Method Article

تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، ونحن نصف مستقرة، استراتيجية تمايز عالية الكفاءة لتوليد الخلايا العصبية متعاطفة ما بعد ganglionic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية. هذا النموذج سيجعل الخلايا العصبية المتاحة لاستخدام الدراسات من اضطرابات غير ذات سيادة متعددة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أداة قوية لنمذجة الأمراض ودراسة النمو الجنيني البشري في المختبر. قدمنا سابقا بروتوكول التمايز لاشتقاق الخلايا العصبية اللاإراية مع الطابع المتعاطف الذي تم تطبيقه على المرضى الذين يعانون من الاعتلال العصبي اللاإراجي. ومع ذلك ، تم بناء البروتوكول على استبدال مصل الضرب (KSR) وظروف الثقافة القائمة على التغذية ، ولضمان كفاءة التمايز العالية ، كان فرز الخلايا ضروريًا. هذه العوامل تسبب تقلب عالية، وارتفاع التكلفة، وانخفاض الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقق من الخصائص المتعاطفة الناضجة، بما في ذلك النشاط الكهربائي. هنا ، نقدم بروتوكولًا مثاليًا حيث يتم تنفيذ ثقافة PSC والتمايز في ظروف ثقافة خالية من التغذية ومحددة كيميائيًا. يتم تحديد العلامات الوراثية التي تحدد قمة الجذع العصبية. ويتحقق مزيد من التمايز في الخلايا العصبية المتعاطفة ما بعد ganglionic بعد 20 يوما دون الحاجة إلى فرز الخلايا. تسجيل الكهربية تظهر كذلك هوية الخلايا العصبية الوظيفية. يمكن تعزيز إطلاق النار المكتشف ة من الخلايا العصبية المتمايزة لدينا عن طريق النيكوتين وقمعها من قبل مستقبلات الأدينرجية خصم بروبرانولول. يمكن الحفاظ على السلف العصبية المتعاطفة المتوسطة في هذا البروتوكول كسفيرات عصبية لمدة تصل إلى أسبوعين ، مما يسمح بتوسيع الثقافات. باختصار، لدينا تحديث بروتوكول التمايز العصبية المتعاطفة يظهر كفاءة التمايز عالية، واستنساخ أفضل، والمزيد من المرونة، وتحسين النضج العصبي مقارنة مع الإصدار السابق. هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع الخلايا اللازمة لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي اللاإرادي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية المتعاطفة بعد ganglionic (symNs) تنتمي إلى الجهاز العصبي اللاإراجي (ANS) ولها أدوار هامة متعددة في الاستجابة وتنظيم التوازن في الجسم مستقلة عن الوعي. على سبيل المثال، يحفز الإجهاد السمنون ويثير استجابة القتال أو الطيران التي تؤدي إلى زيادة في معدل ضربات القلب وضغط الدم والتعرق. تتأثر SymNs في اضطرابات بشرية متعددة بسبب علم الوراثة أو السمية / الإصابة ، أو كمرافقين لأمراض أخرى. مثال على الاعتلال العصبي الوراثي هو اضطراب الطفولة Dysautonomia (FD) ، حيث يؤدي خلل التنظيم الشديد للsymNs إلى أزمة dysautonomic ، واضحة من خلال التعرق ، لطخة الجلد ، نوبات القيء ، ارتفاع ضغط الدم ، والقلق1. مثال على السمية هو العلاج الكيميائي، الذي أفيد أن له آثار جانبية سامة على الخلايا العصبية اللاإراية2. ومن المعروف أن الإرادي اللاإرادي وفرط التعصيب يمكن أن يؤدي إلى، أو يرافق، أمراض مثل مرض باركنسون أو مرض الكلى ارتفاع ضغط الدم3,4. وبالتالي ، فإن القدرة على إجراء البحوث وفهم آليات علم الأحياء والعيوب في سياق المرض مفيد للبحث عن علاجات جديدة وفعالة.

تشريح
يتفرع الجهاز العصبي المحيطي إلى الانقسامات الحسية واللاإراسية. الأعصاب المنفأة في الجهاز العصبي الحسي هي المسؤولة عن الإحساس بالألم واللمس ، في حين أن ANS مسؤولة عن نقل المعلومات من جميع الأجهزة إلى الدماغ. وينقسم ANS إلى الجهاز العصبي المعوي، والداخلية في الجهاز الهضمي، والجهاز العصبي شبه متعاطف، وهو أمر مهم للاسترخاء، والجهاز العصبي المتعاطف (SNS)، وهو أمر مهم لتنشيط / تنظيم الأجهزة. SNS تتكيف مع نظام اثنين من الخلايا العصبية5. المحاور العصبية المتعاطفة قبل ganglionic في الحبل الشوكي المشروع الأول إلى ganglia متعاطفة، حيث توجد أجسام الخلية symN ما بعد ganglionic. ثم ترسل هذه الخلايا العصبية إسقاطات طويلة لإيوينال الأنسجة المستهدفة من كل عضو في الجسم. الإشارات التي تنتقل عن طريق الخلايا العصبية قبل الغانغليونية هي الكوليني، في حين أن symNs ما بعد الغانغليونية هي التحسسية وبالتالي التعبير عن النورادرينالين (NE) كناقل عصبي رئيسي. هناك استثناءات قليلة ملحوظة من الخلايا العصبية ما بعد ganglionic, متعاطفة التي هي الكوليني, بما في ذلك تلك الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا العصبية الأيدرينرجية ما بعد ganglionic التعبير عن إنزيمات التيروزين هيدروكسيلاز (TH), العطرية L-الأمينية حمض decarboxylase (AAAD), الدوبامين α-هيدروكسيلاز (DBH), وأوكسيديز أحادي الأمين (MAO-A), جميع المسؤولة عن توليد واستقلاب NE. وعلاوة على ذلك، فإنها تعبر عن ناقلات إعادة التدوير NE و / أو مستقبلات α-adrenergic (ADRA2)، مستقبلات الأدريين (ADR2B)، الناقل النورادرينالين (NET1)، وناقل اليورياميني الفيمركب (VMAT1/2).

