Method Article

تحديد حجم الكبد في لارفال زيبرافيش باستخدام المجهر برايتفيلد

DOI:

10.3791/60744

⸱

February 2nd, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Department of Oncological Sciences, and Huntsman Cancer Institute, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نبين طريقة لقياس حجم الكبد في سمك الحمار الوحشي اليرقان، وتوفير وسيلة لتقييم آثار التلاعب الجيني والدوائي على نمو الكبد والتنمية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العديد من نماذج حمار وحشي معدلة وراثيا من سرطان الكبد الخلوي (HCC)، يمكن ملاحظة الأوميغا الكبدي خلال المراحل اليرقات المبكرة. يوفر تحديد حجم الكبد اليرقات يُقدم في نماذج HCC لسمك الحمار الوحشي وسيلة لتقييم آثار الأدوية وغيرها من التلاعبات على النمط الظاهري المرتبط بالأوكوجين بسرعة. هنا نعرض كيفية إصلاح يرقات سمك الحمار الوحشي ، وتشريح الأنسجة المحيطة بالكبد ، وتصوير الكبد باستخدام المجهر المشرق ، وقياس منطقة الكبد ، وتحليل النتائج. يتيح هذا البروتوكول قياسًا دقيقًا وسريعًا لحجم الكبد. وبما أن هذه الطريقة تنطوي على قياس منطقة الكبد، فقد تقلل من شأن الاختلافات في حجم الكبد، ويلزم منهجيات تكميلية للتمييز بين التغيرات في حجم الخلية والتغيرات في عدد الخلايا. تقنية تشريح وصفها هنا هو أداة ممتازة لتصور الكبد, الأمعاء, والبنكرياس في مواقعها الطبيعية لتطبيقات المصب لا تعد ولا تحصى بما في ذلك تلطيخ الفلورالمناعي والتهجين في الموقع. الاستراتيجية الموصوفة لقياس حجم الكبد اليرقات ينطبق على العديد من جوانب تطوير الكبد والتجدد.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو الخبيثة الأولية الأكثر شيوعا من الكبد1 والسبب الرئيسي الثالث للوفيات المرتبطة بالسرطان2. من أجل فهم أفضل لآليات الخلايا الكبدية وتحديد العلاجات HCC المحتملة، ونحن والآخرين قد وضعت حمار وحشي المعدلة وراثيا التي التعبير عن خلايا الكبد محددة من الأورام مثل α-catenin3،4،كراس (V12)5،6،Myc7،أو Yap18 يؤدي إلى HCC في الحيوانات البالغة. في هذه الحمار الوحشي، ويلاحظ تضخم الكبد في وقت مبكر من 6 أيام بعد الإخصاب (dpf)، وتوفير منصة سهلة لاختبار آثار الأدوية والتعديلات الوراثية على نمو الكبد التي يحركها الأوجين. القياس الدقيق والدقيق لحجم الكبد اليرقات ضروري لتحديد آثار هذه التلاعبات.

يمكن تقييم حجم الكبد وشكله شبه الكمي في يرقات حمار وحشي ثابتة من قبل CY3-SA وضع العلامات9 أو في يرقات حمار وحشي حية باستخدام مراسلين فلورسنت خاصين بالكبد وفلورسينس تشريح المجهر5،6. الطريقة الأخيرة سريعة نسبيا، ويمكن معالجة افتقارها إلى الدقة عن طريق تصوير وقياس مساحة كل كبد باستخدام برنامج معالجة الصور7،10. ومع ذلك ، يمكن أن يكون من الصعب تقنيًا وضع جميع اليرقات الحية بشكل موحد في تجربة بحيث تكون منطقة الكبد ثنائية الأبعاد تمثيلًا دقيقًا لحجم الكبد. تقنية مماثلة لقياس حجم الكبد ينطوي على استخدام المجهر ضوء ورقة مضان لتحديد حجم الكبد اليرقات8، والتي قد تكون أكثر دقة للكشف عن اختلافات الحجم عندما يتم توسيع الكبد غير موحد ة في أبعاد مختلفة. يمكن استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) لحساب عدد خلايا الكبد المسماة بالفلور سنتسنت وأنواع خلايا الكبد الأخرى في الكبد اليرقات8،11. في هذه الطريقة ، يتم تجميع الكبد اليرقات وفصلها ، لذلك يتم فقدان المعلومات حول حجم الكبد الفردي وشكله. في تركيبة مع طريقة أخرى لتحديد حجم الكبد، يتيح FACS التمايز بين زيادة عدد الخلايا (تضخم) وزيادة حجم الخلية (تضخم). كل هذه الأساليب تستخدم تكنولوجيا الفلورسينس مكلفة (المجهر أو فرز الخلايا) ، وباستثناء وضع العلامات CY3-SA ، تتطلب وضع علامات على خلايا الكبد مع مراسل الفلورسنت.

