يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Opsono- الالتزام بـ اختبار لتقييم الأجسام المضادة الوظيفية في تطوير اللقاح ضد عصيات الجمرة الخبيثة وغيرها من مسببات الأمراض المغلفة

3.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/60873

⸱

مايو 19, 2020

 ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 3Bioqual

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

إن فحص أوبوسونو- الالتزام هو طريقة بديلة لتشقيم القتل الفاتجية من مكتب العمليات لتقييم الوظائف opsonic للأجسام المضادة في تطوير اللقاحات.

الملخص

مقايسة opsono الالتزام هو اختبار وظيفية أن يعدد تعلق مسببات الأمراض البكتيرية إلى البلعات المهنية. لأن الالتزام هو شرط لالبالمعموم والقتل، والمقايسة هو طريقة بديلة لopsono-الفاتغة القتل المقايسة. ميزة من اختبار opsono الالتزام هو خيار استخدام مسببات الأمراض المعطلة وخطوط الخلايا الثديية ، والذي يسمح بتوحيد عبر تجارب متعددة. كما أن استخدام مسببات الأمراض المعطلة في الفحص يسهل العمل مع عوامل عدوى من المستوى 3 في مجال السلامة البيولوجية وغيرها من مسببات الأمراض الخبيثة. في عملنا، تم استخدام اختبار الالتزام opsono لتقييم القدرة الوظيفية للأجسام المضادة، من سيرا من الحيوانات المحصنة مع لقاح كبسولة الجمرة الخبيثة، للحث على الالتزام بالجمرة الخبيثة عصيات ثابتة لخط خلية الضامة الماوس، RAW 264.7. تم استخدام المجهر الفلورسي الآلي لالتقاط صور للعصيات التمسك الضامة. وارتبطت زيادة الالتزام بوجود أجسام مضادة للكبسولات في المصل. وكانت الرئيسيات غير البشرية التي أظهرت تركيزات عالية من الأجسام المضادة للكبسولات في المصل محمية من تحدي الجمرة الخبيثة. وهكذا، يمكن استخدام اختبار الالتزام opsono لتوضيح الوظائف البيولوجية للأجسام المضادة المستضدية المحددة في سيرا، لتقييم فعالية المرشحين لقاح والعلاجات الأخرى، وتكون بمثابة ارتباط ممكن من المناعة.

المقدمة

الاعتراف، والالتزام، واستيعاب، وتدهور الممرض هي جزء لا يتجزأ من البلعموم1، وهو مسار بارز في الاستجابة المناعية الفطرية المضيفة وصفها أولا Ilya Metchnikoff في 18832،3. الكريات البيض البلعوية، وكذلك خلايا أخرى في الجهاز المناعي، هي تمييزية للغاية في اختيارها من الأهداف؛ فهي قادرة على التمييز بين "المعدية غير الذاتي" و "غير المعدية الذاتي" من خلال أنماط مسببات الأمراض المرتبطة الجزيئية من قبل ذخيرة من مستقبلات التعرف على نمط (PRRs)4،5. قد يحدث أيضا اعتراف المضيف من مسببات الأمراض مع ربط أوبسونين المضيف، مثل الأجسام المكملة والأضداد6. هذه العملية، ودعا opsonization، المعاطف الممرض مع هذه الجزيئات، وتعزيز استيعاب عند ملزمة لمستقبلات opsonic (على سبيل المثال، مكملة ومستقبلات Fc) على الخلايا البلعومية6. بالنسبة لمسببات الأمراض للتمسك بالبلع، فإن الربط الجماعي لمستقبلات متعددة مع أربطةها المشتركة ضروري. وعندئذ فقط يمكن أن يؤدي الالتزام وإبقاء الشلالات إشارة داخل الخلية المضيفة لبدء استيعاب6.

نظرًا لأهمية البلعوم في إزالة مسببات الأمراض والوقاية من العدوى ، فقد طورت مسببات الأمراض خارج الخلية العديد من الطرق لتخريب هذه العملية لإطالة بقائها. استراتيجية واحدة من أهمية هو إنتاج البوليمرية anionic (على سبيل المثال، السكريات أو حمض البوليمينو) كبسولة التي هي المضادة للبولي فيغوسيتيك بحكم شحنتها، هو ضعف المناعة، والدروع جزيئات على المغلف البكتيري من PRRs6،7. مسببات الأمراض مثل Cryptococcusformans neoformans وStreptoptococcus pneumoniae كبسولات تتكون من البوليمرات saccharide ، في حين أن البشرة المكورات العنقودية وبعض أنواع Bacillus تنتج حمض poly-ɣ-glutamic (PGGA)7،8. ومع ذلك مسببات الأمراض الأخرى تنتج كبسولات تشبه النفس غير المعدية. على سبيل المثال، Pyogenes العقديات وسلالة مسببة للأمراض من B. cereus لديها كبسولة حمض الهيالوروني ليس فقط المضادة للبالثومية ولكن التي قد لا يتم الاعتراف بها أيضا الأجنبية من قبل الجهاز المناعي9،10.

