طويلة المدى Channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر من الخلايا العصبية الدنيا Colliculus مع الأزرق والأحمر تحول Channelrhodopsins

اتصالات متشابك ة حاسمة لوظيفة الدائرة العصبية، ولكن طوبولوجيا دقيقة وعلم وظائف الأعضاء من نقاط الاشتباك العصبي داخل الدوائر العصبية غالبا ما يكون من الصعب التحقيق تجريبيا. وذلك لأن التحفيز الكهربائي ، الأداة التقليدية للفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية ، ينشط بشكل عشوائي محاور عصبية بالقرب من موقع التحفيز ، وفي معظم مناطق الدماغ ، تتشابك المحاور من مصادر مختلفة (محلية ، تصاعدية ، و / أو تنازلية). ومع ذلك ، باستخدام channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر (CRACM)^1،2، يمكن الآن التغلب على هذا القيد^3. Channelrhodopsin (ChR2) هو ضوء تنشيط, قناة أيون انتقائية الميشن وجدت أصلا في الأخضر الغا Chlamydomonas reinhardtii. يمكن تنشيط ChR2 بواسطة الضوء الأزرق من الطول الموجي حول 450-490 نانومتر، وإزالة الاستقطاب الخلية من خلال تدفق التكيّف. تم وصف ChR2 لأول مرة وأعرب عنها في البويضات Xenopus من قبل ناجيل وزملاؤه⁴. بعد ذلك بوقت قصير، أعرب بويدن وزملاؤه⁵ ChR2 في الخلايا العصبية الثديية وأظهرت أنها يمكن أن تستخدم نبضات الضوء للسيطرة بشكل موثوق على spiking على مقياس زمني ميلي ثانية، مما أدى إلى إمكانات العمل ~ 10 مللي بعد تفعيل ChR2 مع الضوء الأزرق. تم العثور على قنوات البوجينية مع حركية أسرع في الآونة الأخيرة (على سبيل المثال ، Chronos^6).

النهج الأساسي لتجربة CRACM هو نقل مجموعة من الخلايا العصبية presynaptic المفترضة مع فيروس الأدينو المرتبطة بالمؤتلف (rAAV) الذي يحمل المعلومات الوراثية لقناة rhorhodopsin. Transfection من الخلايا العصبية مع rAAV يؤدي إلى التعبير عن channelrhodopsin المشفرة. عادة، يتم وضع علامة channelrhodopsin مع بروتين الفلورسنت مثل GFP (البروتين الفلورسنت الأخضر) أو tdTomato (بروتين الفلورسنت الأحمر)، بحيث يمكن بسهولة أن يتم تأكيد transfection من الخلايا العصبية في المنطقة المستهدفة مع التصوير الفلوري. لأن rAAVs غير المسببة للأمراض، لديها إمكانات التهابية منخفضة وطويلة الأمد التعبير الجيني^7،8، أصبحت تقنية قياسية لتسليم channelrhodopsins إلى الخلايا العصبية. إذا، بعد نقل السكان presynaptic المفترضة من الخلايا العصبية، وتفعيل channelrhodopsin من خلال ومضات الضوء يثير الإمكانات أو التيارات postynaptic في الخلايا العصبية المستهدفة، وهذا هو دليل على اتصال محور عصبي من النواة المنقولة إلى الخلية المسجلة. لأن محاور عصبية مقطوعة في تجارب شريحة الدماغ يمكن أن تكون مدفوعة لإطلاق الناقل العصبي من خلال تنشيط channelrhodopsin, يمكن التعرف على النوى التي تقع خارج شريحة حادة ولكن إرسال محاور عصبية في منطقة الدماغ postynaptic مع CRACM. قوة هذه التقنية هو أن الاتصال وعلم وظائف الأعضاء من المدخلات متشابك المدى الطويل المحدد يمكن التحقيق مباشرة.

بالإضافة إلى channelrhodopsins التي هي منفعل من الضوء الأزرق، وقد حددت المحققين مؤخرا العديد من channelrhodopsins الأحمر تحول^9،10، بما في ذلك Chrimson وأسرع ChrimsonR التناظرية، وكلاهما متحمس مع الضوء الأحمر من ~ 660 نانومتر⁶. الأوبسينات الحمراء المتحولة هي ذات فائدة لأن الضوء الأحمر يخترق الأنسجة أفضل من الضوء الأزرق ، والضوء الأحمر قد يكون له سمية سيتانية أقل من الضوء الأزرق^10،11،12. قناة حمراء تحول أيضا فتح إمكانية تجارب CRACM اللون المزدوج، حيث يمكن اختبار التقارب بين محاور عصبية من نوى مختلفة على نفس الخلايا العصبية في تجربة واحدة^6،13،14. ومع ذلك ، فإن opsins الحالية ذات التحول الأحمر غالبًا ما تعرض تنشيطًا متقاطعًا غير مرغوب فيه مع الضوء الأزرق^15،16،17، مما يجعل تجربتين لونيتين صعبتين. وبالإضافة إلى ذلك، أشارت بعض التقارير إلى أن ChrimsonR يخضع للاتجار المحوري محدودة، والتي يمكن أن تجعل من الصعب استخدام ChrimsonR لتجارب CRACM^16،17.