التنميه
خلال تطور الجنين ية يتم اشتقاق symNs من القمة العصبية (NC), الذي يظهر بين الأنبوب العصبي وتراكب ectoderm6,ويمكن أن تفرق في أنساب متعددة الخلايا, بما في ذلك الخلايا الصباغية, العظام الخلايا, الخلايا الدهنية, غليا, الخلايا العصبية المعوية, الخلايا العصبية الحسية, والخلايا العصبية اللاإروية7. خلايا القمم العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تأخذ عدة طرق عبر الجنين. في هذه المرحلة المبكرة من NC التنمية، والخلايا التعبير عن علامات SNAIL1/2، FOXD3، وSOX108،9،10،11. يحدد مسار الترحيل مع الموقع المحوري الذي يتبنونه النوع الفرعي NC الذي ستتطور إليه. يمكن تمييز هذه الأنواع الفرعية NC من خلال التعبير الجيني HOX محددة: NCCs الجمجمة لا تعبر عن الجينات HOX, NCCs المبهمة التعبير HOX 1-5, NCCs الجذع التعبير HOX 6-9, وNCCs sacral التعبير HOX 10-1112. ومن بينها، يُعترف بمراكز الـ NCCs للجذع كمصدر رئيسي للسيومين. SymN السلائف التعبير عن عامل النسخ MASH1/ASCL113, الذي يعزز التعبير عن PHOX2B14 وINSM115. يتم التعبير عن عائلة GATA من عوامل النسخ أثناء التطور المتعاطف المتأخر. يتم التعبير عن GATA2 و GATA3 في symNs ، والتي بدورها ينشط DBH16. عامل النسخ HAND2 مهم أيضا للتعبير عن وصيانة DBH و TH17.

وخلايا HPSCs (مثل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة) هي أداة قوية18 لتلخيص النماذج التنموية وتوليد الخلايا السلية التي يمكن استخدامها بعد ذلك لنمذجة الأمراض لمختلف الاضطرابات البشرية. وهكذا، فبينما تولد السيوم الوطني من المراكز الاستراتيجية الوطنية، من الأهمية بمكان اتباع المبادئ التوجيهية الإنمائية وتقييم التعبير عن العلامات المناسبة على طول عملية التمايز.

بروتوكول symN السابق
وقد ذكرت عدد قليل من مجموعات البحث سابقا توليد symNs من hPSCs19,20,21. المقارنة المباشرة لهذه البروتوكولات لبعضها البعض ولنا واستعرض مؤخرا22. في 201623, نشرنا بروتوكول التمايز لتوليد الخلايا العصبية اللاإراية مع حرف symN(الشكل 1A). استخدم هذا البروتوكول الوسيط القائم على KSR ، والذي تم استخدامه في كل من الحفاظ على hPSCs غير المتمايزة وتمايز الخلايا. وعلاوة على ذلك، تم الحفاظ على hPSCs على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (الخلايا المغذية MEF). لقد وظفنا هذا البروتوكول وPSCs من المرضى الذين يعانون من FD لنموذج اضطراب23. في عام 2019 ، وصفنا نسخة أكثر تفصيلاً من هذا البروتوكول القديم24. باختصار ، تم حث المصير العصبي عن طريق تثبيط SMAD المزدوج25 لمنع إشارات TGF-α و BMP في اليومين الأولين. تعزيز تفعيل WNT باستخدام CHIR99021 السلف العصبية لتصبح خلايا NC. في اليوم 11، تم فرز الخلايا من قبل FACS لCD49D+ أو SOX10+ السكان26،23، والتي أسفرت عن حوالي 40٪ كفاءة الجيل NC. ومن ثم، فإن الفرز ضروري لضمان الكفاءة والنقاء للخطوات التالية للتمايز. تم الحفاظ على NCCs وتضخيمها كspheroids مع المعالجة المشتركة من FGF2 وCHIR. بعد 4 أيام، تم مطلي spheroids NC من الصيانة وأعطيت BDNF، GDNF، وNGF لإنهاء نضوج symN. على الرغم من أن هذه symNs أعرب عن علامات symN قوية مثل ASCL1, TH, DBH, و PHOX2A, علامات لsymNs أكثر نضجا, بما في ذلك التعبير عن مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين (CHRNA3/CHRNB4) والناقل الحويصلة (VMAT1/2), كانت منخفضة حتى بعد 70 يوما من التمايز. لم يتم اختبار جينات HOX في هذا البروتوكول رسميًا ، ولم يتم التحقق من الخصائص العصبية الناضجة ، بما في ذلك النشاط الكهربي الفسيولوجي للخلايا.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لتوليد symNs(الشكل 1B). يتم الحفاظ على HPSCs في ظروف خالية من التغذية، على الأطباق المغلفة بالفيترونكتين (VTN)، باستخدام الوسائط الأساسية 8 (E8)27. وقد تم تعديل صيغة وسائل الإعلام التمايز في كل مرحلة، مما أدى إلى زيادة النسبة المئوية للسكان NC28. ويمكن القيام بنضوج symN على CD49D+/ SOX10+ فرزأو مجموعات NCC السائبة غير المصنفة. كلاهما تظهر مستويات عالية من التعبير علامة symN بحلول اليوم 30. وعلاوة على ذلك، فإن symNs ولدت مع هذا البروتوكول تستجيب للتسجيل الكهروفيزيولوجية والعلاجات مع المنشط symN والمركبات المثبطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم توفير خط مراسل H9 PHOX2B:GFP من قبل Oh وآخرون19. تم الحصول على بعض التمهيديات qPCR المستخدمة في هذه الورقة من تقنيات OriGene ، في حين يتم الحصول على بعض التسلسلات من Frith et al.20،30.