الاقتران من كبسولة إلى البروتينات الناقل يحولهم من الفقراء, T-مستقلة المستضدات إلى مستضدات تعتمد على درجة عالية من المناعة T-تعتمد على أن يمكن أن تحفز عالية مصل المضادة للكبسولاتاتراتالأجسام المضادة 11,12. يتم استخدام هذه الاستراتيجية للقاحات مرخصة ضد S. الالتهاب الرئوي, الهيموفلوس الأنفلونزا, ونيسيريا التهاب السحايا11. وقد تم تقييم الأنشطة opsonic من الأجسام المضادة للكبسولات المضادة عادة من قبل opsono-الفاتغة القتل المقايسات (OPKA)13,14,15,16. هذه الاختبارات اختبار ما إذا كانت الأجسام المضادة الوظيفية يمكن أن تؤدي إلى البلعوم وقتل14. ومع ذلك، فإن استخدام مادة OPKA مع مسببات الأمراض المعدية، مثل عوامل الاختيار البيولوجية من المستوى 1 والتكسينات (BSAT)، بما في ذلك B. ANTHRACIs17، هو استخدام خطير ويعرض مخاطر أمنية؛ هذه المقايسات تتطلب معالجة واسعة النطاق من وكيل مختارة. لا يمكن أن يتم التعامل مع عوامل مختارة إلا في مختبرات المستوى المقيد للسلامة الأحيائية 3 (BSL-3)؛ يتطلب العمل في هذه المجالات إجراءات تشغيل مطولة بسبب العديد من احتياطات السلامة والأمن التي يجب اتباعها. كما أن مختبرات BSL-3 غير مجهزة عادة بالمعدات المتخصصة المستخدمة في أعمال OPKA، مثل المجاهر وأجهزة قياس السيت. وهكذا، قمنا بتطوير فحص بديل على أساس استخدام البكتيريا المعطلة18،19. ونشير إلى ذلك على أنه مقايسة للانضمام إلى مكتب العمليات لا تعتمد على النواتج المُستوعبة والقتل كمعان؛ بدلا من ذلك، يتم استخدام الالتزام مسببات الأمراض opsonized المعطلة كفهرس للبطلات. ميكانيكيا، OAA هو بديل مناسب لأن الالتزام يحدث مسبقا وتتشابك بشكل وثيق مع الداخل والقتل داخل الخلايا. ومن منظور السلامة الأحيائية، يفضل اغورا لأنه يتطلب الحد الأدنى من معالجة العامل المعدي، وهو تجريبي أقصر مدة من OPKA، ويمكن إجراؤه في مختبرات BSL-2 بعد أن يتم إنتاج ونقل مخزون من مسببات الأمراض المعطلة.

نحن نبرهن على استخدام OAA لفحص وظيفة opsonic من الأجسام المضادة للكبسولات المضادة وجدت في سيرا من الرئيسيات غير البشرية (NHPs) تطعيمها مع مركب كبسولة [أي PGGA من B. الجمرة الخبيثة مترافق إلى مجمع البروتين الغشاء الخارجي (OMPC) من التهاب السحايا Neisseria]20. تم احتضان عصيات المصل opsonized مع خط خلية الضامة الماوس الملتزم، RAW 264.7. بعد التثبيت ، تم تصوير الخلية أحادية الطبقات وعصيات المتمسك بها عن طريق المجهر المفلور. ازدادت نسبة الإلتزام البكتيري عندما تم احتضان العصيات بالمصل من NHPs التي تم تطعيمها بـ كبسولات مترافقة مقارنة بالمصل20. الالتزام يرتبط مع البقاء على قيد الحياة من التحدي الجمرة الخبيثة20,21. وهكذا، فإن استخدام اأو يتميز وظيفة الأجسام المضادة للكبسولات و سهل إلى حد كبير اختبار مرشح اللقاح لدينا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وامتثالا لقانون رعاية الحيوان، وسياسة خدمات الصحة العامة، وغيرها من القوانين واللوائح الاتحادية المتعلقة بالحيوانات والتجارب التي تنطوي على الحيوانات، أجريت البحوث الموصوفة هنا بموجب بروتوكول وافقت عليه لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات. والمرفق الذي أجري فيه هذا البحث معتمد من قبل جمعية تقييم واعتماد المختبرات لرعاية الحيوان، الدولية، ويلتزم بالمبادئ المنصوص عليها في دليل رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، المجلس الوطني للبحوث، 201124.

1. ثقافة وصيانة خط الخلية، RAW 264.7

ملاحظة: يجب إجراء الإجراءات التالية باستخدام تقنيات معقمة.

