Method Article

مراقبة تجميع eIF4F من خلال قياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية

DOI:

10.3791/60850

⸱

May 1st, 2020

 ,  , 
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لقياس تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية من شأنه أن يمكن المستخدم من تقييم الاضطراب الناجم عن المخدرات للديناميكيات المعقدة eIF4F في أشكال الفحص.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تبين أن تشكيل مجمع eIF4F هو العقدة الرئيسية في المصب للتقارب بين مسارات الإشارات التي غالبا ما تخضع للتنشيط على نحو غير مركب في البشر. eIF4F هو مجمع ربط الحد الأقصى المشاركة في مرحلة التوظيف مرنا-ريبوسوم من بدء الترجمة. في العديد من النماذج الخلوية وما قبل السريرية للسرطانات ، يؤدي إلغاء تحرير eIF4F إلى زيادة ترجمة مجموعات فرعية محددة من الحمض النووي الريبي تشارك في انتشار السرطان والبقاء على قيد الحياة. eIF4F هو مجمع ثلاثي التريك مبني من وحدة ربط الغطاء الفرعية eIF4E ، وeIF4A helicase والوحدات الفرعية للسقالات eIF4G. حاسمة لتجميع مجمعات eIF4F النشطة هو التفاعل البروتين البروتين بين eIF4E والبروتينات eIF4G. في هذه المقالة، نقوم بوصف بروتوكول لقياس تجميع eIF4F الذي يراقب حالة تفاعل eIF4E-eIF4G في الخلايا الحية. كما يسمح اختبار التفاعل بين البروتين البروتيني القائم على الخلايا eIF4e:4G بتقييم التغيرات الناجمة عن المخدرات في سلامة eIF4F المعقدة بدقة وموثوقية. ونحن نتصور أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها للتحقق من نشاط المركبات المتاحة تجاريا أو لمزيد من الفحص للمركبات أو الطرائق الجديدة التي تعطل بكفاءة تشكيل مجمع eIF4F.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب السيطرة على التعبير الجيني دورا محوريا في التنفيذ الصحيح للبرامج الخلوية مثل انتشار النمو والتمايز. يمكن أن تمارس آلية الرقابة التنظيمية إما على مستوى النسخ الجيني أو على مستوى ترجمة الحمض النووي الريبي. في العقد الماضي ، أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التحكم التحويلي عن طريق تعديل عملية البدء بدلا من الخطوات اللاحقة للاستطالة والإنهاء يمكن أن ينظم بدقة تركيب مجموعات فرعية محددة من البروتينات التي تلعب مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية.

وقد تورطت زيادة ترجمة mRNAs المشاركة في البقاء على قيد الحياة، والاستجابات المضادة ل autophagic ومكافحة المبرمج في العديد من أنواع السرطان وارتبطت أيضا بشكل سببي إما تنشيط منحرفة أو أكثر من التعبير عن ع....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEK293 تم استخدام خط الخلية للبروتوكول وكان مثقفا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني، 2 MM L-الجلوتامين، و 100 U/mL البنسلين / العقديبتوميسين. تم استزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون فيبيئة رطبة.

1. التقييم الكمي للاضطراب المعقد eIF4F عن طريق eIF4E:eIF4G604-646 اختبار الاستكمال

  1. زراعة الخلايا والإصابة العابرة ل eIF4E:eIF4G604-646 اختبار الاستكمال
    1. استخدم خلايا مذابة حديثا مع أقل من 20 مقطعا لجميع التجارب. في اليوم الأول، حدد رقم الخلية باستخدام عداد خلية قياسي واحسب إجمالي الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد Trypan الزرقاء

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل التحقق من صحة حساسية eIF4E:eIF4G604-646 نظام الاستكمال، تم تقييم 4EBP1 تثبيط الجمعية المعقدة eIF4F باستخدام مثبطات mTOR. عن طريق تثبيط mTORC1 كيناز الفوسفور تعتمد على الأسرة البروتين 4EBP، تثبيط mTOR يعزز ارتباط 4EBP1 إلى eIF4E، وبالتالي، eIF4F تفكيك15. تم اختبار فئتين من مثبط مختلف ميكانيكيا من kinases mTOR: rapalogs (على سبيل المثال، Rapamycin) التي هي مثبطات allosteric من mTORC1 ولكن ليس mTORC2 ومثبطات ATP القائمة على المنافسة (على سبيل المثال،.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم الطريقة الموضحة في هذه المقالة م المقايسة التكميلية المستندة إلى لوسيفيراز لرصد التجميع المعقد eIF4F كميا من خلال القياس المباشر لتفاعل eIF4G-eIF4E في الخلايا الحية. لقد قدمنا تفاصيل لاستخدام نظام إكمال eIF4E-eIF4G وأظهرنا أيضا أن النظام دقيق للغاية في قياس التفكك بوساطة 4EBP1 الناجم عن المخدرات للتفاعل eIF4E-eIF4G16. من أجل تسهيل الإنتاجية لهذا المقايسة، تم تصميم الإعداد التجريبي الموصوف في هذه المقالة لاستخدام تنسيق 96 microplate جيدا.

للحصول على أفضل النتائج، .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من الميزانية الأساسية من P53lab (BMSI ، A * STAR) ومنحة JCO VIP (A * STAR).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
293 قدما خليةThermo Fisher ScientificR70007
صفيحة مجهرية لزراعة الخلايا 96 جيدا ، F-Bottomgreiner bio-one655083
Cell Titer Glo 2.0PROMEGAG9241
Envision Multilabel ReaderPerkinElmernot applable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12 قناة 30-300 ملثيرمو فيشر Scientific4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12 قناة 5-50 ملThermo FisherScientific 4662050
FUGENE6PROMEGAE2692
Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000015< / a>
NanoBiT PPI أنظمة كاتبPROMEGAN2014
Optimem I مخفضة مصل متوسط ، لا الفينول الأحمرثيرمو فيشر العلمي11058021
شاكر المداريEppendorfغير قابل
& -Aminophenyl-m7< / sup>GTP (C10< / sub>-spacer) - AgaroseJena BioscienceAC-155S
للتطبيق

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
  3. Bhat, M., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

eIF4E eIF4G InteractionProtein Protein Interaction AssayLive Cell ImagingLuciferase Reporter AssaymTOR Inhibitor ScreeningHEK 293 CellsWestern Blot Analysism7GTP Pull DownCell Viability AssaySerial Dilution Protocol

Related Articles