نحن نقدم نموذج مورين من التعريفي الموت الدماغي من أجل تقييم تأثير آثاره المرضية الفسيولوجية على الأعضاء وكذلك على الطعوم المتتالية في سياق زرع الأعضاء الصلبة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحريض الموت الدماغي في الفئران باستخدام مراقبة ضغط الدم داخل الشرايين والتهوية عبر القصبة الهوائية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في حين أن كل من التبرع الحي والتبرع بعد موت الدورة الدموية يوفران فرصًا بديلة لزرع الأعضاء ، فإن التبرع بعد موت الدماغ المتبرع (BD) لا يزال يمثل المصدر الرئيسي لعمليات زرع الأعضاء الصلبة. لسوء الحظ ، من المعروف أن فقدان وظيفة الدماغ الذي لا رجعة فيه يسبب تغييرات فيالفيزيولوجية متعددة ، بما في ذلك التغيرات الهيموديناميكية وكذلك التعديلات الهرمونية ، مما يؤدي في النهاية إلى استجابة التهابية الجهازية. النماذج التي تسمح بإجراء تحقيق منهجي لهذه الآثار في الجسم الحي نادرة. نحن نقدم نموذج مورين من التعريفي دينار بحريني، والتي يمكن أن تساعد التحقيقات في الآثار المدمرة للدينار بحريني على جودة allograft. بعد تنفيذ قياس ضغط الدم داخل الشرايين عبر الشريان السباتي المشترك والتهوية الموثوقة عن طريق القصبة الهوائية ، يتم حث BD عن طريق الضغط الداخلي المتزايد باطراد باستخدام قسطرة البالون. بعد أربع ساعات من تحريض دينار بحريني، يمكن حصاد الأعضاء للتحليل أو لمزيد من إجراءات زرع الأعضاء. تمكن استراتيجيتنا من التحليل الشامل للمتبرع دينار بحريني في نموذج مورين ، مما يسمح بفهم متعمق للآثار المتعلقة بدينار بحريني في زرع الأعضاء الصلبة وربما يمهد الطريق إلى الشروط المسبقة المثلى للأعضاء.
المقدمة
زرع هو حاليا العلاج العلاجي الوحيد لفشل الجهاز في المرحلة النهائية. حتى الآن، كان مرضى الموت الدماغي (BD) المصدر الرئيسي للتبرع بالأعضاء، على الرغم من أن التبرع الحي والتبرع بعد موت الدورة الدموية هما بديلان قيمان1. يتم تعريف دينار بحريني من قبل غيبوبة لا رجعة فيها (مع سبب معروف), عدم وجود ردود الفعل الجذعية في الدماغ وانقطاع النفس2. لسوء الحظ، تظهر أجهزة BD نتائج أقل شأنافيا في البقاء على قيد الحياة الكسب غير المشروع على المدى الطويل مستقلة عن مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) - عدم التطابق والوقت نقص التروية الباردة3. وفي الوقت نفسه، تم إجراء بحوث مكثفة على هذا العامل خطر المستضد مستقلة مما أدى إلى ثلاثة جوانب رئيسية من التغيرات الفسيولوجية المرضية بوساطة نتيجة لBD: الهيموديناميكي، الهرمونية، والتهابات4.
حتى الآن، تم تنفيذ نماذج BD التجريبية في القوارض في الغالب باستخدام الفئران. من أجل الحصول على مزيد من البصيرة في العواقب المناعية على الأعضاء الصلبة بعد دينار بحريني، ونحن تهدف إلى إنشاء نموذج المورين من دينار بحريني، كما حاليا نماذج الماوس فقط تسمح لإجراء تحقيقات شاملة في العوامل الوراثية أو المناعية. في هذا السياق، يوفر نظام الماوس مجموعة أكبر من الأدوات التحليلية.
ويستند مبدأ التعريفي دينار بحريني كما هو موضح هنا على زيادة في الضغط داخل الجمجمة الناجمة عن تضخم قسطرة بالون إدراجها تحت الجمجمة. زيادة الضغط داخل الجمجمة يحاكي الآلية الفسيولوجية للدينار بحريني عن طريق منع تقرحات المخيخ، المخيخ، وجذع الدماغ5،6. لضمان ما يكفي من التروية في الأعضاء الطرفية ، يكون قياس ضغط الدم إلزاميًا أثناء الإجراء. القسطرة المستخدمة لهذا الغرض في نفس الوقت يخدم لإدارة المالحة من أجل تثبيت ضغط الدم عن طريق استبدال السوائل. بما أن دينار بحريني مصحوب بتوقف التنفس التلقائي ، يجب ضمان التهوية الكافية. بطانية كهربائية تحافظ على درجة حرارة الجسم الأساسية الفسيولوجية.