هنا نصف بالتفصيل طريقة لتحديد كمية حمار وحشي منطقة الكبد اليرقة باستخدام المجهر مشرق المجال ومعالجة الصور البرمجيات3،12،13،14. يتيح هذا البروتوكول التحديد الكمي الدقيق لمنطقة الكبد الفردية في الموقع دون استخدام المجهر الفلوري. أثناء تحليل حجم الكبد ، فإننا نعمي هوية الصورة للحد من تحيز المحقق وتحسين الصرامة العلمية15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم إجراء الدراسات الحيوانية بعد الإجراءات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) في جامعة يوتا.

1. إصلاح اليرقات

  1. في 3-7 أيام بعد الإخصاب (dpf), القتل الرحيم اليرقات مع الميثان سولفونات التريكين (0.03%) وجمع ما يصل إلى 15 يرقة في أنبوب 2 مل باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة.
  2. غسل اليرقات مرتين مع 1 مل من البرد (4 درجة مئوية) 1x الفوسفات العازلة المالحة (PBS) على الجليد. لكل غسل، وإزالة أكبر قدر ممكن من السائل من الأنبوب مع ماصة الزجاج ومضخة ماصة، ومن ثم إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة إلى أنبوب.
  3. إزالة أكبر قدر ممكن من PBS باستخدام ماصة الزجاج ومضخة ماصة، وإضافة 1 مل من البرد (4 درجة مئوية) 4٪ paraformaldehyde (PFA) في برنامج تلفزيوني.
    تنبيه: PFA هو مادة مسرطنة مهيجة ومشتبه بها. وينبغي ارتداء القفازات عند التعامل مع PFA، وينبغي التعامل مع الحلول المركزة في غطاء الدخان الكيميائية.
  4. احتضان في 4 درجة مئوية على الأقل بين عشية وضحاها (ولكن تصل إلى عدة أشهر) مع هزاز لطيف.

2. تشريح الأنسجة المحيطة الكبد

  1. إزالة اليرقات من PFA عن طريق الشطف 3x مع 1 مل من البرد (4 درجة مئوية) PBS وهزاز لمدة 5 دقيقة بين الشطف.
    ملاحظة: لا بأس من الحفاظ على اليرقات المشطفة في PBS لمدة يوم أو يومين عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  2. ماصة العديد من اليرقات في برنامج تلفزيوني في بئر واحد من 9 جيدا طبق زجاجي جولة القاع.
  3. إزالة الجلد المحيط ة الكبد.
    1. استخدام ملقط غرامة لعقد اليرقة على ظهرها (البطن حتى), تجتاح على جانبي الرأس بلطف ممكن. ثم استخدم ملقط ناعم جدا في يدك الأخرى للاستيلاء على الجلد فقط فوق القلب.
    2. سحب الجلد إلى أسفل قطريا نحو ذيل السمك ة وقاع الطبق على الجانب الأيسر أو الأيمن من الأسماك. كرر للجانب الآخر (الجانب الأيمن أو الأيسر).
    3. الاستمرار في الاستيلاء على اللوحات من الجلد وسحب أسفل / الظهر حتى تمت إزالة كل من الجلد وmelanophores فوق أو بالقرب من الكبد.
  4. إزالة صفار، إذا كان موجودا.
    1. بالنسبة ليرقات DPF 5-6 ، ارفع صفار الصفار في قطعة واحدة عن طريق الاحتفاظ بالسمك مع ملقط ناعم على ظهره واستخدام الملقط الدقيقة جدًا لحث الصفار بلطف.
    2. بالنسبة ليرقات 3-4 dpf ، كشط صفار الصفار إلى قطع. عقد الأسماك مع ملقط غرامة على ظهرها واستخدام ملقط غرامة جدا لالسكتة الدماغية صفار، بدءا من الجانب البطني.
  5. ضع اليرقات المنشرة في PBS الباردة الطازجة باستخدام ماصة زجاجية ومضخة ماصة.