  1. سخني مصل الأبقار الجنينية (FBS) في حمام مائي 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتتكامل مع ذلك.
    ملاحظة: يبدأ وقت التعطيل 30 دقيقة عندما يصل FBS إلى 56 درجة مئوية. لرصد درجة الحرارة، تسخين حجم مماثل من الماء في منقار في حمام الماء نفسه. بمجرد أن يصل الماء إلى 56 درجة مئوية، ابدأ العد التنازلي لمدة 30 دقيقة لـ FBS. بدلا من ذلك، FBS التي تم تنشيط الحرارة هو أيضا متاحة تجاريا.
  2. إعداد المتوسطة لخام 264.7 الخلايا عن طريق الجمع بين 90٪ DMEM مع ارتفاع الجلوكوز والحرارة 10٪ FBS المعطلة (v / v). إضافة L-الجلوتامين إلى تركيز النهائي من 6 mM.
    ملاحظة: يتم صياغة DMEM مع ارتفاع الجلوكوز مع 4 M L-الجلوتامين. المكمل L-الجلوتامين إلى 6 mM يعزز نمو الخلايا متسقة. ويمكن إضافة 100 U/mL البنسلين و 100 ميكروغرام/مل ستريبتوميسين لمنع التلوث. ويمكن أيضاً استخدام خط خلية مورين آخر، هو J774A.1، ويزرع في ظروف مماثلة.
  3. ذوبان قارورة مجمدة من الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية وإزالة من الحمام بمجرد أن يذوب. إضافة محتويات aseptically إلى 5 مل المتوسطة كاملة في أنبوب مخروطي. عكس أنبوب مخروطي مرتين وتدور في 300 س ز لمدة 5 دقائق إلى بيليه الخلايا.
  4. متوسطة التعرق باستخدام الأنابيب معقمة باستور تعلق على فراغ لإزالة عامل التجميد. Resuspend خلية بيليه في 5 مل من المتوسطة الطازجة.
  5. نقل التعليق إلى زراعة الأنسجة المعالجة قارورة أو طبق. إضافة ما يكفي من المتوسطة لتغطية تماما الجزء السفلي من القارورة ودوامة لتوزيع الخلايا بالتساوي. الإشارة إلى رقم المرور بدءاً من "1".
  6. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2 والرطوبة حتى يتم التوصل إلى 95٪ إلى 100٪ التقاء. فحص الخلايا يوميا تحت المجهر ابتداء من اليوم الثاني من الحضانة. لا تسمح للخلايا للوصول إلى > 100٪ التقاء لأن هذا سوف يسبب الخلايا رفع ويموت.
    ملاحظة: يعتمد الوقت اللازم للوصول إلى التقاء على عدد الخلايا الحية مطلية ومنطقة النمو من قارورة. وبالتالي، فمن الحكمة للتحقق من الخلايا يوميا.
  7. خلايا الثقافة الفرعية عن طريق كشط وتمييع مخزون الخلية في وسط جديد مما يسمح لمدة يومين على الأقل من النمو بين كشط. زيادة عدد مرور بنسبة 1 مع كل ثقافة فرعية.
    ملاحظة: سوف يؤدي تمرير و كشط فوري في اليوم التالي إلى فقدان أسرع من الانضمام إلى الخلايا العامة بمرور الوقت. يجب أن يتم استخدام خلايا RAW 264.7 فقط حتى مرور تقريبا 15.
  8. لصفيح الخلايا الخام 264.7 لمقايسة OAA، استبدل بوسيلة جديدة واستخدم مكشطة الخلايا لكشط الخلايا برفق قبالة القارورة. الماصات صعودا وهبوطا لتفريق كتل الخلية لفرز الخلية أسهل.
    ملاحظة: الأسلوب التقليدي ل subcturing RAW 264.7 هو بواسطة كشط. في تجربتنا، واستخدام التربسين يسبب خلايا RAW 264.7 لتفقد الالتزام مع مرور الوقت أسرع من مع كشط.
  9. لحساب الخلايا، تمييع وحدات التخزين متساوية من الخلايا ومحلول trypan الأزرق. قم بتحميل 10 ميكرولتر على مقياس الهيموسيت. مراقبة وفرز عدد الخلايا الحية التي تستبعد الصبغة باستخدام مجهر مركب مقلوب مع عدسة الهدف 10x.
  10. لوحة 1.4 × 104 خلايا قابلة للحياة في بئر في 96 بئر 0.15 μm سميكة لوحة مسطحة القاع (لوحة #1). السماح للخلايا بالنمو لمدة 3 أيام. استبدال متوسطة قضى يوم واحد قبل تنفيذ OAA.
    ملاحظة: بعد 3 أيام من الحضانة، يجب أن يكون عدد الخلايا حوالي 5 × 104/well.

