Method Article

القياس الكمي لمستويات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الرأس الفضائية

DOI:

10.3791/60766

⸱

February 11th, 2020

1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Alcohol Research Center, University of Louisville

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل بروتوكولًا لقياس مستويات الإيثانول في جنين حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس من طرق التعرض المناسبة لمعالجة الأجنة وتحليل الإيثانول.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) سلسلة متصلة متغيرة للغاية من عيوب النمو الناجمة عن الإيثانول، بما في ذلك خلل في الشكل وإعاقات عصبية. مع علم الأمراض المعقد ، يؤثر FASD على ما يقرب من 1 من كل 100 طفل يولدون في الولايات المتحدة كل عام. نظرًا للطبيعة المتغيرة للغاية لـ FASD ، أثبتت النماذج الحيوانية أهميتها الحاسمة في فهمنا الآلي الحالي لعيوب التنمية الناجمة عن الإيثانول. وقد ركز عدد متزايد من المختبرات على استخدام سمك الحمار الوحشي لفحص العيوب التنموية الناجمة عن الإيثانول. تنتج سمكة الحمار الوحشي أعدادًا كبيرة من الأجنة الملقحة خارجيًا والقابلة للنقل وراثيًا والشفافة. وهذا يسمح للباحثين بالتحكم الدقيق في توقيت وجرعة التعرض للإيثانول في سياقات وراثية متعددة وتحديد تأثير التعرض للإيثانول الجنيني من خلال تقنيات التصوير الحي. وقد ثبت أن هذا ، إلى جانب الدرجة العالية من الحفاظ على كل من علم الوراثة والتنمية مع البشر ، هو نموذج قوي لدراسة الأساس الآلي لمسخالإيثانول. ومع ذلك، فقد تنوعت نظم التعرض للإيثانول بين دراسات مختلفة لسمك الحمار الوحشي، مما أربك تفسير بيانات سمك الحمار الوحشي عبر هذه الدراسات. هنا هو بروتوكول لتحديد تركيزات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف اضطرابات طيف الكحول الجنينية (FASD) مجموعة واسعة من العاهات العصبية وخلل الشكل القحفي المرتبط بالتعرض للإيثانول الجنيني1. عوامل متعددة، بما في ذلك توقيت وجرعة التعرض للإيثانول والخلفية الوراثية، تسهم في الاختلاف من FASD2،3. في البشر ، والعلاقة المعقدة من هذه المتغيرات يجعل دراسة وفهم مسببات FASD تحديا. وقد أثبتت النماذج الحيوانية حاسمة في تطوير فهمنا للأساس الآلي لمسخة الإيثانول. وقد استخدمت مجموعة واسعة من أنظمة النماذج الحيوانية لدراسة جوانب متعددة من FASD وكانت النتائج متسقة بشكل ملحوظ مع ما هو موجود في التعرض في البشر4. وتستخدم أنظمة نموذج القوارض لدراسة ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم رفع جميع أجنة حمار وحشي المستخدمة في هذا الإجراء وتربيتها بعد بروتوكولات IACUC الراسخة27. تمت الموافقة على هذه البروتوكولات من قبل جامعة تكساس في أوستن وجامعة لويزفيل.

ملاحظة: تم استخدام خط حمار وحشي Tg (fli1:EGFP)y1 في هذه الدراسة28. جميع المياه المستخدمة في هذا الإجراء هو الماء التناضح العكسي المعقم. أجريت جميع التحليلات الإحصائية باستخدام Graphpad Prism v8.2.1.

1. جعل وسائل الإعلام الجنين

  1. لجعل مخزون 20x من وسائل الإعلام الجنين، حل 17.5 غرام من NaCl، 0.75 غرام من KCl، 2.9 غرام من CaCl2،0.41 غرام من K2HPO....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يمكن تحديد مستويات الإيثانول في الدم في وقت مبكر من سمك الحمار الوحشي الجنيني ، لأنها تفتقر إلى نظام الدورة الدموية بشكل كامل. لتحديد مستوى تركيز الإيثانول في أجنة حمار وحشي ، يتم قياس مستويات الإيثانول مباشرة من الأنسجة الجنينية المتجانسة. ولقياس تركيزات الإيثانول الجنينية بشكل صحيح، يجب أن يؤخذ الحجم الجنيني في الاعتبار. الجنين (صفار المرفقة) يجلس داخل chorion (قشر البيض) محاطة السائل خارج الجنين(الشكل 1). يجب إجراء أي مقياس لحجم الجنين على الأجنة في وقت التعرض ، لأن الحجم الجنيني سيتغي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكنظام نموذجي تنموي، فإن سمك الحمار الوحشي مناسب بشكل مثالي لدراسة تأثير العوامل البيئية على التنمية. وهي تنتج أعدادا كبيرة من الأجنة المخصبة خارجيا، مما يسمح بمواعيد دقيقة وجرعات نموذجية في دراسات الإيثانول. هذا، جنبا إلى جنب مع قدرات التصوير الحي والحفاظ على الوراثية والتنموية مع البشر، وجعل حمار وحشي نظام نموذج قوي لدراسات علم المسخ. وصف هو بروتوكول لقياس تركيزات الإيثانول الجنينية في تطوير أجنة حمار وحشي باستخدام الكروماتوغرافيا غاز الفضاء الرأس.