3- التصوير

  1. لجبل اليرقات، صب بضعة مل من 3٪ السليلوز الميثيل على غطاء طبق بيتري البلاستيك نظيفة.
  2. استخدام ماصة الزجاج ومضخة ماصة لإضافة اليرقات إلى السليلوز الميثيل، إضافة أقل PBS مع اليرقات قدر الإمكان.
  3. تحت المجهر تشريح في التكبير منخفضة، واستخدام ملقط غرامة لتوجيه الأسماك بحيث يتم وضع على الجانب الأيمن، التي تواجه اليسار.
    ملاحظة: تأكد من أن الأسماك موجهة بشكل مثالي على جانبها أو قياسات الكبد قد لا تكون دقيقة.
  4. التقاط صورة لكل سمكة.
    1. تأكد من أن الأسماك التي سيتم تصويرها تتماشى تماما، مع عين واحدة مباشرة على رأس العين الأخرى. إذا لزم الأمر، استخدم ملقط غرامة للاستفادة بخفة على رأس أو ذيل الأسماك لضبط الاتجاه. إذا كان ذيل السمك ة منحنية، قم بإزالة الذيل عن طريق قرصه بقوة باستخدام ملقط لإزالته حتى تضع الأسماك مسطحة.
    2. تكبير إلى التكبير عالية والتركيز على الكبد، والتأكد من أن الخطوط العريضة للكبد واضحة للعيان.
    3. قم بمحاذاة صورة وحفظ الملف.
    4. كرر لجميع الأسماك، والتأكد من التكبير هو نفسه لكل صورة.
    5. التقاط صورة للميكرومتر باستخدام نفس التكبير (انظر الشكل 2H).

4. تحليل الصور

  1. قياس مساحة كبد كل سمكة باستخدام برامج معالجة الصور.
    1. أعمى جميع صور الكبد لتجنب التحيز المحقق المحتملة وتعزيز الصرامة العلمية15. يمكن القيام بهذه الخطوة يدويًا من قبل عضو مختبر آخر أو باستخدام برنامج كمبيوتر(مواد تكميلية). إعادة تسمية الملفات بشكل عشوائي وإنشاء "ملف عشوائي" يحتوي على قائمة بأسماء الملفات الأصلية وأسماء الملفات العمياء المقابلة.
    2. افتح الملفات العشوائية بالترتيب، بدءًا من الملف 1.
    3. اختيار أداة التحديدات الحرة والخطوط العريضة لكل الكبد.
    4. اضغط على Ctrl-M لقياس مساحة كل كبد.
    5. بالنسبة لأي كبد لا يمكن قياسه بدقة، أدخل قياس عنصر نائب (صغير جدًا أو كبير جدًا، بحيث يمكن استبعاده بسهولة لاحقًا).
    6. حفظ القياسات في ملف نصي ("ملف القياسات").
  2. عدم تعمية وتحليل البيانات
    1. فتح "ملف القياسات" و "ملف العشوائية" في برنامج جدول بيانات.
    2. إدراج عمود جديد في "ملف القياسات" وإضافة أسماء الملفات الأصلية للملفات المعمعفة، وذلك باستخدام "ملف العشوائية". حفظ هذا الملف كـ "ملف قياسات غير معبّمة".
    3. فرز البيانات حسب اسم الملف الأصلي.
    4. تأكد من استبعاد أي قياسات الكبد التي كانت الصور غير كافية (انظر الشكل 2A-G).
    5. إذا لزم الأمر، قم بتحويل قيم القياس إلى مقياس مطلوب (مم2، على سبيل المثال).
      1. افتح شريط المقياس في برنامج معالجة الصور.
      2. استخدم أداة الخط المستقيم لقياس 1 مم على شريط المقياس. سيتم قياس برنامج معالجة الصور في نفس وحدات الكبد (بكسل)، مما يعطي عامل التحويل.
      3. استخدم عامل التحويل لتحويل القياسات في "ملف القياسات غير المعبّمة".
    6. باستخدام برنامج جدول البيانات أو لصق البيانات في برنامج رسم بياني علمي وإحصاءات، حدد الانحراف المتوسط والمعياري واحسب قيمة (قيم) p.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حمار وحشي معدل وراثيا التعبير عن hepatocyte محددة تنشيط α-catenin(Tg (fabp10a: pt-α-cat) حمار وحشي)3 والأشقاء التحكم غير المعدلة وراثيا تم القتل الرحيم في 6 dpf ومنطقة الكبد تم قياسها كميا باستخدام المجهر الساطع ومعالجة الصور البرمجيات. وقد زادت أسماك الحمار الوحشي المعدلة وراثيا بشكل كبير حجم الكبد (0.0006 سم2)بالمقارنة مع أشقائهم غير المعدلة وراثيا (0.0004 سم2, p < 0.0001; الشكل 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القياس الكمي لحجم الكبد أمر بالغ الأهمية في الدراسات التي تهدف إلى فهم نمو الكبد، والتجدد، والأورام. البروتوكول الموصوف هنا هو تقنية سريعة نسبيا وسهلة ورخيصة لحجم الكبد في كمية حمار وحشي اليرقات. يمكن أن تساعد ممارسة الحذر المناسب أثناء تنفيذ جوانب معينة من البروتوكول في زيادة دقة النتائج وتقليل الإحباط.

