Method Article

تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، ونحن نصف مستقرة، استراتيجية تمايز عالية الكفاءة لتوليد الخلايا العصبية متعاطفة ما بعد ganglionic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية. هذا النموذج سيجعل الخلايا العصبية المتاحة لاستخدام الدراسات من اضطرابات غير ذات سيادة متعددة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أداة قوية لنمذجة الأمراض ودراسة النمو الجنيني البشري في المختبر. قدمنا سابقا بروتوكول التمايز لاشتقاق الخلايا العصبية اللاإراية مع الطابع المتعاطف الذي تم تطبيقه على المرضى الذين يعانون من الاعتلال العصبي اللاإراجي. ومع ذلك ، تم بناء البروتوكول على استبدال مصل الضرب (KSR) وظروف الثقافة القائمة على التغذية ، ولضمان كفاءة التمايز العالية ، كان فرز الخلايا ضروريًا. هذه العوامل تسبب تقلب عالية، وارتفاع التكلفة، وانخفاض الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقق من الخصائص المتعاطفة الناضجة، بما في ذلك النشاط الكهربائي. هنا ، نقدم بروتوكولًا مثاليًا حيث يتم تنفيذ ثقافة PSC والتمايز في ظروف ثقافة خالية من التغذية ومحددة كيميائيًا. يتم تحديد العلامات الوراثية التي تحدد قمة الجذع العصبية. ويتحقق مزيد من التمايز في الخلايا العصبية المتعاطفة ما بعد ganglionic بعد 20 يوما دون الحاجة إلى فرز الخلايا. تسجيل الكهربية تظهر كذلك هوية الخلايا العصبية الوظيفية. يمكن تعزيز إطلاق النار المكتشف ة من الخلايا العصبية المتمايزة لدينا عن طريق النيكوتين وقمعها من قبل مستقبلات الأدينرجية خصم بروبرانولول. يمكن الحفاظ على السلف العصبية المتعاطفة المتوسطة في هذا البروتوكول كسفيرات عصبية لمدة تصل إلى أسبوعين ، مما يسمح بتوسيع الثقافات. باختصار، لدينا تحديث بروتوكول التمايز العصبية المتعاطفة يظهر كفاءة التمايز عالية، واستنساخ أفضل، والمزيد من المرونة، وتحسين النضج العصبي مقارنة مع الإصدار السابق. هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع الخلايا اللازمة لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي اللاإرادي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا العصبية المتعاطفة بعد ganglionic (symNs) تنتمي إلى الجهاز العصبي اللاإراجي (ANS) ولها أدوار هامة متعددة في الاستجابة وتنظيم التوازن في الجسم مستقلة عن الوعي. على سبيل المثال، يحفز الإجهاد السمنون ويثير استجابة القتال أو الطيران التي تؤدي إلى زيادة في معدل ضربات القلب وضغط الدم والتعرق. تتأثر SymNs في اضطرابات بشرية متعددة بسبب علم الوراثة أو السمية / الإصابة ، أو كمرافقين لأمراض أخرى. مثال على الاعتلال العصبي الوراثي هو اضطراب الطفولة Dysautonomia (FD) ، حيث يؤدي خلل التنظيم الشديد للsymNs إلى أزمة dysautonomic ، واضحة من خلال التعرق ، لطخة الجلد ، نوبات القيء ، ارتفاع ضغط الدم ، والقلق1. مثال على السمية هو العلاج الكيميائي، الذي أفيد أ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم توفير خط مراسل H9 PHOX2B:GFP من قبل Oh وآخرون19. تم الحصول على بعض التمهيديات qPCR المستخدمة في هذه الورقة من تقنيات OriGene ، في حين يتم الحصول على بعض التسلسلات من Frith et al.20،30.