تقريبا جميع التوقعات التصاعدية من نواة جذع الدماغ السمعي السفلي تتلاقى في الكوليكولوس السفلي (IC)، محور منتصف الدماغ للمسار السمعي المركزي. وهذا يشمل الإسقاطات من نواة القوقعة (CN)^18،19، معظم مجمع القلة العليا (SOC)²⁰، والظهرية (DNLL) والبطنية (VNLL) نواة lemniscus الجانبية^21. بالإضافة إلى ذلك، إسقاط تنازلي كبير من القشرة السمعية ينتهي في IC^{18،19،21،22،}والخلايا العصبية IC أنفسهم متشابكة على نطاق واسع داخل الفصوص المحلية ومضادة للIC^23. وقد جعل اختلاط المحاور من مصادر عديدة من الصعب التحقيق الدوائر IC باستخدام التحفيز الكهربائي²⁴. ونتيجة لذلك، على الرغم من الخلايا العصبية في IC أداء حسابات هامة لتوطين الصوت وتحديد الكلام والاتصالات الأخرى الأصوات^25،26، وتنظيم الدوائر العصبية في IC غير معروف إلى حد كبير. لقد حددنا مؤخرًا الخلايا العصبية VIP كأول فئة عصبية يمكن تحديدها جزيئيًا في IC²⁷. الخلايا العصبية VIP هي الخلايا العصبية ستيلاتي الجلوتامات التي مشروع إلى العديد من الأهداف بعيدة المدى, بما في ذلك المهاد السمعيو وcolliculus متفوقة. ونحن الآن قادرون على تحديد مصادر ووظيفة المدخلات المحلية وطويلة المدى للخلايا العصبية VIP وتحديد كيفية هذه الاتصالات الدائرة تسهم في معالجة الصوت.

البروتوكول المعروض هنا مصمم للتحقيق في المدخلات متشابك للخلايا العصبية VIP في IC من الفئران، وتحديدا من IC المعضدة وDCN(الشكل 1). يمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع مصادر مختلفة من المدخلات، نوع الخلايا العصبية المختلفة أو منطقة الدماغ مختلفة تماما. نظهر أيضا أن ChrimsonR هو قناة فعالة حمراء تحول rhodopsin لرسم خرائط الدوائر طويلة المدى في جذع الدماغ السمعي. ومع ذلك، نحن نثبت أن يتم تنشيط ChrimsonR بقوة من الضوء الأزرق، حتى في كثافة منخفضة، وبالتالي، للجمع بين ChrimsonR مع كرونوس في تجارب CRACM لونين، يجب استخدام ضوابط دقيقة لمنع التنشيط المتبادل من ChrimsonR.

الحصول على موافقة لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية المحلية واستخدامها والالتزام بإرشادات المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تمت الموافقة على جميع الإجراءات في هذا البروتوكول من قبل جامعة ميشيغان IACUC وكانت وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد القومية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. الاستعدادات لعملية جراحية

1. إجراء العمليات الجراحية في ظروف معقمة. الأوتوكلاف/ تعقيم جميع أدوات ومواد الجراحة قبل الجراحة. ارتداء ثوب الجراحة وقناع للجراحة.
2. قم بتعقيم منطقة الجراحة (رش ومسح أسفل مع الإيثانول 70٪)، ووضع الستائر منشفة معقمة لتغطية منطقة الجراحة.
3. إعداد قفص الانتعاش. إزالة الفراش قفص للحد من خطر الاختناق. ضع وسادة تدفئة تحت القفص توفير مصدر للغذاء والماء.
4. سحب الشعيرات الدموية الزجاجية لحقن النانو على سحب ماصة. الحرارة الشديدة لخيوط التدفئة أثناء عملية السحب سوف تعقم الشعيرات الدموية الزجاجية. قطع أو كسر تلميح للحصول على فتحة ما يقرب من 5 ميكرون في القطر.
5. شطب ة الطرف الشعري إلى زاوية 30 درجة تقريبا لتحسين تغلغل الأنسجة والحد من انسداد. ردم الشعيرات الدموية مع الزيوت المعدنية وإدراجها في حاقن نانولتر.
6. الحصول على aliquot من channelrhodopsin المطلوب ترميز rAAV وتمييع إلى titer المطلوب باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
   ملاحظة: لقد وجدنا أن النمط المصلي 1 rAAVs تعمل بشكل جيد لtransfection من نواة جذع الدماغ السمعية. على وجه التحديد، rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH (الأزرق الضوء تنشيط channelrhodopsin) وrAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH (أحمر تحول channelrhodopsin)، والتي تتوفر من مستودعات متاحة للجمهور والنوى ناقلات، تسفر باستمرار مستويات التعبير العالية وجيدة على المدى الطويل الاتجار المحوري channelrhodopsins اللازمة للتجارب CRACM.
7. اتبع تعليمات حاقن لملء الشعيرات الدموية الأمامية مع 1-3 ميكرولتر من rAAV في PBS المعقم.