1. إعداد لطلاء الأطباق، وإعداد وسائل الإعلام، وصيانة hPSC

  1. طلاء الطبق
    1. فيترونكتين (VTN) طلاء
      1. ضع قوارير VTN في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب بالكامل ، ثم يخلط جيدًا.
      2. لطبق بيتري 100 مم، اخلط يُمزج 7 مل من 1x الفوسفات المالحة العازلة (PBS) مع 0.5 ملغم/مل VTN، إضافة محلول VTN إلى الطبق، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    2. طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي
      1. إذاثقوا قوارير مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد)على الجليد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      2. لبئر واحدة من لوحة بئر 6، مزيج 2 مل من DMEM/F12 مع 20 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي 100x، إضافة محلول مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الطبق، التفاف الطبق مع فيلم البارافين، وتخزينها في حاوية نظيفة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. العمل في أسرع وقت ممكن. يمكن تخزين الأطباق المغلفة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    3. البولييورنيثين (PO) / اللامينين (LM) / تليفيتكن (FN) الطلاء
      1. في اليوم الأول، لبئر واحد من لوحة بئر 24، مزيج 15 ميكروغرام / مل من PO مع 1 مل من 1x PBS، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. تذوب كل من LM وFN في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى إذابة تماما.
      2. في اليوم الثاني، استنسخ محلول PO، وغسل الآبار 2x مع 1x PBS، إضافة 1 مل من 1x PBS تحتوي على 2 ميكروغرام / مل من LM و 2 ميكروغرام / مل من الجبهة الوطنية واحتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. عند هذه النقطة يمكن أن تبقى الطبق مع حل LM / FN في الحاضنة لعدة أشهر طالما أنها لا تجف. إضافة أكثر 1x PBS لمنع الطبق من الجفاف.
  2. إعداد وسائل الإعلام
    1. إعداد المتوسط الأساسية 8 (E8) عن طريق إذابة زجاجة واحدة من ملحق E8 في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. مزيج الملحق مع 500 مل من متوسط E8 والمضادات الحيوية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يجب استخدام حل E8 العامل في غضون أسبوعين.
    2. إعداد متوسط تجميد hPSC عن طريق خلط 90 مل من متوسط E8 الكامل مع 10 مل من DMSO لحجم إجمالي قدره 100 مل. تصفية تعقيم.
    3. إعداد اليوم 0 إلى يوم 1 تمايز المتوسطة عن طريق خلط 100 مل من 6 (E6) الأساسية المتوسطة مع 10 ميكرون SB431542، 1 نانوغرام / مل BMP4، 300 nM CHIR99021، و 10 ميكرومتر Y27632 لحجم إجمالي قدره 100 مل.
    4. إعداد اليوم 2 إلى اليوم 10 تمايز المتوسطة عن طريق خلط 100 مل من متوسط E6 مع 10 ميكرومتر SB و 0.75 ميكرومتر CHIR99021 لحجم إجمالي قدره 100 مل.
    5. إعداد اليوم 10 إلى اليوم 14 المتوسطة spheroid عن طريق خلط المتوسطة العصبية القاعدية مع 2 مل من B27 (50x) ، 1 مل من N2 (100x) ، 2 mM L-غلوتامات ، 3 ميكرون CHIR99021 ، و 10 نانوغرام / مل FGF2 لحجم إجمالي قدره 100 مل.
    6. إعداد اليوم 14 إلى اليوم 28 المتوسطة للصيانة على المدى الطويل spheroid عن طريق إضافة 0.5 ميكرومتر من RA الطازجة إلى اليوم 10 إلى اليوم 14 المتوسطة spheroid لكل تغذية.
      ملاحظة: احتفظ دائمًا بـ RA عند -80 درجة مئوية.
    7. قم بإعداد وسيط نضوج SymN عن طريق خلط الوسط العصبي القاعدي مع 2 مل من B27 (50x) ، 1 مل من N2 (100x) ، 2 mM L-glutamate ، 25 نانوغرام / مل GDNF ، 25 نانوغرام / مل BDNF ، 25 نانوغرام / مل NGF ، 200 ميكرومتر الأسكوربيك حمضي ، و 0.2 mM dbcAMP لحجم إجمالي قدره 100 متر وينبغي استخدام الحل في غضون 2 أسابيع. قبل كل تغذية، أضف 0.125 ميكرومتر RA الطازجة. يتم استخدام هذا الحل من اليوم 14 (الخيار 1) أو اليوم 28 (الخيار 2).
    8. قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق خلط DMEM مع 2٪ FBS و 2 mM L-غلوتامات والمضادات الحيوية إذا لزم الأمر لحجم إجمالي قدره 100 مل.
  3. صيانة hPSC
    1. إذابة والحفاظ على hPSCs