2. ثقافة البكتيريا والاستعدادات

ملاحظة: الأنواع البكتيرية المستخدمة في هذا البروتوكول هو سلالة ضراوة مغلفة، B. الجمرة الخبيثة أميس. وتتطلب جميع عمليات التلاعب بهذا النوع من الأنواع سلامة بيولوجية ملائمة وتصاريح أمنية، ويجب أن يتم تنفيذها في خزانة سلامة بيولوجية من الدرجة الثانية أو الدرجة الثالثة تقع في مختبر BSL-3. اتباع إجراءات التشغيل المؤسسية لعمل BSL-3 واستخدام معدات الحماية الشخصية عند التعامل مع البكتيريا.

  1. إعداد ضخ القلب الدماغ (BHI) مرق عن طريق حل 37 ز مسحوق BHI في 1 لتر الماء وoutoclaving في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تخزين مرق في درجة الحرارة المحيطة.
  2. إعداد 8٪ بيكربونات الصوديوم حل في الماء وتعقيم باستخدام حقنة مرشح 0.20 ميكرومتر. تخزين الحل في 4 درجة مئوية واستخدامها في غضون 1 يوم.
  3. مزيج 8 ز مرق المغذيات, 3 استخراج الخميرة 3 ز و 15 غرام أجار في 1 لتر الماء لإعداد لوحات أجار NBY. أوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. صب في أطباق بتري والسماح لترسيخ. لوحات تخزين في 4 °C.
    ملاحظة: يمكن صنع لوحات Agar NBY مع بيكربونات الصوديوم أو بدونه. إضافة بيكربونات الصوديوم إلى مرق وألواح أجار يحفز نمو مستعمرات mucoid تتكون من عصيات مغلفة. التركيز النهائي من بيكربونات الصوديوم في كل من وسائل الإعلام السائلة والصلبة هو 0.8٪.
  4. إعداد مرق الثقافة لB. الجمرة الخبيثة عن طريق خلط 50٪ مرق BHI autoclaved، 40٪ FBS و 10٪ محلول بيكربونات الصوديوم (v/v).
    ملاحظة: هذا المرق مصاغ لإنتاج سلاسل قصيرة من عصيات مغلفة.
  5. إعداد لوحة رئيسية من الجمرة الخبيثة B. عن طريق streaking عليه لعزله على لوحة أجار NBY من مخزون بوغ قبل يوم واحد من زراعة في مرق. احتضان عند 37 درجة مئوية.
  6. تلقيح 30 مل من مرق الثقافة في قارورة تنفيس 250 مل مع عدة مستعمرات من الجمرة الخبيثة B..
    ملاحظة: هناك حاجة إلى حجم معين إلى سطح نسبة المرق، كما هو محدد هنا، لإنتاج عصيات مغلفة إلى أقصى حد.
  7. هز ثقافة مرق في 125 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية مع 20٪ CO2 والرطوبة لمدة 18-24 ساعة.
    ملاحظة: قد يؤدي نمو مرض الجمرة الخبيثة B. في درجات حرارة أكبر من 37 درجة مئوية إلى منع إنتاج الكبسولة.
  8. استخدام التلطيخ السلبي مع حبر الهند لضمان تغليف كاف وأن العصيات في سلاسل قصيرة (1-5 عصيات /سلسلة) قبل التثبيت (انظر القسم 3).
  9. لتحديد وحدات تشكيل مستعمرة (CFU)، تمييع تسلسليا 100 ميكرولتر من الثقافة 1:10 في الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS) حل وطبقة ثقافة التخفيف على الأغنام الدم لوحات أجار. احتضان لمدة 12-18 ساعة عند 37 درجة مئوية. عد CFUs وتحديد عدد البكتيريا لكل مل من الثقافة.
    ملاحظة: يمكن أيضًا إجراء العد باستخدام مقياس الهيموسيت تحت المجهر بمجرد إصلاح البكتيريا. ومع ذلك، لا ينصح هذا لأن العصيات من الصعب أن نرى تحت التكبير منخفضة.
  10. إضافة 16٪ شبهformaldehyde (PF) إلى كامل حجم الثقافة البكتيرية في تركيز نهائي من 4٪ PF لإصلاح العصيات. تهيج ببطء على شاكر في درجة الحرارة المحيطة لمدة 7 أيام.
    ملاحظة: تستند سبعة أيام من الحضانة في PF 4٪ على إجراءات التشغيل المؤسسية الموحدة USAMRIID لتحديد عصيات الخضرية.
  11. لإزالة التثبيت واختبار للعقم، ثلاث مرات غسل 4 مل (10٪ حجم) من تعليق البكتيرية الثابتة في أنبوب مخروطي 50 مل عن طريق الطرد المركزي في ≥3000 س ز لمدة 45 دقيقة واستخدام 30 مل / غسل مع برنامج تلفزيوني. تخزين العينة المتبقية في 4٪ PF عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد الكريات، بيليه البكتيرية هو رقيق بسبب وجود كبسولة. الحرص على عدم إزعاج بيليه أثناء الغسيل. من الضروري إزالة كل المثبت بحيث لا تتداخل مع اختبار الجدوى. إذا لزم الأمر، وزيادة عدد من يغسل.
  12. لاختبار الجدوى، تلقيح 40 مل من متوسط النمو البكتيري (مثل مرق BHI) مع 4 مل من التعليق المغسول (≤ 10٪ من حجم المرق) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. تحقق من الكثافة البصرية في 600 نانومتر قبل وبعد 7 أيام لقياس العكر.
  13. بعد 7 أيام من الحضانة في ثقافة المرق، لوحة ≥100 ميكرولتر من مرق على لوحة أجار واحتضان لمدة 7 أيام أخرى. إذا لم يتم رؤية أي زيادة في التعكر ولا نمو على الألواح ، فإن الثقافة الأصلية تعتبر معقمة ويمكن نقلها إلى مختبر BSL-2.
    ملاحظة: إن برنامج وكيل الاختيار الفيدرالي22 الذي يبطل إبطاله لا يمكن نقل مرض الجمرة الخبيثة من مختبرات BSL-3 إلا بعد إثبات العقم الكامل للعينة. اختبار قابلية البقاء لB. الجمرة الخبيثة المعطلة يتكون من زراعة 10٪ من العينة في مرق لمدة 7 أيام تليها زراعة على وسيط الصلبة لآخر 7 أيام22،23. اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية للحصول على موافقة التحويل بمجرد إثبات العقم.