2- الجراحة

1. وضع الحيوان في غرفة التعريفي والحث على التخدير مع 3٪ isoflurane في الأكسجين تسليمها عن طريق مبخر isoflurane معايرة. مراقبة الماوس حتى يصبح التنفس عميقة وبطيئة وقرصة إصبع القدم منعكس غائبة، حوالي 3-5 دقيقة.
2. نقل الحيوان إلى إطار stereotaxic. تأمين رأس الحيوان عن طريق وضع فمه على شريط الحنك مع قناع تخدير الغاز ووضع قضبان الأذن غير المبوّجة في كل من قنوات الأذن.
3. إدراج مسبار درجة حرارة المستقيم والتبديل على وحدة تحكم درجة الحرارة المثلية.
4. تطبيق مرهم العيون لمنع العيون من الجفاف.
5. إدارة مسكن وقائي (على سبيل المثال، حقن تحت الجلد من 5 ملغ / كغ carprofen).
6. ضبط isoflurane إلى 1-2.5٪، وفقا لعمق الدولة الهريسة. مراقبة درجة الحرارة والتنفس ولون الأغشية المخاطية على الأقل كل 15 دقيقة أثناء العملية.
7. فروة الرأس الحلاق مع المقصات الكهربائية. يعد فروة الرأس ببالتناوب مع ثلاث مسحات من اليود البوفيدون و الإيثانول بنسبة 70٪.
8. إجراء شق في فروة الرأس على طول خط الوسط بدءا من بين الأذنين والوردي المستمر إلى العينين، وتعريض اللامدا وخيوط البريجة. دفع الجلد إلى الجانب وإزالة periosteum من العظام المكشوفة إذا لزم الأمر.
9. وضع علامة على خياطة لامدا مع علامة جراحية معقمة، ووضع غيض من حاقن نانو بحيث يتم لمس فقط لامدا، وصفر إحداثيات micromanipulator. استخدام تلميح نانوحافيووور وmicromanipulator لقياس الفرق في الارتفاع بين الغرز اللامدا وbregma. ضبط ارتفاع شريط الحنك لتحقيق لامبدا وbregma إلى داخل ± 100 ميكرومتر الفرق الارتفاع.
10. قم بمخطط موقع الحقن باستخدام طرف النانو حاقن ونظام إحداثيات الميكروين وضع علامة على الموقع بعلامة جراحية معقمة. لحقن IC أو DCN من الفئران P21-P30، استخدم إحداثيات نسبة إلى خياطة لامدا، كما هو موضح في الجدول 1. لاحظ أن عمق Z في إحداثياتنا يقاس من سطح الجمجمة في لامدا.
11. استخدام الحفر micromotor مع العقيمة 0.5 مم حفر لإجراء عملية فجريق فوق موقع الحقن.
12. لضمان نقل واسع من الخلايا العصبية في النواة المستهدفة، وجعل الحقن في أعماق مختلفة في الأنسجة(الجدول 1،Z إحداثيات)، و، في حالة مناطق الدماغ أكبر مثل IC، وجعل الحقن على مدى اثنين أو أكثر من الاختراقات في إحداثيات X و Y مختلفة(الجدول 1،الحق IC الاختراق 1 والحق IC الاختراق 2).
13. إجراء الحقن. بالنسبة لحقن IC، إيداع 20 مليون لتر من الفيروس على فترات 250 ميكرومتر على طول محور Z (عمق الحقن) بين 2,250 ميكرومتر وعمق 1750 ميكرومتر. بالنسبة لحقن DCN، إيداع 20 مليون لتر من الفيروس على عمق 4750 ميكرومتر و 4550 ميكرومتر، على التوالي.
14. بعد الحقن في كل تنسيق Z، انتظر 2-3 دقائق قبل نقل حاقن إلى تنسيق Z التالي. وهذا سيتيح الوقت للفيروس لنشر بعيدا عن موقع الحقن، والحد من احتمال أن الفيروس سيتم امتص حتى حقن المسالك عندما يتم إعادة وضع حاقن نانو.
15. بعد الحقن الأخير في الاختراق، انتظر 3-5 دقائق قبل سحب حاقن النانو من الدماغ.
16. عندما تتم إزالة حاقن النانو من الدماغ بين الاختراقات وبين الحيوانات، إخراج حجم صغير من الفيروس من تلميح للتأكد من أن تلميح لم انسداد.
17. بعد الحقن، استخدم PBS المعقم لمبلل حواف فروة الرأس ثم حرك الجلد برفق مرة أخرى نحو خط الوسط. أغلق الجرح بغرز بسيطة مقطوعة باستخدام 6-0 (0.7 متري) خيوط النايلون.
18. تطبيق 0.5-1 مل من 2٪ هلام الليدوكائين على الجرح.
19. إزالة قضبان الأذن ومسبار درجة الحرارة، إيقاف isoflurane، وإزالة الماوس من شريط الحنك ونقله إلى قفص الانتعاش.
20. مراقبة الاسترداد عن كثب. بمجرد أن يكون الحيوان مستيقظًا تمامًا ، يتحرك ، ولا تظهر عليه أي علامات على الألم أو الضيق ، قم بنقله مرة أخرى إلى قفصه وإعادة القفص إلى vivarium.
21. إذا كان سيتم إجراء العمليات الجراحية على الحيوانات متعددة في يوم واحد، واستخدام معقم عنبر ة ساخنة لتعقيم أدوات الجراحة وحفر بور قبل الجراحة القادمة.