وباختصار، فإن هذا النموذج تمكين دراسات متعمقة في تأثير الإصابة الناجمة عن دينار بحريني، على هجرة الكريات البيض7،التنشيط مجاملة8،إصابة إعادة التروية9،وغيرها من العوامل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا لمبادئ رعاية الحيوانات المختبرية التي صاغتها الجمعية الوطنية للبحوث الطبية ودليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية الذي أعدته الأكاديمية الوطنية للعلوم ونشرته المعاهد الوطنية للصحة (المنشور رقم 86-23 الصادر عن المعاهد الوطنية للصحة، المنقح في عام 1985). وقد وافقت وزارة التعليم والعلوم والثقافة النمساوية على جميع التجارب (BMWF-66.011/0071-II/3b/2012).
1- القسطرة الشريانية
- مخدر الماوس مع حقن داخل perperitoneal من الكيتامين وxylazine10 ومسكن وفقا للممارسة المحلية (على سبيل المثال buprenorphine). قرصة الأطراف الخلفية مع ملقط لتأكيد العمق الصحيح للتخدير.
ملاحظة: بالنسبة لهذه الدراسة، استُخدمت فئران C57BL/6N الذكور في سن 8-12 أسبوعاً (الوزن 20-25 جم). وقد اختبر المؤلفون الذكور BALB / ج من نفس العمر دون جدوى ولكن لم يجربسلالات أخرى (انظر المناقشة). - إزالة الشعر في المناطق ذات الاهتمام (الرأس والرقبة) باستخدام شفرة حلاقة كهربائية. تأكد من عدم بقاء أي شعر فضفاض لمنع تلوث الجرح. تطهير في وقت لاحق المجال الجراحي مع الإيثانول 70٪ / الكلورهيكسيدين / البيتادين ووضع الماوس مع الرأس التي تواجه الجراح.
- قم بعمل شق خط وسطي عنق الرحم مع تشريح المقص.
- تشريح الغدد تحت الفك السفلي وأنسجة عضلات الرقبة وفصلها من أجل فضح الشريان السباتي المشترك. استخدام تشريح حادة في الغالب عن طريق ملقط.
- مكان ثلاثة 8-0 أربطة الحرير تحت الشريان السباتي المشترك الصحيح.
- وضع المشبك على الرباط القريب وجلب التوتر في الشريان بحيث يتم تعليق التدفق.
- أغلق الرباط الأكثر ذهولًا.
- أدخل القسطرة الشريانية من خلال ثقب جلدي صغير مُصلح على الجانب القحفي للشق. ضغط وتشوه تجويف القسطرة إذا كان يبدو كبيرًا جدًا لتقليل تدفق الدم إلى الوراء. تركز مع جميع الأربطة الثلاثة.
- قم بتثبيت القسطرة على الجلد لتجنب الخلع. القيام بذلك باستخدام خياطة (على سبيل المثال، 5-0 monofilament، غير قابل للامتصاص) الذي يربط القسطرة إلى الجلد في منطقة ثقب الجلد إصلاحها.
2- القصبة الهوائية
- تشريح العضلات ما قبل التراجيدي بصراحة باستخدام ملقط.
- ضع اثنين 8-0 أربطة الحرير تحت القصبة الهوائية.
- Tracheotomize باستخدام مقص صغير أقرب ما يمكن لتجنب التهوية من جانب واحد. استخدام خط القطع الأفقي بين اثنين من غضروف القصبة الهوائية.
- أدخل أنبوب التهوية ومثبتمع كل من الأربطة المعدة.
ملاحظة: لا تحتاج النهاية القريبة من القصبة الهوائية إلى ربطها. - أغلق الجلد بخياطة جارية (على سبيل المثال، 6-0 monofilament، غير قابل للامتصاص).
- تهوية الماوس بتردد 150/min وحجم المد والجزر من 200 ميكرولتر.
3. تحريض الموت الدماغي
- ترتيب الماوس إلى الموضع المعرض.
- إزالة الجلد من الجمجمة باستخدام مقص الجراحية وملقط لعقد الجلد.
- حفر 1 ملم عيار حفرة باراميديالي فوق القشرة الجدارية اليسرى. وقف الحفر قبل اختراق العظام المدمجة الداخلية والجافية ماتر.
- اختراق جسر الأنسجة النهائية للجمجمة باستخدام ملقط حادة، وإزالة حواف حادة.
- أدخل قسطرة البالون، بحيث يكون تماما داخل تجويف الجمجمة. تأكد من أن البالون مملوء مسبقًا بالمالحة ويتم إخلاء جميع الهواء.
- ابدأ التضخم عند ~ 0.1 مل / دقيقة على مدى فترة 10-15 دقيقة (الحجم الإجمالي 0.8-1.2 مل) بمساعدة مضخة حقنة.
ملاحظة: سوف يعرض الماوس myoclonus، mydriasis، مزيد من نشاط المضبوطات واللهاث النهي. - نطق الدماغ الماوس القتلى مرة واحدة ذيل الماوس قد ذهب قاسية ونصبت.