1. إعداد لطلاء الأطباق، وإعداد وسائل الإعلام، وصيانة hPSC

  1. طلاء الطبق
    1. فيترونكتين (VTN) طلاء
      1. ضع قوارير VTN في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب بالكامل ، ثم يخلط جيدًا.
      2. لطبق بيتري 100 مم، اخلط يُمزج 7 مل من 1x الفوسفات المالحة العازلة (PBS) مع 0.5 ملغم/مل VTN، إضافة محلول VTN إلى الطبق، واحتضان في درجة حرارة الغ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، نعطي تعليمات حول كيفية توليد symNs من hPSCs. تم تحسين ظروف الثقافة المثبتة هنا من بروتوكول نشر سابق23،24 (الشكل 1A)إلى شروط خالية من التغذية ومحددة كيميائيا(الشكل 1B). يتم توفير خيارين، واحد حيث يتم symNs في غضون 20 يوما، وآخر حيث يمكن توسيع NCCs لمدة 2 أسابيع لتوليد المزيد من الخلايا التي يمكن بعد ذلك أن تكون متمايزة في symNs(الشكل 1B،الخيار 1 و 2).

<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد نشرنا مؤخرا استعراضين، واحد مناقشة استخدام symNs المشتقة من hPSC لنمذجة المرض31، فضلا عن مقارنة متعمقة من بروتوكولات التمايز المتاحة22. وهكذا، هنا نركز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها البروتوكول الحالي لمساعدة الباحث المهتم على النجاح في صنع symNs. خلال عملية التمايز بأكملها ، من أجل الحصول على بيانات متسقة وكذلك خلايا متمايزة صحية ، يجب التحكم بعناية في التلوث في جميع المراحل. في الصيانة الروتينية hPSC، يجب إجراء اختبار الميكوبلازما كل أسبوعين أو شهري. إذا تم إجراء فرز ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر هايدي أولريش على القراءة النقدية وتحرير المخطوطة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أطباق زراعة الخلايا 100 ممFalcon353003
15 مل أنابيب زراعة الأنسجة المخروطيةVWR / Corning89039-664
ألواح زراعة الأنسجة ذات 24 بئرFalcon353047
ألواح 24 بئر فائقة التثبيت Corning07 200 601 و 07 200 602
5٪ CO2 / 20٪ O2 حاضنة زراعة الأنسجةThermo Fisher / Life تقنياتHeracell VIOS 160i
50 مل أنابيب زراعة الأنسجة المخروطيةVWR / Corning89039-656
لوحات زراعة الأنسجة ذات 6 آبارCostar3516
AccutaseInnovation Cell TechnologiesAT104500حل تفكك الخلايا
المضاد للجسم المضاد AP2aAbcamab108311المضيف: أرنب ؛ تخفيف 1: 400
الأجسام المضادة المضادة ل Ascl1BD Pharmingen556604المضيف: Mouse IgG1 ؛ 1: 200 التخفيف
المضاد للجسم المضاد CD49DBioLegend304313المضيف: Mouse IgG1 ؛ 5 & mu ؛ لتر / مليون خلية في 100 مو ؛ ل حجم
الأجسام المضادة المضادة ل CD49D (النمط المتماثل)BioLegend400125المضيف: Mouse IgG1 ؛ 5 & mu ؛ لتر / مليون خلية في 100 مو ؛ ل حجم
صبغة DAPISigmaD95421: 1000 تخفيف
الأجسام المضادة ل DBHImmunostar22806المضيف: أرنب ؛ 1: 500 تخفيف
الأجسام المضادة المضادة ل GFPAbcamab13970المضيف: دجاج ؛ 1: 1000 تخفيف
الجسم المضاد المضاد ل HOXC9Abcamab50839المضيف: الماوس ؛ 1: 100 التخفيف
المضاد ل NET1 الأجسام المضادةMabNET17-1المضيف: الماوس ؛ 1: 1000 التخفيف
الأجسام المضادة المضادة ل PRPHسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-377093 / H0112المضيف: الماوس IgG2a ؛ 1: 200 التخفيف