3. المتابعة الجراحية

1. تحقق من الحيوانات يوميًا بحثًا عن إغلاق الجروح أو العدوى أو علامات الألم أو الضيق على مدى الأيام العشرة القادمة ، مع الالتزام بإرشادات رعاية الحيوانات الخاصة بالمؤسسة.
2. انتظر 3-4 أسابيع قبل استخدام الحيوانات في التجارب للسماح بالتعبير الأمثل عن channelrhodopsins.

4. إعداد شريحة الدماغ وتأكيد هدف الحقن

1. بالنسبة لـ CRACM ، استخدم شرائح الدماغ المعدة بشكل حاد من الحيوانات المنقولة في تجارب الفيزيولوجيا الكهربية القياسية ، الموصوفة هنا لفترة وجيزة فقط (انظر Goyer et al. 2019 للحصول على وصف أكثر تفصيلاً^27).
2. إعداد السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) التي تحتوي على (في mM): 125 NaCl، 12.5 D-الجلوكوز، 25 NaHCO_3،3 KCl، 1.25 NaH₂PO_4،1.5 CaCl_2،1 MgSO₄. فقاعة ACSF إلى درجة الحموضة من 7.4 مع 5٪ CO₂ في 95٪ O₂.
3. تنفيذ جميع الخطوات التالية، بما في ذلك في الفيزيولوجيا الكهربائية في المختبر، في الظلام القريب أو الضوء الأحمر للحد من تنشيط channelrhodopsins.
4. عميق يهوّر فأرة مع isoflurane وقطع رأسه بسرعة. تشريح الدماغ بسرعة في ~ 34 درجة مئوية ACSF.
5. قطع شرائح الإكليل (200-250 ميكرومتر) التي تحتوي على IC في ~ 34 درجة مئوية ACSF مع microtome تهتز واحتضان شرائح في 34 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غرفة عقد مليئة ACSF فقاعة مع 5٪ CO₂ في 95٪ O₂. بعد الاحتضان، قم بتخزين الشرائح في درجة حرارة الغرفة حتى يتم استخدامها للتسجيلات.
6. إذا لم يكن هدف الحقن هو IC ، قم بقص شرائح إكليلية إضافية من منطقة الدماغ المحقونة وتحقق من تحويل النواة المستهدفة تحت مجهر فلوري. إذا لم يكن هناك تحويل في النواة المستهدفة أو تحويل إضافية في مناطق مختلفة من الدماغ، لا تستمر مع التجربة.

5. في تسجيل المختبر وتجربة CRACM

ملاحظة: لتوفير التحفيز البصري من كرونوس وChrimsonR، ونحن نستخدم المصابيح إلى جانب منفذ epifluorescence من المجهر. ومع ذلك، يمكن استخدام الليزر بدلاً من المصابيح. إذا كنت تستخدم الليزر، فاحصل على موافقة مسبقة من مسؤولي السلامة المؤسسية واتبع الإرشادات المناسبة للاستخدام الآمن للليزر.