ملاحظة: يتم تأكيد دينار بحريني من خلال ذروة ضغط الدم الأولية المميزة (منعكس كوشينغ)، وعدم وجود ردود الفعل الجذعية في الدماغ والتنفس التلقائي. يجب تجنب اختبار انقطاع النفس المنتظم أثناء التجارب ، حيث قد تصبح الفئران غير مستقرة في الدورة الدموية بسبب نقص الأكسجين. - وقف التضخم من القسطرة البالون.
- وضع بطانية التدفئة على الماوس لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
4. خلال فترة دينار بحريني
- مراقبة وتوثيق ضغط الدم بانتظام. استبعاد الفئران ذات مرحلة نقص الإنخقال المطول (متوسط ضغط الشرايين [MAP] < 50 مم زئبق لـ > 30 دقيقة).
- تغرس 0.1 مل من المالحة كل 30 دقيقة لتثبيت ضغط الدم من الماوس.
ملاحظة: في المجموع 0.8 مل من المالحة تدار لكل ماوس في هذه الدراسة. - بعد 4 ح من مدة دينار بحريني، حصاد أجهزة الماوس / الأنسجة. استبعاد الماوس من التجربة إذا كان قلب الماوس لا ينبض في نهاية التجربة.
5- إجراء الشام
- تنفيذ الخطوات 1.1−3.3.
ملاحظة: لا تفتح العظام المدمجة الداخلية. لا تقم بإدخال أو تضخيم قسطرة بالون. - البقاء على مقربة من الماوس ومراقبة باستمرار الحيوان. قرصة مرارا وتكرارا الأطراف الخلفية مع ملقط لتأكيد العمق الصحيح للتخدير. تطبيق التخدير إضافية تحت الجلد (حوالي 1/2 من جرعة البداية) إذا كان الماوس يظهر علامات الصحوة، والتي، لتجربتنا، يحدث تقريبا بعد 2-3 ساعة بعد التخدير.
- تطبيق نفس الكمية من المالحة في الوريد كما هو الحال في الفئران دينار بحريني.
ملاحظة: سوف الفأر الشام استعادة التنفس التلقائي بعد التوقف عن التهوية. لن الماوس دينار بحريني. وينبغي إجراء اختبار انقطاع النفس أثناء إنشاء النموذج، ولكن خلال التجارب ينبغي تجنبه بسبب الإجهاد الفسيولوجي لا لزوم لها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تنفيذ نموذج المورين BD بنجاح أكثر من 100 مرة مع معدل نجاح أكثر من 90٪. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء زرع الأعضاء التدخلية بعد القلب والكلى بأمان7.
BD يحفز مجموعة متنوعة من التغيرات المرضية التي يمكن مزيد من التحقيق باستخدام هذا النموذج. كما هو مبين في الشكل 1, ضغط الدم يظهر ذروة ارتفاع ضغط الدم الأوليتليها مرحلة مطولة انخفاض ضغط الدم. ولتجنب الآثار الفسيولوجية الضارة لانخفاض ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
BD، عامل خطر لجودة allograft في المتبرعين متعددي الأعضاء، ينطوي على عدد كبير من التغيرات الفيزيولوجية المرضية، والتي لا يمكن تقييمها إلا بما فيه الكفاية باستخدام نماذج الحي. لا يمكن تحليل التغيرات الهيموديناميكية ، عاصفة السيتوكين ، والتغيرات الهرمونية وتأثيرها النهائي على جودة الكسب غير المشروع للأعضاء والبقاء على قيد الحياة في المختبر4. تعتمد غالبية عمليات الزرع الأساسية وكذلك الأبحاث المناعية على أدوات التشخيص المتطورة ، والتي لا تتوفر على نطاق واسع إلا في نماذج الفئران. وقد أدت نماذج الفئران ب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| القسطرة الشريانية (BD Neoflon 26G) BD | 391349 | ||
| محولات ضغط الدم (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| قسطرة استئصال الانسداد الشرياني فوغارتي N & deg ؛ 3 | شركة إدواردز لايف ساينس كوربوريشن | 120403F | |
| ملقط | FST | 11271-30 | |
| أنظمة بطانية الحرارة المنزلية مع مسبار مرن | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| مقص صغير | FST | 15018-10 | |
| حامل إبرة | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Single Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| مقص | FST | 14075-11 | |
| مجهر تجسيمي | أوليمبوس | SZX7 | |
| شريط ترانسبور | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| التنفس الصناعي للفئران (MiniVent موديل 845) شركة | هارفارد للأجهزة | 73-0043 | |
| زيلاسول | جروب | 7630109 |
المراجع
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement). Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).
- Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).
- Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. What can be learned from brain-death models? Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).
- Wilhelm, M. J., et al. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).
- Pomper, G., et al. Introducing a mouse model of brain death. Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).
- Ritschl, P. V., et al. Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury. Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).
- Atkinson, C., et al. Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts. Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).
- Oberhuber, R., et al. Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation. American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).
- Floerchinger, B., et al. Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model. Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).
- Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia. Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).
- Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart. Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).
- Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines. Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
