وبالنظر إلى أن الـ GPCRs أهداف جذابة قابلة للتخدير، فإن فحص GPCR ligand أمر لا غنى عنه لتحديد مركبات الرصاص ودراسات إزالة التيتم. نحو هذه الجهود، ونحن نصف PRESTO-Tango، منصة موارد مفتوحة المصدر تستخدم للتنميط المتزامن للتجنيد العابر في حوالي 300 GPCRs باستخدام تقييم مراسل TEV.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
باعتبارها أكبر وأكثر تنوعا الجينات superfamily والوسطاء من سلسلة من مسارات الإشارات الخلوية، G-البروتين مقرونة مستقبلات (GPCRs) تمثل واحدة من الأهداف الواعدة لصناعة الأدوية. Ergo ، وتصميم وتنفيذ وتحسين GPCR ligand فحص المقالات أمر بالغ الأهمية ، لأنها تمثل أدوات التحكم عن بعد لاكتشاف المخدرات والتلاعب الدوائية GPCR والنتائج. في الماضي ، كانت المقالات المعتمدة على البروتين G تجسد هذا المجال من البحث ، واكتشاف الأحداث الناجمة عن ligand وتحديد عدد الرسل الثانويين. ومع ذلك ، منذ ظهور الانتقائية الوظيفية ، فضلا عن زيادة الوعي بعدة مسارات أخرى G المستقلة عن البروتين والقيود المرتبطة بمقالات G-البروتين تعتمد ، هناك دفعة أكبر نحو خلق بديل GPCR ligand فحص المقالات. نحو هذا المسعى ، ونحن نصف تطبيق واحد من هذه الموارد ، ومنصة PRESTO - Tango ، وهو نظام قائم على مراسل luciferase التي تمكن من الاستجواب المتوازي والمتزامن للGPCR -ome الإنسان ، وهو إنجاز كان ينظر فيه سابقا من الناحية الفنية والاقتصادية غير مجدية. واستناداً إلى اختبار تجنيد مستقل من نوع G-protein-ed-arrestin2، فإن عالمية الاتجار ببوساطة α-arrestin2 والإشارة في GPCRs تجعل PRESTO-TANGO أداة ملائمة لدراسة ما يقرب من 300 من وحدات GPCRs البشرية غير الشمية، بما في ذلك ما يقرب من 100 مستقبلات اليتيم. حساسية PRESTO-Tango وقوتها تجعلها مناسبة للشاشات الأولية عالية الإنتاجية باستخدام المكتبات المركبة ، وتستخدم للكشف عن أهداف GPCR جديدة للأدوية المعروفة أو لاكتشاف ليغاند جديدة للمستقبلات اليتيمة.
المقدمة
تشكل مستقبلات البروتين G-المقترنة (GPCRs) أكبر عائلة وأكثرها تنوعًا من البروتينات عبر الغشاء ، وتعمل كواجهات اتصال بين الخلية وبيئتها1. ويبرز براعة GPCRs من خلال قدرتها على الكشف عن مجموعة متنوعة من ligands - من الناقلات العصبية إلى النيوكليوتيدات ، والببتيدات إلى الفوتونز ، وغيرها الكثير ، فضلا عن قدرتها على تنظيم العديد من الشلالات إشارات المصب المشاركة في النمو الخلوي ، والهجرة ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج ، وإطلاق الخلايا ، وما إلى ذلك2،3. وبالنظر إلى انتشارها ومشاركتها في العديد من العمليات الفسيولوجية ، فإن هذه العائلة المستقبلة ذات أهمية علاجية قصوى ، ويتضح ذلك من خلال حقيقة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الفحص الأولي: زراعة الخلايا وبذر الصفيحة
- لإعداد لوحات بولي-L-ليسين (PLL)، الاستغناء 20 ميكرولتر/بئر من 25 ميكروغرام/مل من محلول الأسهم PLL في الأبيض أو الأسود 384-well لوحات القاع البصرية باستخدام ماصة متعددة القنوات الإلكترونية أو موزع كاشف. احتضان لوحات في درجة حرارة الغرفة لمدة 0.5-2 ساعة.
ملاحظة: إذا كنت تستخدم اللوحات السوداء 384-well، فتوقع أن تكون إشارة الخلفية أقل مقارنة باللوحات البيضاء. يوصى باللوحات السوداء للحد من النزيف من خلال التلألؤ بين الآبار المجاورة. - للحفاظ على لوحات المغلفة وغسل قبالة PLL الزائدة، وإزالة PLL عن طريق النقر عليه على الحوض، والاستفادة الجافة على منشفة ورقية، وإضافة 40 ميكرولتر / جيدا من محلول 1x المخفف من الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام بروتوكول PRESTO-Tango المعروض هنا ، تم فحص مستخلص حبيبات الكرومافين (CG) مقابل 168 هدفًا من أهداف GPCR غير الشمية ، وغالبيتها هي مستقبلات يتيمة. تم تنفيذ التنميط من استخراج وقال من خلال فحص تعبئة α-arrestin2 في المستقبلات المختارة، استنادا إلى المبدأ الذي صممه بارنيا وآخرون18 (الشكل 1). تم أخذ Plasmid cDNA من GPCRs ذات الأهمية من مجموعة PRESTO-Tango GPCR وتجميعها في لوحتين من 96 في التخطيط المطلوب. في المجموع ، تم نقل أربعة لوحات 384 بئرًا المصنفة بخلايا HTLA.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وGPCRs ديناميكية تشكيلية هي القوى من نقل الإشارات. الخصائص الفيزيوكيميائية للجيوب الملزمة لهذه المستقبلات heptahelical، فضلا عن أهميتها الفسيولوجية تؤكد الحاجة إلى أدوات فحص جي بي سي آر ليغاند. وكما هو موضح أعلاه، فإن اختبار PRESTO-Tango سريع وحساس وسهل الاستخدام، ويضفي نفسه على تطوير المخدرات. ليس فقط هذا القياس الفحص الحثي التنشيط، ولكن يمكن أيضا أن تستخدم لتحديد حجم نشاط الخصوم والموسرات allosteric19. في ضوء الانتقائية الوظيفية، وهو مفهوم يشير إلى أن هياكل المخدرات المختلفة يمكن أن تثير مستقبلا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
تعلن ساعات العمل عن عدم وجود مصالح متنافسة.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR منحة #MOP142219).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 384 ألواح سفلية بصرية للآبار ، قاعدة بوليمر البوليسترين ، معالجة بزراعة الخلايا ، أسود ، مع غطاء ، معقم | NUNC | 12-566 | |
| 384 ألواح سفلية بصرية جيدة ، قاعدة بوليمر البوليسترين ، معالجة زراعة الخلايا ، أبيض ، مع غطاء ، معقم | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 قاع دائري جيدا ، بولي بروبيلين ، غير معالج ، أزرق ، غير معقم ، بدون غطاء | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| المضادات الحيوية المضادة للفطريات | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin ، ملح الصوديوم | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM مع L-Glutamine ، 4.5 جم / لتر من الجلوكوز وبيروفات الصوديوم | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer ، 12 قناة ، متغير ، 15 & ndash ؛ 300 وميكرو ؛ L | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer ، 12 قناة ، متغير ، 5 & ndash ؛ 100 وميكرو ؛ L | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2x3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | طقم #1000000068 |
المراجع
- Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