      1. إعداد واحد VTN المغلفة طبق 100 ملم.
      2. لإذابة قارورة من hPSCs مباشرة من النيتروجين السائل، ووضع القارورة في حمام المياه 37 درجة مئوية، يتأرجح بعناية أنبوب في الماء حتى يذوب. نقل hPSCs المذابة إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 10 مل من 1x PBS، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
      3. تجاهل supernatant وإضافة 1 مل من متوسط E8 إلى الأنبوب. Pipette عدة مرات لإعادة تعليق تماما بيليه ومن ثم إضافة آخر 9 مل من متوسط E8 للوصول إلى 10 مل المجموع.
      4. يُستنشق حل VTN من طبق 100 مم.
      5. نقل hPSCs إلى طبق 100 مم، يهز بلطف (صعودا إلى أسفل واليسار واليمين، وليس في الدوائر) للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في الطبق
      6. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.
      7. في اليوم التالي، استنشق جميع المتوسطة والأعلاف مع 10 مل من E8.
      8. إطعام بهذه الطريقة كل يوم لمدة 3-4 أيام القادمة ومن ثم الاستعداد لتقسيم.
    2. تقسيم hPSCs
      ملاحظة: hPSCs عند نقطة تقسيم يجب أن يكون 80%-90% confluent. وينبغي ملاحظة مستعمرات كبيرة مع حواف ناعمة ومشرقة. ومع ذلك ، يجب تجنب الاتصال بين كل مستعمرة(الشكل 2B، اليوم 0 والشكل 6B).
      1. إعداد الأطباق 100 ملم المغلفة VTN حسب الحاجة.
      2. يستنشق E8 وغسل الطبق الذي يحتاج إلى تقسيم 1x مع 1x PBS.
      3. يستنشق 1x PBS وإضافة 4 مل من 0.25 M EDTA. احتضان لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
        ملاحظة: يجب تقسيم hPSCs/replatedك كمستعمرات صغيرة. لا تعامل مع EDTA أطول من 2 دقيقة لمنع الانفصال إلى خلايا واحدة. يجب أن تكون الخلايا لا تزال تعلق على سطح الطبق بعد علاج 2 دقيقة.
      4. استنشق EDTA ، وفصل المستعمرات عن طريق الأنابيب بقوة 10 مل من متوسط E8 على سطح الطبق ، وجمع جميع المتوسطة والخلايا في أنبوب 15 مل.
      5. مع hPSCs في التقاء 80٪-90٪، وتقسيم المستعمرات من قبل 1:15-1:20. على سبيل المثال، لتقسيم hPSCs بنسبة 1:20 إلى طبق واحد 100 ملم، واتخاذ 500 ميكرولتر من محلول E8/hPSCs وتخلط مع 9.5 مل من متوسط E8 الطازجة.
      6. لوحة hPSCs في VTN المغلفة 100 ملم الأطباق.
        ملاحظة: ينصح بإنشاء نسبة الانقسام المثالية لكل باحث وخط الخلية بشكل مستقل.
    3. تجميد hPSCs
      1. لطبق واحد 100 ملم من hPSCs التي هي على استعداد لتقسيم, إعداد ثلاث cryovials و 3.5 مل من المتوسطة تجميد.
        ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالوسائط والقنينات في 4 درجات مئوية أو على الجليد حتى الاستخدام.
      2. يُستنشق E8 ويُغسل الطبق 2x مع 1x PBS.
      3. استنق 1x PBS وإضافة 4 مل من 0.25 M EDTA، واحتضان لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.
        ملاحظة: يجب تجميد hPSCs كمستعمرات صغيرة في الوقت الذي سيتم تقسيمها. لا تعالج الخلايا مع EDTA أطول من 2 دقيقة لمنع الانفصال إلى خلايا واحدة. يجب أن تكون الخلايا لا تزال تعلق على سطح الطبق بعد علاج 2 دقيقة.
      4. يستنشق EDTA ، وفصل المستعمرات عن طريق الأنابيب بقوة 10 مل من 1x PBS على سطح الطبق ، وجمع جميع الخلايا المتوسطة والمتوسطة في أنبوب 50 مل.
      5. أضف 20 مل من 1x PBS والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق لغسل EDTA المتبقية.
      6. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في 3 مل من المتوسط تجميد.
      7. توزيع hPSCs بالتساوي في الغريناين الثلاثة، 1 مل لكل منهما.
      8. تخزين هاوية في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها في مربع تجميد تسيطر عليها أو شطيرة الستايروفوم لضمان انخفاض درجة الحرارة بطيئة، ومن ثم نقل إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

2. البذر hPSCs لبدء التمايز (اليوم 0)

ملاحظة: يجب أن تكون hPSCs جاهزة للتمايز بعد استقرارها (أي تقسيم 2-3x بعد الذوبان). تأكد من أن المستعمرات صحية ، مع حواف ناعمة ولامعة ، والحد الأدنى من التمايز(الشكل 2B).