1. سحب الأقطاب الكهربائية من الزجاج borosilicate إلى مقاومة من 3.5-4.5 MΟ. يجب أن يحتوي المحلول الداخلي للقطب الكهربائي (في mM): 115 K-gluconate, 7.73 KCl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 10 Na₂ phosphocreate, 4 MgATP, 0.3 NaGTP, تكملها 0.1% بيوسيتين (ث/v), درجة الحموضة المعدلة إلى 7.3 مع كوه وosmolality إلى 290 mOsm/kg مع السكروز.
2. لإجراء التسجيلات، استخدم طرق المشبك التصحيح القياسية. ضع الشريحة في غرفة تسجيل تحت مجهر ثابت منتصب في مرحلة ثابتة ودائماً ما تُسجّل مع ACSF عند حوالي 2 مل/دقيقة. إجراء التسجيلات بالقرب من درجة الحرارة الفسيولوجية (~ 34-36 درجة مئوية).
3. تصحيح الخلايا العصبية تحت السيطرة البصرية باستخدام مكبر الصوت المشبك التصحيح مناسبة. صحيح لمقاومة سلسلة، ومكثفات ماصة والسائل ة تقاطع المحتملة.
4. خلال تسجيلات الخلية بأكملها، قم بتنشيط Chronos عن طريق توصيل نبضات قصيرة (1-5 مللي ثانية) من ضوء 470 نانومتر أو ChrimsonR بواسطة نبضات قصيرة من ضوء 580 نانومتر من خلال مصابيح المصابيح المتاحة تجاريًا. تحديد عتبة تنشيط opsin واستخدام بروتوكول التحفيز الحد الأدنى للحصول على إمكانات postynaptic. بشكل عام، استخدم أقصر مدة تحفيز التي تثير PSP، وتعيين الطاقة البصرية إلى 120٪ من طاقة العتبة المطلوبة لاستخلاص PSPs.
5. للتأكد من أن التغييرات المسجلة في الأغشية المحتملة هي في الواقع مدخلات متشابكة إلى الخلايا العصبية ، يمكن غسل الخصوم القياسية لمستقبلات postynaptic المثيرة / المثبطة أثناء التجربة. للتحقيق في مساهمات مستقبلات مختلفة لPSP (على سبيل المثال NMDA مقابل مستقبلات AMPA) ، يمكن غسل مضادات مستقبلات مناسبة. لكل خصم مستقبلات, يجب عكس آثار المخدرات بعد الانغسل.
6. استخدام الكمون، والتوتر، والموثوقية من PSPs للتأكد من أن المدخلات متشابك تنشيط الضوء تنشأ من التنشيط المباشر، البصرية من نقاط الاشتباك العصبي على الخلايا العصبية المسجلة، بدلا من تفعيل channelrhodopsin التعبير عن نقاط الاشتباك العصبي على التدخل الخلايا العصبية التي تتشابك على الخلايا العصبية المسجلة. بشكل عام، زمن وصول منخفض (<2 مللي ثانية)، وحالة منخفضة من التوتر (<1 ثانية الانحراف المعياري في الكمون)، وموثوقية عالية (>50%) تشير إلى اتصال متشابك مباشر من channelrhodopsin التعبير عن الخلايا العصبية presynaptic إلى الخلايا العصبية المسجلة.

عبرنا فئران VIP-IRES-Cre(Viptm1 (cre)Zjh/J) وAi14 Cre-reporter الفئران (B6). Cg-Gt (ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) لتوليد نسل F1 الذي تعبر فيه الخلايا العصبية VIP عن tdTomato البروتين الفلوري. تم استخدام نسل F1 من أي من الجنسين، الذين تتراوح أعمارهم بين يوم ما بعد الولادة (P) 21 إلى P70. وقد استخدم ما مجموعه 22 من الحيوانات في هذه الدراسة.

حقن Stereotaxic من AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH في IC الأيمن من كبار الشخصيات-IRES-Cre x الفئران Ai14 باستخدام إحداثيات هو مبين في الجدول 1 أدى إلى التعبير Chronos-EGFP قوية في IC الحق(الشكل 2A). وأشار الفحص البصري لفلورة كرونوس-إيغفب إلى أن معظم السوماتا المسمى في IC الأيمن كانت موجودة في النواة المركزية للIC (ICc)، ولكن المسمى سوماتا كانت موجودة في بعض الأحيان أيضًا في القشرة الظهرية للIC (ICd) وفي بعض الأحيان في القشرة الجانبية للIC (IClc). وينبغي التحقق من استهداف ومدى الترانزفيس لكل الحيوانات المستخدمة في التجربة، كما التعبير عن channelrhodopsins في المناطق غير المستهدفة يمكن أن يؤدي إلى إيجابيات كاذبة. لتحقيق تعبير أوسع أو أكثر تقييدا من كرونوس، يمكن تعديل كمية الفيروس المودعة، فضلا عن إحداثيات stereotaxic بسهولة لتحقيق النتيجة المرجوة.