3. تلطيخ السلبي والمجهر الخفيفة لمراقبة التغليف وسلاسل العصيات

  1. مزيج 5 μL تعليق البكتيرية مع 2 ميكرولتر من الهند الحبر على شريحة المجهر. ضع 1 أو 1.5 ميكرومتر سميكة غطاء الزجاج على رأس التعليق دون خلق فقاعات.
    ملاحظة: يمكن استخدام طلاء الأظافر لختم الزجاج غطاء على الشريحة.
  2. مراقبة تعليق البكتيرية باستخدام 40x إلى 100x عدسة هدف النفط على المجهر الخفيف. تأكد من تغليف العصيات من خلال مراقبة منطقة إزالة (كبسولة يستبعد الحبر الهند) المحيطة كل بكتيريا وأن سلاسل العصيات قصيرة.

4. FITC - وضع العلامات من البكتيريا

  1. قم بذوبان الفلوريسين متساوي التحلل (FITC) في سلفوكسيد ثنائي الميثيل بتركيز 2 ملغ/مل.
  2. قياس حجم المخزون البكتيري المعطل.
  3. غسل الأسهم 3X في برنامج تلفزيوني لإزالة المثبت.
  4. أضف محلول FITC بتركيز نهائي 75 ميكروغرام/مل. تهيج ببطء خليط لمدة 18-24 ساعة في 4 درجة مئوية.
  5. ثلاث مرات غسل البكتيريا عن طريق بيليه في ≥3000 س ز, 45 دقيقة واستخدام 30 مل PBS / غسل لإزالة الزائدة FITC. تأكد من عدم إزعاج الكريه المنفوش أثناء الغسيل. إعادة تعليق العصية في برنامج تلفزيوني في نفس حجم البداية.
  6. Aliquot وتخزين العصيات في microtubes في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تجميد / ذوبان عصيات عدة مرات كما قد عصيات تفقد كبسولة.

5. البكتيريا Opsonization

  1. الحرارة تعطيل حجم صغير من اختبار سيرا (من NHPs) في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في كتلة الحرارة.
  2. ذوبان وغسل البكتيريا التي تحمل علامة FITC مع برنامج تلفزيوني 2x عن طريق 15000 × ز لمدة 3-5 دقيقة. إعادة بناء في برنامج تلفزيوني في نفس حجم البداية.
  3. في 96 لوحة أسفل جولة جيدة (لوحة #2)، تخفيف تسلسلي اختبار سيرا في خلية المتوسطة. في آخر 96 لوحة أسفل جولة جيدة (لوحة #3)، إضافة 10 ميكرولتر من sera اختبار المخفف في كل بئر.
    ملاحظة: في كل لوحة، تم تضمين برنامج تلفزيوني العادي سيرا بدلا من sera اختبار مخففة والضوابط السلبية. اخترنا أيضا مصل اختبار واحد كتحكم إيجابي لتوليد منحنى قياسي لتطبيع جميع المقايسات القيام به في أيام مختلفة. تم اختيار مصل اختبار التحكم الإيجابي بشكل تعسفي لأنه كان وفيراً.
  4. لوحة #3، إضافة 10 ميكرولتر الطازجة أرنب الطفل المعاد تشكيلها.
    ملاحظة: مرة واحدة إعادة تشكيل, تجاهل ما تبقى من الأرانب الطفل تكملة; لا refreeze وذوبان.
  5. لوحة #3، إضافة الحجم المناسب من عصيات تحت مسمى FITC لتعدد العدوى من 1:20. على سبيل المثال، إضافة وحدة التخزين التي تحتوي على 5 × 104 × 20 عصيات ل5 × 104 خلايا. أعلى قبالة كل بئر في لوحة #3 مع حجم مناسب من متوسطة الخلية إلى مجموع 105 μL.
    ملاحظة: لوحة #1، الذي يحتوي على خلايا، يتلقى 100 ميكرولتر من البكتيريا opsonized مع 5 ميكرولتر المتبقية كحجم الفراغ. اختبرنا كل تخفيف من sera اختبار في مكررة.
  6. #3 لوحة احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في وجود 5٪ CO2 مع الرطوبة لopsonize عصيات.