  1. إعداد الأطباق المغلفة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي (24 بئرًا أو 6 أطباق جيدة) قبل يوم واحد من اليوم 0 حسب الحاجة. جلب الأطباق إلى RT في بداية التمايز.
  2. جعل اليوم 0-1 التمايز المتوسطة حسب الحاجة.
  3. يستنشق E8 من confluent ، على استعداد لتقسيم hPCSs ، وغسل الطبق 2x مع 1x PBS.
  4. إضافة 7 مل من 0.25 M EDTA لكل طبق 100 ملم، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يتم إطالة العلاج EDTA لتفريق في خلايا واحدة.
  5. Pipet قبالة جميع hPSCs (ينبغي أن تكون عائمة) ونقل إلى أنبوب 50 مل. إضافة نفس المبلغ أو أكثر من 1x PBS كحل EDTA لتخفيف EDTA.
  6. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
  7. تجاهل supernatant، إضافة 1 مل من اليوم 0-1 تمايز المتوسطة والأنابيب لتجانس الخلايا. اتبع بإضافة المزيد من المتوسط ثم مزيج لتخفيف محلول الخلية إلى تركيز مثالي لحساب الخلايا.
    ملاحظة: لا تبالغ في حل الخلية. يجب تخفيف الخلايا من طبق واحد كامل 100 ملم في 5 مل من المتوسطة للبدء.
  8. عد رقم الخلية باستخدام عداد الخلية الآلي أو مقياس الهيموكيتومتر.
  9. تمييع محلول الخلية حسب الحاجة للوصول إلى 125,000 خلية/سم2 في حجم نهائي منخفض (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر لطبق 6 بئر أو 500 ميكرولتر لكل بئر لطبق بئر 24).
    ملاحظة: يساعد انخفاض مستوى الصوت الخلايا على إرفاق أسرع.
  10. يستنشق كل من محلول مصفوفة غشاء الطابق السفلي من الأطباق المغلفة ولوحة حل الخلية في الآبار.
  11. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.

3. العصبية كريست الخلية التعريفي (اليوم 1 إلى اليوم 10، الشكل 2A)

  1. في اليوم 1 تغذية الخلايا مع يوم 0-1 تمايز المتوسطة (3 مل لكل بئر ل6 أطباق جيدة و 1 مل لكل بئر ل24 أطباق بئر).
  2. في اليوم 2 تغذية الخلايا مع يوم 2-يوم 10 تمايز المتوسطة (3 مل لكل بئر ل6 أطباق جيدة و 1 مل لكل بئر ل24 أطباق بئر).
  3. من الآن فصاعدا، ينبغي تغذية الخلايا كل يومين حتى اليوم 10 (أي أن يوم التغذية التالي سيكون اليوم 4).
    ملاحظة: من اليوم 6 على، يجب الكشف عن التلال NC(الشكل 2B). للتحقق مما إذا كان التمايز يحدث ، ينصح بحمل ثقافة تمايز موازية في الآبار الصغيرة (أي 24 بئرًا) ، التي يمكن أن تكون ملطخة لـ SOX10/AP2a وتستخدم للتعبير الجيني للعلامة على طول وقت التمايز(الشكل 2B،C).
  4. إذا فرز الخلايا، انتقل إلى القسم 4. خلاف ذلك، انتقل إلى القسم 5.

4. فلورسينس تنشيط فرز الخلايا (FACS) لعلامة قمة العصبية CD49D وتجميع خلايا NC في spheroids

ملاحظة: بالنسبة لفرز FACS، يجب الاحتفاظ بالعينات على الجليد وعدم التعرض للضوء بعد تلطيخها حتى الفرز.

  1. إعداد المخزن المؤقت FACS إذا تم فرز الخلايا.
  2. إعداد اليوم 10-14 المتوسطة spheroid.
  3. في اليوم 10، وإزالة المتوسطة، وغسل 1x مع 1x PBS.
  4. إضافة حل التفكك (انظر جدول المواد)في 2 مل لكل بئر لطبق جيدا 6 أو 1 مل جيدا لطبق بئر 24، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 20 دقيقة.
  5. Pipet قبالة جميع hPSCs ونقل إلى أنبوب 50 مل.
  6. املأ بقية الأنبوب بعازل FACS وطارد مركزي بسعر 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن يستوعب كل أنبوب 50 مل ما يصل إلى 20 مل أو أقل من محلول الخلية. وينبغي أن يكون حجم المخزن المؤقت للفاكس مرتفعاً بما يكفي لتحييد حل الانفصام.
  7. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق الخلايا مع كمية مناسبة من المخزن المؤقت FACS (~ 2 مل لكل بئر من لوحة بئر 6)، والعد لتحديد رقم الخلية.
  8. إعداد العينات التالية.
    1. العينة 1 (عنصر التحكم غير الملطخ): 1 × 106 خلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس. تصفية الخلايا من خلال غطاء مصفاة 20 ميكرون والحفاظ على أنبوب على الجليد.
    2. العينة 2 (التحكم فقط DAPI): 1 × 106 خلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل DAPI. تصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS مع غطاء مصفاة والحفاظ على أنبوب على الجليد.
    3. العينة 3 (CD49d المسمى): تعليق بقية الخلايا مع المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على PE/Cy7-مترافق CD49D الأجسام المضادة CD49D (5 ميكرولتر ل1 × 106 خلايا لكل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS) في أنبوب 15 مل واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  9. املأ الأنابيب بالعازلة وأجهزة الطرد المركزي FACS عند 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
  10. تجاهل supernatant وإعادة تعليق كل 5-10 × 106 خلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل DAPI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  11. تصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS مع غطاء مصفاة والحفاظ على أنبوب على الجليد.
  12. إعداد مجموعة أنابيب FACS التي تحتوي على 2 مل من المخزن المؤقت FACS.
  13. فرز من خلال آلة FACS مع أشعة الليزر التي يمكن الكشف عن DAPI وPE-Cy7 لعزل CD49D+ السكان.
  14. بعد الفرز، عد الخلايا التي تم فرزها.
  15. الطرد المركزي جميع الخلايا فرزها وإعادة تعليق في اليوم 10-14 متوسط كروي إلى تركيز نهائي من 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من المتوسط.
  16. لوحة 0.5 × 106 خلايا لكل بئر في ملحق منخفض جدا 24 لوحات جيدا.
  17. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.

