y. N., et al. Loss of Androgen-Regulated MicroRNA 1 Activates SRC and Promotes Prostate Cancer Bone Metastasis. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1940-1951 (2015).
  40. Bartucci, M., et al. TAZ is required for metastatic activity and chemoresistance of breast cancer stem cells. Oncogene. 34 (6), 681-690 (2015).
  41. Wang, T., et al. YAP promotes breast cancer metastasis by repressing growth differentiation factor-15. Biochimica et Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1864, 5 Pt A 1744-1753 (2018).
  42. Wang, J., Rouse, C., Jasper, J. S., Pendergast, A. M. ABL kinases promote breast cancer osteolytic metastasis by modulating tumor-bone interactions through TAZ and STAT5 signaling. Science Signaling. 9 (413), (2016).
  43. Sun, S., Irvine, K. D. Cellular Organization and Cytoskeletal Regulation of the Hippo Signaling Network. Trends in Cell Biology. 26 (9), 694-704 (2016).
  44. Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34 (48), 5879-5889 (2015).
  45. Li, C., et al. A ROR1-HER3-lncRNA signalling axis modulates the Hippo-YAP pathway to regulate bone metastasis. Nature Cell Biology. 19 (2), 106-119 (2017).
  46. Pei, T., et al. YAP is a critical oncogene in human cholangiocarcinoma. Oncotarget. 6 (19), 17206-17220 (2015).
  47. Qiao, Y., et al. YAP Regulates Actin Dynamics through ARHGAP29 and Promotes Metastasis. Cell Reports. 19 (8), 1495-1502 (2017).
  48. Zhou, W., Li, X., Premont, R. T. Expanding functions of GIT Arf GTPase-activating proteins, PIX Rho guanine nucleotide exchange factors and GIT-PIX complexes. Journal of Cell Science. 129 (10), 1963-1974 (2016).
  49. Haemmerle, M., et al. Platelets reduce anoikis and promote metastasis by activating YAP1 signaling. Nature Communcations. 8 (1), 310(2017).
  50. Liu, Y., et al. Increased TEAD4 expression and nuclear localization in colorectal cancer promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in a YAP-independent manner. Oncogene. 35 (21), 2789-2800 (2016).
  51. Hiemer, S. E., et al. A YAP/TAZ-Regulated Molecular Signature Is Associated with Oral Squamous Cell Carcinoma. Molecular Cancer Research. 13 (6), 957-968 (2015).
  52. Lee, H. J., et al. Fluid shear stress activates YAP1 to promote cancer cell motility. Nature Communications. 8, 14122(2017).
  53. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  54. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388, Pt 1 217-225 (2005).
  55. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  56. Chen, M. B., Lamar, J. M., Li, R., Hynes, R. O., Kamm, R. D. Elucidation of the Roles of Tumor Integrin beta1 in the Extravasation Stage of the Metastasis Cascade. Cancer Resesearch. 76 (9), 2513-2524 (2016).
  57. Labelle, M., Begum, S., Hynes, R. O. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis. Cancer Cell. 20 (5), 576-590 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نقائل سرطان الثدياستعمار الرئةالتصوير بالتلألؤ البيولوجيالتصوير الفلوريالعبء النقائليتثبيط YAP TAZتكميم النقائلالتصميم التجريبي في الجسم الحي
الجمع بين استخدام الذيل الوريد الانبثاث الاختبارات والوقت الحقيقي في التصوير فيفو لقياس سرطان الثدي الاستعمار المنتشر والعبء في الرئتين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.