حقن Stereotaxic من AAV1. Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH في DCN (انظر الإحداثيات في الجدول 1)من كبار الشخصيات-IRES-Cre x Ai14 الفئران أدى إلى transfection قوية من الخلايا العصبية DCN(الشكل 2B). لتأكيد الترانزات الانتقائي لـ DCN ، يجب تقطيع جذع الدماغ لكل الحيوان إلى شرائح للتحقق من أن تعبير EGFP كان موجودًا ويقتصر على DCN. إذا لم يكن هناك الترانزس أو إذا كان هناك تعبير كبير عن EGFP في العصب السمعي أو VCN ، فلا ينبغي إجراء التسجيلات. باستخدام الإحداثيات الموضحة في الجدول 1 مع إجمالي حجم الحقن من 40 nL، سيقتصر تعبير Chronos-EGFP على DCN في معظم الحالات. كانت المحاور المسماة EGFP موجودة في اليسار (contralateral) ICc 3 أسابيع بعد الحقن لكل من مواقع الحقن IC و DCN(الشكل 2A اليمين ، 2B اليمين).

لاختبار الاتجار بعيد المدى من ChrimsonR، AAV1. تم حقن Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH في DCN الأيمن من VIP-IRES-Cre x Ai14 الفئران، وذلك باستخدام نفس الإحداثيات كما هو الحال مع حقن كرونوس. أدى حقن ChrimsonR إلى تعبير قوي في DCN ، مع ظهور تُرِمْلTTTomato في الخلايا والألياف(الشكل 3A). في ICc المواجهة ، كانت الألياف المسماة بقوة مع tdTomato مرئية بوضوح بعد 3 أسابيع ، مما يدل على قدرة الاتجار طويلة المدى من بناء ChrimsonR-tdTomato عند حقنها في نواة جذع الدماغ السمعية(الشكل 3B). أثار التنشيط البصري لـ ChrimsonR EPSPs في الخلايا العصبية VIP IC(الشكل 3C)، مما يشير إلى أن ChrimsonR هو أداة مفيدة لتجارب CRACM طويلة المدى عندما تتطلب المعلمات التجريبية استخدام الضوء الأحمر بدلاً من الضوء الأزرق. ومع ذلك ، وجدنا أن ChrimsonR تم تنشيطه بسهولة مع الضوء الأزرق ، مما يظهر نفس العتبة لتنشيط الضوء الأزرق مثل كرونوس(الشكل 4). حساسية ChrimsonR إلى الضوء الأزرق يعني أنه يجب توخي الحذر بشكل خاص للتمييز بين المدخلات المنقولة مع ChrimsonR أو كرونوس في نفس الحيوان13.

عند استهداف التسجيلات إلى الخلايا العصبية VIP في الخلايا العصبية المعارضة (اليسار) ICc بعد الحقن في IC الأيمن، أثارت ومضات الضوء الأزرق إمكانات المشاركات المثيرة (EPSPs) أو إمكانات postynaptic المثبطة (IPSPs). وهذا يؤكد التوقعات المندوبية للخلايا العصبية VIP. لتحليل EPSPs المندوبية وIPSPs بشكل منفصل، استخدمنا خصوم المستقبلات لمنع IPSPs أثناء تسجيلات EPSP، والعكس بالعكس. وترد في الشكل 5برامج تمثيل EPSPs وIPSPs المسجلة أثناء تجارب CRACM . ولوحظ IPSPs في 6 من أصل 12 الخلايا العصبية ICc VIP اختبارها. وكانت هذه الملوثات صغيرة (1.53 مفولت ± 0.96 مليف) وكان لها حركية معتدلة. وكانت أوقات الارتفاع 10 - 90٪ من IPSPs 7.8 مللي ثانية ± 2.1 مللي ثانية ، وكانت نصف العرض 15.1 مللي ثانية ± 6.8 مللي ثانية ، وكانت ثوابت وقت الاضمحلال 32.4 مللي ثانية ± 17.0 مللي ثانية(الشكل 5A، يسار). وقد توسط IPSPs من قبل مستقبلات GABAA, كما تم حظرها من قبل 5 ميكرومتر gabazine, وهو خصم مستقبلات GABAA (الشكل 5A,حق; ن = 6). لوحظ تُجرى في 11 من أصل 27 خلايا عصبية VIP ICc تم اختبارها. وكانت هذه الـ EPSPs صغيرة أيضاً (1.52 مفولت ± 1.08 مفولت) وكان لها حركية معتدلة. وكانت أوقات الارتفاع 10 - 90٪ من EPSPs 8.3 مللي ثانية ± 4.3 مللي ثانية، وكانت نصف العرض 19.6 مللي ثانية ± 7.6 مللي ثانية، وكانت ثوابت وقت الاضمحلال 43.5 مللي ثانية ± 16.8 مللي ثانية(الشكل 5B "التحكم"). تم التوسط EPSPs من قبل مستقبلات AMPA وNMDA. تطبيق 50 ميكرومتر D-AP5، وهو خصم مستقبلات NMDA، خفض عرض نصف العرض EPSP (14.3 مللي ثانية ± 4.7 مللي ثانية، p = 0.006) واتجه نحو تقليل وقت الارتفاع (6.3 مللي ثانية ± 1.6 مللي ثانية، p = 0.09)، ثابت وقت الاضمحلال (30.6 مللي ثانية ± 7.3 مللي ثانية، p = 0.06)، وسعة EPSP (1.38 ± 0.33 متر فولت، p = 0.105؛ ANOVA للقياسات المتكررة مع اختبار Tukey بعد مخصص). تطبيق 10 μM NBQX، وهو خصم مستقبلات AMPA، منعت ما تبقى من EPSP(الشكل 5B "+ AP5 و NBQX").