التثبيت السليم لليرقات أمر بالغ الأهمية للحصول على عينات بيولوجية محفوظة بشكل جيد ومنع تفككها. يمكن أن يحدث تخفيف محلول PFA بنسبة 4٪ عندما لا تتم إزالة PBS تمامًا قبل إضافة PFA إلى اليرقات الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعترف تورين هوبز والموارد الحيوانية حمار وحشي مركزي (CZAR) في جامعة يوتا لتوفير تربية حمار وحشي، والفضاء المختبري، والمعدات اللازمة لتنفيذ أجزاء من هذا البحث. ويدعم التوسع في CZAR جزئيا من قبل منحة المعاهد القومية للصحة # 1G20OD018369-01. ونود أيضا أن نشكر رودني ستيوارت، كلوي ليم، لانس غراهام، كودي جيمس، غاريت نكوم، ومعهد هانتسمان للسرطان (HCI) مرفق حمار وحشي لرعاية حمار وحشي. نود أن نشكر كينيث كومباس للمساعدة في البرمجة R. تم تمويل هذا العمل جزئيا ً من خلال منح من مؤسسة هانتسمان للسرطان (بالتزامن مع المنحة P30 CA042014 الممنوحة لمعهد هانتسمان للسرطان) (KJE) وNIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
كاميرا لتشريح المجهرلايكا ، على سبيل المثال
تشريح المجهرلايكا ، على سبيل المثال
ملقط فاين (دومون # 5)أدوات العلوم الدقيقة11254-20
ماصات زجاجيةVWR14672-608
برنامج تحليل الصورصورة J / FIJIيمكن تحميل ImageJ / FIJI مجانا: https://imagej.net/Welcome< / a>
ميثيل السليلوزSigmaM0387
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتموردين مختلفين
مضخة ماصةVWR53502-233
أطباق بتري البلاستيكيةالولايات المتحدة الأمريكية Scientific Inc2906
Pyrex 9 آبار طبق زجاجي دائريالقاع VWR89090-482
يمكن تنزيل برنامج لملفات التعميةR المشروعR مجانا: https://www.r-project.org/< / a>
برامج الرسوم البيانية والإحصاء العلميةGraphPad Prism
Microsoft Excel
تريكايين ميثان سولفونات (Tricaine-S)Western Chemical200-226
ناعم جدا (Dumont # 55) ملقطأدوات العلومالدقيقة 11255-20
برنامج جدول بيانات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lin, D. -C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).
  2. Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).
  3. Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  4. Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
  5. Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
  6. Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
  7. Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
  8. Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
  9. Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).
  10. Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).
  11. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
  15. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  16. Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).
  17. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
  18. Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).
  19. Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).
  20. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Liver Size QuantificationBrightfield MicroscopyZebrafish LarvaeTissue DissectionImage AnalysisPFA FixationMethylcellulose MountingFreehand SelectionScale Bar CalibrationHepatocellular Carcinoma

Related Articles