6. الالتزام بالتقييس والفلورسنت وضع العلامات من خلايا الثدييات

  1. الحفاظ على جميع الكواشف في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  2. ضع لوحة #1، والتي تحتوي على الخلايا المنضمة، على كتلة حرارية 37 °C.
  3. استخدام pipettor متعدد القنوات لإزالة المتوسطة المستهلكة من الآبار واستبدالها بسرعة مع 100 ميكرولتر من البكتيريا opsonized من لوحة #3. ضمان لم يتم إنشاء فقاعات في الآبار أثناء الأنابيب. #1 في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والرطوبة لمدة 30 دقيقة للانضمام.
  4. غسل كل 5x جيدا مع 150 μL PBS على رأس كتلة حرارية 37 درجة مئوية لإزالة عصيات غير مرتبط.
    ملاحظة: يجب الحرص على ضمان عدم تفريق الخلايا عن طريق الخطأ أثناء الغسيل.
  5. تمييع 16٪ PF مع برنامج تلفزيوني 1:4 لجعل 4٪ PF. الخلايا في الإصلاح مع 4٪ PF ل 1 ساعة عن طريق إضافة 150 ميكرولتر إلى كل بئر. غسل الخلايا 2X مع برنامج تلفزيوني.
  6. مزيج 2 μL HCS (عالية المحتوى فحص) أورانج خلية وصمة عار في 10 مل PBS. أضف 150 ميكرولتر من محلول التلطيخ هذا إلى الخلايا الثابتة وحضن لمدة 30 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة.
  7. غسل الآبار 2X مع برنامج تلفزيوني.
  8. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجة مئوية حتى المجهر.

7. المجهر

ملاحظة: بشكل عام، سيسهل مجهر الفلورسينس الآلي عالي الإنتاجية التصوير لـ OAA. إذا كان نظام الآلي غير متوفر، يمكن التقاط الصور الفلورية من عصيات الملتزمة يدويا21. في هذه الدراسة20، تم تصوير عصيات والخلايا monolayers باستخدام نظام المسح المجهري بالليزر زيس 700 مع معدات متخصصة؛ وكان نظامنا يتألف من زيسيس اكسيو المراقب Z1 المجهر المقلوب مجهزة مرحلة مؤتمتة، وحدة التركيز المحدد، 40 × نا 0.6 الهدف، أكسيو كام HRc الكاميرا و زن 2012 (الطبعة الزرقاء) البرمجيات. الصور التي تم الحصول عليها هي صور واسعة ، وليس صورًا confocal. ويهدف البروتوكول التالي إلى إعداد المجهر الأساسي الذي ينطبق على مجموعة متنوعة من أنظمة المجهر الآلي.