تسجيلات الخلايا العصبية VIP في ICc اليسار بعد حقن DCN كشفت EPSPs التي أثارتها ومضات الضوء الأزرق، مما يؤكد المدخلات متشابك من DCN إلى الخلايا العصبية VIP في IC. أجريت تجارب DCN CRACM مع حاصرات GABAergic وglycinergic في الحمام لمنع IPSPs التلقائية. وجدنا أن نبضات 2-5 مللي ثانية من الضوء الأزرق أثارت EPSPs في 19 من 25 خلية عصبية تم اختبارها. وكان EPSPs التي أثارها الضوء السعة المعتدلة (2.85 mV ± 2.98 mV) وأوقات الارتفاع بطيئة نسبيا (4.2 مللي ثانية ± 1.3 مللي ثانية)، نصف العرض (20.6 مللي ثانية ± 14.4 مللي ثانية) والثوابت الزمنية الاضمحلال (22.0 مللي فولت ± 6.7 مللي ثانية) (n = 6 خلايا، البيانات غير مبين).

تم إثارة جميع PSPs التي أثارها Chronos أو ChrimsonR التنشيط بطريقة كل شيء أو لا شيء ولم تحجيم اتساعها مع زيادة الطاقة البصرية (البيانات غير مبين). ومع ذلك، هذه النتيجة تعتمد على عدد وفسيولوجيا نقاط الاشتباك العصبي عبر العدوى توفير المدخلات إلى خلية عصبية معينة، وبالتالي من المرجح أن تختلف اعتمادا على مزيج معين من الإسقاط المحوري ونوع الخلايا العصبية التي يجري التحقيق فيها.