المضاد للجسم المضاد ل SOX10سانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-365692المضيف: الماوس IgG1 ؛ 1: 100 التخفيف
المضاد للجسم المضادPel-FreezP40101- 150المضيف: أرنب ؛ 1: 500 تخفيف
حمض الأسكوربيكSigmaA8960-5Gتركيز المخزون: 100 ملي مولار
B27 مكملThermo Fisher / Life Technologies12587-010تركيز المخزون: 50x
BDNFR & D Systems248-BDتركيز المخزون: 10 مو ؛ جم / مل
BMP4R & D Systems314-BPتركيز المخزون: 6 ملي متر
عداد الخلاياThermo Fisher / Life Technologiesالكونتيسة الثانية
شرائح غرفة عد الخلاياInvitrogenC10312
طرد مركزيEppendorf57021 & 5424R
CHIR99021R& D Systems4423تركيز المخزون: 6 ملي مولار
Cryo-vialThermo Fisher / Life Technologies375353
ديسيبل أمبيرسيجماD0627تركيز المخزون: 100 ملي مولار
DMEMثيرمو فيشر / لايف تكنولوجيز10829-018تركيز المخزون: 1x
DMEM / F12ثيرمو فيشر / لايف تكنولوجيز11330-057تركيز المخزون: 1x
DMSOثيرمو فيشر / لايف تكنولوجيزBP231-100
E6 جيبكو متوسطA15165-01
E8 متوسطجيبكوA15169-01تركيز المخزون: 1x
E8 مكملجيبكوA15171-01تركيز المخزون: 50x
EDTASigmaED2SSتركيز المخزون: 0.5 م
لوحات الفيزيولوجيا الكهربية (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
FACSBeckman CoulterCytoFLEX (ل FACS)
آلة FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (للفرز)
أنابيب FACS (غطاء مرشح أزرق)أنابيب Falcon352235
FACS (غطاء أبيض)Falcon352063
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450تركيز المخزون: 10 مو ؛ جم / مل
GeltrexInvitrogenA1413202مصفوفة غشاء القاعدية. تركيز المخزون: 100x
hPSCsThomson et al. ، (1998)WA09
hPSCsOh et al. (2016)H9-PHOX2B :: eGFP
فيبرونيكتين بشري (FN)VWR / Corning47743-654تركيز المخزون: 1 مجم / مل
L-glutamineThermo Fisher / Gibco25030-081تركيز المخزون: 200 ملي مولار
خزان LNأنظمة حيوية مخصصةV-1500AB
MEA قارئAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse Laminin I (LM)R & D Systems3400-010-01تركيز المخزون: 1 مجم / مل
N2 مكملThermo Fisher / Life Technologies17502-048تركيز المخزون: 100x
جيبكو متوسط عصبيالقاعدي 21103-049تركيز المخزون: 1x
NGFPeproTech450-01تركيز المخزون: 25 & mu ؛ جم / مل
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكو14190-136تركيز المخزون: 1x
بولي إل أورنيثين هيدروبروميد (PO)سيجماP3655تركيز المخزون: 15 مجم / مل
بريموسين (مضادات حيوية)InvivoGenANTPM1تركيز المخزون: 50 مجم / مل
آلة qPCRمختبرات Bio-RadC1000 Touch
qPCRمختبرات Bio-RadHSP9601
المؤتلف FGF2R & D Systems233-FB / CFتركيز المخزون: 10 مو ؛ جم / مل
حمض الريتينويكSigmaR2625تركيز المخزون: 1 ملي مولار
SB431542Tocris / R & D Systems1614تركيز المخزون: 10 ملي مولار
تريبان بلوكورنينجMT-25-900-CI
فيترونكتين (VTN) ثيرموفيشر / لايف تكنولوجيزA14700تركيز المخزون: 0.5 مجم / مل
حمام مائيVWR / Corning706308
Y27632R & D Systems1254تركيز المخزون: 10 ملي مولار
TH جهاز آلة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

Related Articles