  1. #1 لوحة احتضان في درجة الحرارة المحيطة لمدة 30 دقيقة. قم بتشغيل المجهر والمعدات ذات الصلة.
    ملاحظة: إن التكاثّف في درجة الحرارة المحيطة يمنع التكثيف من التشكل على اللوحة الزجاجية أثناء التصوير. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يمنع إلغاء التوافر بسبب تحول درجة الحرارة.
  2. ضع لوحة على خشبة المسرح والتركيز على الخلايا باستخدام حقل مشرق أو النقيض المرحلة.
  3. حدد 96 شكل جيدا كما إعداد لوحة. حدد إعدادات القناة.
    ملاحظة: ذروة الإثارة والطول الموجي للانبعاثات في المؤسسة هي 495/519 نانومتر؛ HCS وصمة عار خلية برتقالية هي 556 و 572 نانومتر. ويمكن استخدام الفلوروفورات الأخرى اعتمادا على المرشحات المتوفرة على المجهر.
  4. حدد الإعداد إلى وضع التجانب. حدد عدد الصور التي سيتم الحصول عليها.
    ملاحظة: تسمح وظيفة التجانب بالتقاط مواقع متعددة في عينة جيدة ويمكن تعيينها للحصول على صورة في تجانب أو تنسيق عشوائي. صورنا 10 مناطق عشوائية في البئر.
  5. تغيير وضع الاكتساب إلى "أسود و أبيض" أو "أحادية اللون" وbinning ≥ 2x2.
    ملاحظة: إن تعيين الـ binning من 1x1 إلى 2x2 أو 4x4 سيزيد من سرعة المجهر ولكنه سيؤدي أيضًا إلى انخفاض دقة الصورة. بالنسبة لـ OAA ، يكفي استخدام هذه الإعدادات حيث يعدد الفحص كلاً من الضامة والبكتيريا المتصونة.
  6. قم بتشغيل وحدة التركيز البؤري التلقائي أو التركيز البؤري. قم بالإشارة إلى عدد مرات إجراء وظيفة ضبط تلقائي للصورة. قم بتشغيل دالة مكدس Z، إذا كانت متوفرة. الإشارة إلى عدد من رصات Z التي سوف التقاط سمك الخلية monolayer وعصيات المتمسك.
    ملاحظة: عدد مكدسات Z المختارة سيزيد من وقت المجهر ولكن سيضمن التقاط صورة مع التركيز الصحيح في كل مكدس Z.
  7. تعيين مجلد ملف لحفظ الصور إليه. تشغيل برنامج التصوير التلقائي.

8- جمع البيانات وتحليلها

  1. عد عدد من عصيات والخلايا الثدييات المتمسكة في الصورة. عد كل سلسلة من عصيات كبكتيريا واحدة.
  2. رسم عصيات / خلايا اختبار اختبار إيجابي المصل و titer (على سبيل المثال ، 1:10 تخفيف هو 10 وحدات تيتر) لتوليد منحنى قياسي في برنامج الإحصاءات المناسبة.
  3. تحليل مصل اختبار التحكم الإيجابي باستخدام منحنى الانحدار غير الخطي المناسب. ثم تحليل العينات المتبقية باستخدام منحنى معيار مصل اختبار اختبار التحكم الإيجابي لتحديد الاترات المقابلة.
    ملاحظة: عادة ما يكون اختيار العينة التخفيف بالقرب من منتصف المنحنى القياسي عند تحديد الاترات أكثر دقة.
  4. حساب الوسط الهندسي للعينات من كل مجموعة لقاح. حساب قيم P- من الجذوع المحولة سجل بواسطة تحليل ANOVA الفرق الأقل أهمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يُظهر هذا القسم ميكروجرافات تمثيلية تم جمعها أثناء تجربة OAA إلى جانب النتائج التي تبين أنه يمكن استخدام ا أ أ في فحص الوظيفة البيولوجية للأجسام المضادة. هنا، تم استخدام الفحص بنجاح لتقييم فعالية مرشح لقاح الجمرة الخبيثة. من المهم التحقق من حالة التغليف على العصية لأن القليل أو لا التغليف يسبب لهم التمسك الخلايا المضيفة، مما ينتج عنه خلفية عالية. الشكل 1 هو صورة لـ B. ANTHRACIs Ames ملطخة بشكل سلبي بحبر الهند لفحص التغليف. يتطلب OAA العديد من حقول الرؤية المجاورة لتكون مضيئة وإذا تم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد ثبت أن اللقاحات القائمة على كبسولة تكون فعالة ضد العديد من مسببات الأمراض البكتيرية، والعديد منها مرخص للاستخدام في البشر25،26،27. تعمل هذه اللقاحات عن طريق توليد الأجسام المضادة التي تستهدف الكبسولة والعديد من هذه الدراسات تستخدم OPKA لإظهار وظائف opsono-phagocytic للأجسام المضادة13،14،16،28،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ولا يملك أصحاب البلاغ رابطة تجارية أو غيرها من الجمعيات التي قد تشكل تضارباً في المصالح.

شكر وتقدير

وقد صمم ج. تشوا و د. شابوت وأ. فريدلاندر الإجراءات الموصوفة في المخطوطة. وقد أجرى ج. تشوا وت. بوتمون - تايلور التجارب. دال- أجرى شابوت تحليل البيانات. ج. تشوا كتب المخطوطة.

يشكر المؤلفون كايل ج. فيت على المساعدة التقنية الممتازة.

وقد دعم هذا العمل منحة وكالة الحد من التهديدات الدفاعية. VAXBT.03.10.RD.015، رقم الخطة 921175.

الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلفين ولا يؤيدها بالضرورة الجيش الأمريكي. لا يعكس محتوى هذا المنشور بالضرورة وجهات نظر أو سياسات وزارة الدفاع، كما لا يعني ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية أو المنظمات تأييدًا من قبل حكومة الولايات المتحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.20 وميكرو ؛ مرشح حقنة m (25 مم ، السليلوز المتجدد)Corning ، Corning ، NY431222
حقنة 10 مل (طرف Luer-Lok)BD ، Franklin Lakes ، NJ302995
15 & micro ؛ 96 لوحة سوداء جيدا (لوحة # 1 للتصوير)في المختبر Scientific ، Sunnyvale ، CAP96-1-N
16٪ علم المجهر الإلكتروني بارافورمالديهايد، هاتفيلد ، بنسلفانيا15710
75 سم مربع قارورة معالجة بزراعة الأنسجةكورنينج ، كورنينج ، نيويورك430641
أجار (مسحوق)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريA1296
Baby Rabbit ComplementCedarlane Labs ، Burlington ، NCCL3441
مستخلص خميرة باكتوBD ، سباركس ، MD288620
BBL تسريب قلب الدماغ (BHI)BD ، سباركس ، دكتوراه فيالطب 211059
Blood Agar (TSA مع دم الأغنام)Remel ، Lenexa ، KSR01198
مكشطة الخليةSarstedt ، نيوتن ، نورث كارولاينا83.183
Costar 96 لوحات زراعة خلايا البئر (الألواح # 2 و 3 للتخفيفات)Corning ، Corning ، NY3596
غطاء زجاجيعلوم المجهر الإلكتروني ، هاتفيلد ، بنسلفانيا72200-10
مرق المغذيات DifcoBD ، سباركس ، MD234000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، ارتفاع نسبة الجلوكوزGibco ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MA11965-092يحتوي على 4500 مجم / لتر من الجلوكوز ، 4 ملي مولار L-glutamine ، نظام التصوير التلقائي للخلايا الفينول الأحمر
EVOS FL (المجهر الفلوري) LifeTechnologies ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAAMAFD1000
مصلالأبقار الجنينيةHyclone ، GE Healthcare Life Sciences ، جنوب لوجان ، يوتاSH30071.03غير مشع بالحرارة ، وليس معطل بالحرارة
الفلورسين إيزوثيوسياناتInvitrogen ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAF143
HCS قناع الخلية Orange Cell StainInvitrogen ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham ، MAH32713
مقياس الدم (Enhanced Neubauer)Hausser Scientific ، Horsham ، PA3900
حل الحبر الهنديBD ، Sparks ، MD261194
L- الجلوتامين (200 ملم)Gibco ، Thermo Fisher Scientific ، Waltham MA25030081وسيط مكمل مع 2 ملي مولار L-glutamine
نيكون Eclipse TE2000-U (مجهر مركب مقلوب)نيكون إنسترومنتس ، ميلفيل ، نيويوركTE2000
PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوملونزا ، ووكرزفيل ، دكتوراه في الطب17-516F
، 100xHyclone ، GE Healthcare Life Sciences ، جنوب لوجان ، يوتاSV30010
أطباق بتري (100 × 15 مم)فالكون ، كورنينج ، دورهام ، نورث كارولاينا351029لألواح أجار خط
خلايا البلاعم الخام 264.7 (Tib47)ATCC ، ماناساس ، VAATCC TIB-71
SlidesVWR ، Radnor ، PA16004-422
بيكربونات الصوديومسيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريS5761
محلول تريبان الأزرق (0.4٪)سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوريT8154
Zeiss 700 المجهر الضوئي بالليزر (مجهر متحد البؤر) كارلزايس التصوير المجهري ، ثورنود ، نيويورك4109001865956000
لوحات محلول البنسلين والستربتومايسين

المراجع

  1. Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
  2. Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144(1883).
  3. Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
  4. Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  5. Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
  7. Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
  8. Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
  9. Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
  10. Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
  11. Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
  12. Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
  13. Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
  14. Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
  15. Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
  16. Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
  17. List of Tier 1 BSAT. , Available from: www.selectagents.gov/ohp-app1.html (2017).
  18. Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
  19. Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
  20. Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
  21. Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
  22. Revised FSAP Policy Statement: Inactivated Bacillus anthracis and Bacillus cereus Biovar anthracis. , Available from: www.selectagents.gov/policystatement_bacillus.html (2017).
  23. Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
  24. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition). , Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
  25. Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, Suppl 1 1-9 (2013).
  26. Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
  27. Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
  28. Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
  29. Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400(2019).
  30. Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250(1999).
  31. Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
  32. Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
  33. Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
  34. Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
  35. Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
  36. Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
  37. Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
  38. Wolf, J. J. Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , Elsevier. 243-255 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RAW 264 7 FITC
Opsono- الالتزام بـ اختبار لتقييم الأجسام المضادة الوظيفية في تطوير اللقاح ضد عصيات الجمرة الخبيثة وغيرها من مسببات الأمراض المغلفة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.