الشكل 1: مواقع حقن rAAV والإعداد التجريبي. (أ)موقع الحقن والإعداد التجريبي للتحقيق في التوقعات الإدارية. إلى اليسار: يتم حقن بناء rAAV (على سبيل المثال، rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH) في IC الأيمن ويتم تنفيذ التسجيلات المستهدفة في IC المنضدية. الحق: خلال تسجيلات المشبك التصحيح، الألياف Chronos عبر العدوى متحمسون مع الضوء الأزرق للحصول على إمكانات postynaptic. (B)موقع الحقن والإعداد التجريبي للتحقيق في الإسقاطات طويلة المدى من DCN إلى IC. إلى اليسار: يتم حقن بناء ChrimsonR في DCN الأيمن ويتم تنفيذ التسجيلات المستهدفة في IC المنضدية. الحق: خلال تسجيلات المشبك التصحيح، الألياف المنقولة ChrimsonR المنقولة بحماس مع الضوء الأحمر لتسجيل ChrimsonR أثار إمكانات postynaptic. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التعبير كرونوس-EGFP بعد الحقن في IC وDCN. (أ)اليسار: صورة لشريحة IC الإكليلية تظهر الخلايا العصبية VIP المسمى tdTomato في جميع أنحاء IC (أرجواني) وكرونوس-EGFP التعبير في سوماتا المترجمة إلى مواقع الحقن في IC الأيمن (الأخضر). اليمين: صورة تكبير أعلى تظهر خلية عصبية VIP مسجلة (أبيض وأخضر) في IC موانع لموقع الحقن. البوْن الأخضر هي Chronos-EGFP التي تعبر عن إسقاطات من IC المناوّر. (ب)صورة لشريحة جذع الدماغ التاجية تظهر كرونوس-EGFP التعبير في DCN بعد حقن rAAV-Chronos-EGFP. اليسار: صورة DCN، تظهر الألياف الإيجابية من نوع DCN وEGFP التي تدخل الستريا الصوتية الظهرية. الأوسط: صورة تكبير أعلى تظهر هيئات الخلايا المتحولة Chronos في DCN. اليمين: التعبير كرونوس-EGFP في الألياف والمحطات الطرفية في IC المنضافية من إسقاطات DCN-IC طويلة المدى. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: ChrimsonR-tdTomato التعبير في توقعات DCN و DCN إلى IC. (أ)صورة لشريحة جذع الدماغ التاجيمن فأر تم فيه حقن DCN الأيمن مع rAAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH. إلى اليسار: صورة تعبير ChrimsonR في DCN الأيمن. الحق: صورة التكبير أعلى من DCN الحق تظهر transfection قوية من الخلايا العصبية مع ChrimsonR. (ب)صورة التكبير عالية من محاور DCN المنقولة ChrimsonR في IC. (C)أثار Optogenetically EPSPs المسجلة من الخلايا العصبية VIP في IC contralateral إلى rAAV-ChrimsonR حقن DCN. تظهر الآثار الأصلية باللون الرمادي الفاتح ومتوسط EPSP باللون الأحمر. مربع البرتقال يشير إلى توقيت نبض ضوء 590 نانومتر. أشرطة المقياس = 20 مللي ثانية/0.5 مللي فولت. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: تفعيل ChrimsonR بمستويات منخفضة من الضوء الأزرق. (أ)تفعيل كرونوس في الإسقاطات المندوبية عن طريق نبضات من 470 نانومتر الضوء الأزرق. أعلى: آثار الأصلي (رمادي فاتح) والمتوسط (سماوي) من PSSPs Chronos يحركها، أثار في قوة بصرية أعلى قليلا من عتبة لتنشيط كرونوس (أشرطة مقياس تظهر 20 مللي ثانية/0.5 mV). أسفل: العلاقة بين الطاقة البصرية في 470 نانومتر واحتمال مراقبة PSP كرونوس أثار. (ب)تفعيل ChrimsonR مع 470 نانومتر الضوء الأزرق. أعلى: آثار الأصلي (رمادي فاتح) والمتوسط (الأحمر) من EpsPs ChrimsonR يحركها، أثار مع 470 نانومتر الضوء الأزرق في نفس الطاقة البصرية المستخدمة في A، أعلى (أشرطة مقياس تظهر 20 مللي ثانية / 0.5 mV). أسفل: العلاقة بين الطاقة البصرية في 470 نانومتر واحتمال مراقبة PSP ChrimsonR يحركها. لاحظ أن عتبة تنشيط الضوء الأزرق من PsPs ChrimsonR كانت مطابقة لعتبة الحصول على Chronos PSPs. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: توصيف PSPs التي تثير الضوء من نقاط الاشتباك العصبي التابعة للكومينات على الخلايا العصبية VIP. تم حقن IC الأيمن مع rAAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH وصنعت التسجيلات من الخلايا العصبية VIP في ICc المواجهة. (أ)تم استحضار IPSPs البَرَبالجيني من خلال ومضات الضوء الأزرق 2-5 مللي ثانية (يسار) في حين تم حظر EPSPs بمقدار 10 ميكرومتر NBQX و50 ميكرومتر D-AP5. تم إلغاء IPSPs بواسطة gabazine (يمين). (ب)استُثيرت الـ EPSPs التي تثيرها البوجينيات من قبل ومضات الضوء الأزرق 2-5 مللي ثانية (يسار) في حين تم حظر IPSPs بـ 1 ميكرومتر استريكنين و5 ميكرومتر جابازين. غسل في 50 ميكرومتر D-AP5 خفضت بشكل كبير نصف العرض والاضمحلال الوقت ثابت من EPSPs الضوء أثار (الأوسط). غسل في 10 μM NBQX إلغاء EPSP المتبقية (حق). تظهر الآثار الأصلية في A و B باللون الرمادي الفاتح، وتظهر المتوسطات من ما يصل إلى 50 آثارًا فردية باللون الأسود. من غويير وآخرون، 2019. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: إحداثيات Stereotaxic لحقن rAAV في IC وDCN. جميع الإحداثيات هي نسبة إلى لامبدا في μm. يتم قياس إحداثيات Z من السطح الظهري للجمجمة في لامدا.

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.