5. تجميع خلايا NC في spheroids

  1. إذا لم يكن استخدام FACS لعزل خلايا NC وبدلاً من تجميعها في spheroids مباشرة، قم أولاً بإعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 4.2-4.5.
  2. ملء بقية الأنبوب مع 1x PBS، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
  3. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق الخلايا مع كمية مناسبة من اليوم 10-14 المتوسطة spheroid (على سبيل المثال، ~ 2 مل من المتوسط لكل بئر للوحة بئر 6)، والعد لتحديد رقم الخلية.
  4. تمييع الخلايا في اليوم 10-14 متوسط كروي إلى 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من المتوسط.
  5. لوحة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في مرفق منخفض جدا 24 لوحات جيدا.
  6. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.

6. NC الصيانة spheroid وتحريض السلف متعاطفة (اليوم 10 إلى اليوم 14، الشكل 4A)

  1. الخيار 1: الحد الأدنى من ثقافة السبرويد
    1. في اليوم 11، أضف 500 ميكرولتر من اليوم 10-14 متوسط كروي إلى spheroids NC دون تمييز المتوسط الموجود من اليوم 10. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.
    2. في اليوم 12، إمالة لوحة لتجميع spheroids NC على جانب واحد من الآبار. يستنشق بعناية ويتجاهل أكبر قدر ممكن من الوسط ، ويتغذى على 1 مل من اليوم 10-14 متوسط كروي.
    3. استمر في تغذية الخلايا كل يوم حتى اليوم 14.
    4. اختياري: إذا كانت السبوويدات مجمعة وتولد كتلة كبيرة، استخدم ماصة لكسر كتل الصنبور. وهذا يضمن أيضا أن spheroids الفردية لا تحصل كبيرة جدا.
      ملاحظة: يجب أن يكون نطاق حجم spheroid المثالي حوالي 100-500 ميكرومتر. ضمن هذا النطاق ، فإن حجم spheroids الفردية ليست حاسمة. ومع ذلك ، فإن مورفولوجيا ، مثل حواف ناعمة وواضحة(الشكل 3 والشكل 6)مهم لمزيد من النجاح. في اليوم 14، كل 24 لوحة جيدا يحتوي بشكل مثالي حول 50-60 spheroids من أحجام مختلفة ضمن نطاق الحجم المذكور أعلاه.
  2. الخيار 2: توسيع ثقافة السبرويد
    1. في اليوم 15، للحفاظ على السفية NC، تغذية مع 1.5 مل من اليوم 10-14 المتوسطة spheroid التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر RA. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: يجب إضافة RA جديدة لكل تغذية ويتم تخزينها دائماً عند -80 درجة مئوية.
    2. من الآن فصاعدا، تغذية كل يومين حتى اليوم 28 ومن ثم الاستمرار مع الطلاء من spheroids (القسم 7.1).
      ملاحظة: يتم تقسيم spheroids المتزايدة تقريبا 1x في الأسبوع عن طريق pipetting لهم مع ماصة 1 مل لتفريقها. يتم تقسيمها بنسبة تقريبية من 1:2-1:4. خلال فترة توسيع الأسبوع 2، يجب أن الخلايا رباعية تقريبا في العدد.

7- تمايز SymN ونضوجه (الخيار 1: بعد اليوم 14؛ الخيار الثاني: بعد اليوم 28)