تحديد تركيز الإيثانول الجنيني أمر بالغ الأه.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث المقدم في هذه المقالة من خلال المنح السابقة من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه القحفي (NIH / NIDCR) R01DE020884 إلى J.K.E. والمعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول (NIH / NIAAA) F32AA021320 إلى C.B.L. وعن طريق المنحة الحالية من المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني لتعاطي الكحول (NIH / NIAAA) R00AA023560 إلى C.B.L. نشكر روبن غونزاليس على تقديم ومساعدة في تحليل الكروماتوجراف الغاز. نشكر تياهنا أونتيفيروس والدكتورة جينا نوبلز على المساعدة في الكتابة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الهواءالمقدم بموجب عقد للجامعة
الميزان التحليليVWR10204-962
AutoSampler ، CP-8400VarianGasChromatograph Autosampler
الكلسيوم كلوريد الكالسيومVWR97062-590
مختبراتالإيثانول2701
قارورة كروماتوجراف الغاز مع حاجز بولي تترافلورو إيثيلين / سيليكون وغطاء بلاستيكي 2 ملAgilent8010-0198يمكن إعادة استخدام القوارير بعد التنظيف ، ولكن ليس الأغطية / الحاجز
كروماتوجراف الغاز ، CP-3800Varian
Heliumمقدمة بموجب عقد للجامعة
HP Innowax العمود الشعريAgilent19095N-123I30 م × 0.53 مم × 1.0 & م فيلم
Hyrdogenيتم توفيره بموجب عقد للجامعة
كبريتات المغنيسيوم (Heptahydrate)أنبوب الطرد المركزي الدقيق فيشر ScientificM63-500
1.5 ملفيشر Scientific2682002
أطراف الماصة الدقيقة 10 & mu; Lفيشر 13611106
العلمية أطراف الماصة الدقيقة 1000 مو ؛ Lفيشر13611127
العلمية أطراف الماصة الدقيقة 200 مو ؛ إلفيشر 13611112
علمي أطباق بتري 100 ممفيشر ساينتفيكFB012924
Pipetman L p1000L MicropipetteGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MicropipetteGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MicropipetteGilsonFA10001M
Polytetrafluoroethylene / Silicon septum و غطاء بلاستيكيAgilent5190-7021أغطية استبدال / حاجز لقوارير كروماتوجراف الغاز
كلوريد البوتاسيومفيشر ScientificP217-500
فوسفات البوتاسيوم (ثنائي الأساسي)VWRBDH9266-500G
PronaseVWR97062-916
حبات السيليكا .5 مممنتجات Biospec11079105z
حبات السيليكا منتجات Biospec 1.0 مم11079110z
بيكربونات الصوديومVWRBDH9280-500G
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271-500
فوسفات الصوديوم (ثنائي الأساسي)فيشر ScientificS374-500
ألياف الاستخراج الدقيق للمرحلة الصلبة Carboxen / PolydimethylsiloxaneMillipore Sigma57343-Uألياف بديلة
كروماتوغرافيا النجومبرنامجكروماتوغرافيا
Thermogreen منخفض النزيف (LB-2) SeptaMillipore Sigma23154استبدال الحاجز المدخل
Decon سميك مجموعة محطة عمل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study. Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).
  2. Cudd, T. A. Animal model systems for the study of alcohol teratology.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ethanol QuantificationHead Space Gas ChromatographyZebrafish EmbryosFetal Alcohol Spectrum DisordersProtease Cocktail TreatmentEmbryo Volume MeasurementGas Chromatography AnalysisEthanol Concentration CalculationMedia Reference SamplesEmbryonic Water Content

Related Articles