  1. طلاء spheroids في الأطباق العادية
    1. إعداد PO / LM / FM المغلفة 24 لوحات جيدا.
    2. إعداد المتوسطة symN التي تحتوي على 0.125 μM RA (إضافة كل تغذية جديدة) و 10 ميكرومتر Y27632 (اليوم 14 فقط).
    3. في اليوم 14، إمالة لوحة لتجميع النفثالينات NC على جانب واحد من الآبار. نستنشق بعناية وتجاهل أكبر قدر ممكن من المتوسطة، وتغذية مع 1 مل من المتوسطة symN.
    4. إزالة LM / FN من لوحات المغلفة.
    5. تقسيم ولوحة كل بئر من لوحة بئر 24 إلى 4 آبار منفصلة من الجديد, المغلفة 24 لوحة جيدا. سيكون لكل بئر أصلي 1 مل ، تحتوي على 50-60 spheroids. هذا ينتج 250 ميكرولتر، تحتوي على ما يقرب من 10-15 spheroids لكل بئر على لوحة جديدة.
    6. إضافة 250 ميكرولتر من متوسطة إضافية لكل بئر.
      ملاحظة: هذا هو تقسيم 1:4; تأكد من أن يتم توزيع spheroids بشكل صحيح داخل الحل بحيث يكون الانقسام زوجيًا نسبيًا. لا يتم حساب عدد spheroids لأن الرقم النهائي لا يؤثر على نجاح إنشاء symNs.
    7. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    8. في اليوم 15 (أو اليوم 29 للخيار 2)، تغذية عن طريق استبدال جميع المتوسطة مع 1 مل من المتوسطة symN التي تحتوي على 0.125 ميكرومتر RA. من الآن فصاعدا، وينبغي تغذية الخلايا العصبية كل 2 أيام حتى اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2).
    9. بعد اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2), وينبغي تغذية الخلايا العصبية عن طريق استبدال بعناية نصف فقط من الوسط الحالي (500 ميكرولتر). من الآن فصاعدا، تغذية كل أسبوع إلا إذا المتوسطة يتحول بسرعة الأصفر.
    10. استمر في التغذية أسبوعيًا حتى النقطة الزمنية المطلوبة.
      ملاحظة: تميل symNs إلى التجميع في هياكل تشبه الغانج وهي عرضة للانفصال عن أطباق الثقافة. لمنع هذا، ينصح نصف التغذية والحد الأدنى من المناولة.
  2. خلايا الطلاء للتسجيل الكهروفيزيفسي
    1. إعداد PO / LM / FM المغلفة 96 لوحات الفيزيولوجيا الكهربائية جيدا.
    2. إعداد المتوسطة symN التي تحتوي على 0.125 μM RA (إضافة كل تغذية جديدة) و 10 ميكرومتر Y27632 (اليوم 14 فقط).
    3. في اليوم 14، جمع جميع spheroids، ثم طرد مركزي لهم في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
    4. تجاهل supernatant، إضافة 2 مل من محلول التفكك، ونقل الخليط مرة أخرى إلى واحدة من الآبار من لوحة مرفق منخفضة جدا. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2 لمدة 20-45 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على حجم spheroids، يمكن أن تكون فترة التفكك أطول من 20 دقيقة. تحقق من انفصام الخلية كل 10 دقيقة تصل إلى 45 دقيقة. اختياريا، 0.1 ملغم/مل من DNase يمكن إضافتها مع حل التفكك لمنع الحمض النووي الحر من الخلايا الميتة مما يجعل الحل لزجة. هذا اختياري في هذا البروتوكول لأن spheroids لن تجميع بمجرد فصلها تماما.
    5. Pipet لفصل تماما spheroids، ثم الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
    6. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق الخلايا مع كمية مناسبة من المتوسطة symN، وحساب رقم الخلية.
    7. لوحة الخلايا في 100،000/سم2 في PO / LM / FN المغلفة الآبار الفيزيولوجيا الكهربائية في 200 μL الحجم الإجمالي لكل بئر.
    8. في اليوم 15 (أو اليوم 29 للخيار 2)، اتبع نفس عمليات التغذية كما هو الحال في القسم 7.1. وينبغي أن يكون الحجم الإجمالي بعد اليوم 15 (أو اليوم 29 للخيار 2) 300 ميكرولتر لكل بئر.
    9. قياس الإشارات الكهربائية باستخدام جهاز صفيف متعدد الأقطاب بعد اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2).
      ملاحظة: في الخيار 2، يمكن مطلي spheroids في أي وقت بين اليوم 14-يوم 28. يمكن إجراء قياسات الإشارات الكهربائية الأولى بعد أسبوع واحد من طلاء السفيرود.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، نعطي تعليمات حول كيفية توليد symNs من hPSCs. تم تحسين ظروف الثقافة المثبتة هنا من بروتوكول نشر سابق23،24 (الشكل 1A)إلى شروط خالية من التغذية ومحددة كيميائيا(الشكل 1B). يتم توفير خيارين، واحد حيث يتم symNs في غضون 20 يوما، وآخر حيث يمكن توسيع NCCs لمدة 2 أسابيع لتوليد المزيد من الخلايا التي يمكن بعد ذلك أن تكون متمايزة في symNs(الشكل 1B،الخيار 1 و 2).

<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد نشرنا مؤخرا استعراضين، واحد مناقشة استخدام symNs المشتقة من hPSC لنمذجة المرض31، فضلا عن مقارنة متعمقة من بروتوكولات التمايز المتاحة22. وهكذا، هنا نركز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها البروتوكول الحالي لمساعدة الباحث المهتم على النجاح في صنع symNs. خلال عملية التمايز بأكملها ، من أجل الحصول على بيانات متسقة وكذلك خلايا متمايزة صحية ، يجب التحكم بعناية في التلوث في جميع المراحل. في الصيانة الروتينية hPSC، يجب إجراء اختبار الميكوبلازما كل أسبوعين أو شهري. إذا تم إجراء فرز ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر هايدي أولريش على القراءة النقدية وتحرير المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أطباق زراعة الخلايا 100 ممFalcon353003
15 مل أنابيب زراعة الأنسجة المخروطيةVWR / Corning89039-664
ألواح زراعة الأنسجة ذات 24 بئرFalcon353047
ألواح 24 بئر فائقة التثبيت Corning07 200 601 و 07 200 602
5٪ CO2 / 20٪ O2 حاضنة زراعة الأنسجةThermo Fisher / Life تقنياتHeracell VIOS 160i
50 مل أنابيب زراعة الأنسجة المخروطيةVWR / Corning89039-656
لوحات زراعة الأنسجة ذات 6 آبارCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500حل تفكك الخلايا
المضاد للجسم المضاد AP2aAbcamab108311المضيف: أرنب ؛ تخفيف 1: 400
الأجسام المضادة المضادة ل Ascl1BD Pharmingen556604المضيف: Mouse IgG1 ؛ 1: 200 التخفيف
المضاد للجسم المضاد CD49DBioLegend304313المضيف: Mouse IgG1 ؛ 5 & mu ؛ لتر / مليون خلية في 100 مو ؛ ل حجم
الأجسام المضادة المضادة ل CD49D (النمط المتماثل)BioLegend400125المضيف: Mouse IgG1 ؛ 5 & mu ؛ لتر / مليون خلية في 100 مو ؛ ل حجم
صبغة DAPISigmaD95421: 1000 تخفيف
الأجسام المضادة ل DBHImmunostar22806المضيف: أرنب ؛ 1: 500 تخفيف
الأجسام المضادة المضادة ل GFPAbcamab13970المضيف: دجاج ؛ 1: 1000 تخفيف
الجسم المضاد المضاد ل HOXC9Abcamab50839المضيف: الماوس ؛ 1: 100 التخفيف
المضاد ل NET1 الأجسام المضادةMabNET17-1المضيف: الماوس ؛ 1: 1000 التخفيف
الأجسام المضادة المضادة ل PRPHسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-377093 / H0112المضيف: الماوس IgG2a ؛ 1: 200 التخفيف
المضاد للجسم المضاد ل SOX10سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-365692المضيف: الماوس IgG1 ؛ 1: 100 التخفيف
المضاد للجسم المضادPel-FreezP40101- 150المضيف: أرنب ؛ 1: 500 تخفيف
حمض الأسكوربيكSigmaA8960-5Gتركيز المخزون: 100 ملي مولار
B27 مكملThermo Fisher / Life Technologies12587-010تركيز المخزون: 50x
BDNFR & D Systems248-BDتركيز المخزون: 10 مو ؛ جم / مل
BMP4R & D Systems314-BPتركيز المخزون: 6 ملي متر
عداد الخلاياThermo Fisher / Life Technologiesالكونتيسة الثانية
شرائح غرفة عد الخلاياInvitrogenC10312
طرد مركزيEppendorf57021 & 5424R
CHIR99021R& D Systems4423تركيز المخزون: 6 ملي مولار
Cryo-vialThermo Fisher / Life Technologies375353
ديسيبل أمبيرسيجماD0627تركيز المخزون: 100 ملي مولار
DMEMثيرمو فيشر / لايف تكنولوجيز10829-018تركيز المخزون: 1x
DMEM / F12ثيرمو فيشر / لايف تكنولوجيز11330-057تركيز المخزون: 1x
DMSOثيرمو فيشر / لايف تكنولوجيزBP231-100
E6 جيبكو متوسطA15165-01
E8 متوسطجيبكوA15169-01تركيز المخزون: 1x
E8 مكملجيبكوA15171-01تركيز المخزون: 50x
EDTASigmaED2SSتركيز المخزون: 0.5 م
لوحات الفيزيولوجيا الكهربية (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACSBeckman CoulterCytoFLEX (ل FACS)
آلة FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (للفرز)
أنابيب FACS (غطاء مرشح أزرق)أنابيب Falcon352235
FACS (غطاء أبيض)Falcon352063
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450تركيز المخزون: 10 مو ؛ جم / مل
GeltrexInvitrogenA1413202مصفوفة غشاء القاعدية. تركيز المخزون: 100x
hPSCsThomson et al. ، (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B :: eGFP
فيبرونيكتين بشري (FN)VWR / Corning47743-654تركيز المخزون: 1 مجم / مل
L-glutamineThermo Fisher / Gibco25030-081تركيز المخزون: 200 ملي مولار
خزان LNأنظمة حيوية مخصصةV-1500AB
MEA قارئAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse Laminin I (LM)R & D Systems3400-010-01تركيز المخزون: 1 مجم / مل
N2 مكملThermo Fisher / Life Technologies17502-048تركيز المخزون: 100x
جيبكو متوسط عصبيالقاعدي 21103-049تركيز المخزون: 1x
NGFPeproTech450-01تركيز المخزون: 25 & mu ؛ جم / مل
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكو14190-136تركيز المخزون: 1x
بولي إل أورنيثين هيدروبروميد (PO)سيجماP3655تركيز المخزون: 15 مجم / مل
بريموسين (مضادات حيوية)InvivoGenANTPM1تركيز المخزون: 50 مجم / مل
آلة qPCRمختبرات Bio-RadC1000 Touch
qPCRمختبرات Bio-RadHSP9601
المؤتلف FGF2R & D Systems233-FB / CFتركيز المخزون: 10 مو ؛ جم / مل
حمض الريتينويكSigmaR2625تركيز المخزون: 1 ملي مولار
SB431542Tocris / R & D Systems1614تركيز المخزون: 10 ملي مولار
تريبان بلوكورنينجMT-25-900-CI
فيترونكتين (VTN) ثيرموفيشر / لايف تكنولوجيزA14700تركيز المخزون: 0.5 مجم / مل
حمام مائيVWR / Corning706308
Y27632R & D Systems1254تركيز المخزون: 10 ملي مولار
TH جهاز آلة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

Related Articles