مقالة منهجية

بسيطة خالية من الطباعة الحجرية خلية واحدة Micropatterning باستخدام الليزر قطع الإستنسل

DOI:

10.3791/60888

⸱

أبريل 3, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University, 3Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 4Department of Medicine III, University Hospital Heidelberg, 5German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Heidelberg/Mannheim

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة micropatterning خالية من الطباعة الحجرية بسيطة ومتاحة لأولئك الذين يتمتعون بخلفية محدودة في الهندسة الحيوية. تستخدم هذه الطريقة الإستنسل اتّقص بالليزر حسب الطلب لبروتينات مصفوفة خارج الخلية في شكل اهتمام بتحوير الخلايا المورفولوجيا. يتم إثبات إجراء micropatterning باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من خلايا القلب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدمت تقنيات micropatterning على نطاق واسع في بيولوجيا الخلايا لدراسة آثار السيطرة على شكل الخلية وحجمها على تحديد مصير الخلية في قرار الخلية الواحدة. تتضمن تقنيات الأنماط الدقيقة الحالية للخلية الواحدة الطباعة الحجرية اللينة والطباعة على التلامس الدقيق ، وهي تقنية قوية ، ولكنها تتطلب مهارات هندسية مدربة ودعم مرافق معينة في التصنيع الدقيق. وتتطلب هذه القيود تقنية أيسر منالا. هنا، نحن نصف طريقة بديلة بسيطة خالية من الطباعة الحجرية: الأنماط خلية واحدة على أساس الاستنسل. نحن نقدم إجراءات خطوة بخطوة بما في ذلك تصميم الاستنسل، وتصنيع الهيدروجيل البولياكريلاميد، ودمج البروتين القائم على الاستنسل، وطلاء الخلايا والثقافة. يمكن استخدام هذه الطريقة البسيطة لنمط صفيف يصل إلى 2000 خلية. نحن نظهر نقش خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hiPSC) مع أشكال خلايا متميزة ، من 1:1 مربع إلى مستطيل يشبه القلب والقلب البالغ 7:1. هذا النقش خلية واحدة الاستنسل القائم هو خالية من الطباعة الحجرية، قوية من الناحية الفنية، مريحة، غير مكلفة، والأهم من ذلك في متناول أولئك الذين يعانون من خلفية الهندسة الحيوية محدودة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أدى ظهور hiPSCs وما يتبع ذلك من تطوير بروتوكولات للتمايز الموجه إلى أنواع مختلفة من الخلايا إلى جعل من الممكن دراسة التنمية والمرض على مستوى جزيئي وخاص بالمريض ، على وجه التحديد باستخدام خلايا القلب iPSC المشتقة من المريض (iPSC-CMs) لنموذج cardiomyopathies1،2. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على دراسة التنمية وعلم وظائف الأعضاء باستخدام نظام iPSC ونماذج أخرى في المختبر هو عدم وجود بيئة صغيرة منظمة. في الموقع ، تخضع الخلايا لقيود المصفوفة خارج الخلية (ECM) ، وكذلك الخلايا المجاورة. التركيب الكيميائي الحيوي الخاص وصلابة هذه البيئات الدقيقة تملي التوزيع المكاني للخلايا وكذلك العوامل المتاحة للانخراط في التصاق الخلايا. وهذا بدوره يؤثر على مسارات الإشارات داخل الخلايا، والتعبير الجيني، وتحديد مصير الخلايا. على سبيل المثال، iPSC-CM ذات الأنماط الدقيقة في شكل قضيب يشبه البالغين لديه قدرة انكماش أفضل بكثير، وتدفق الكالسيوم، وتنظيم الميتوكوندريا، والفيزيولوجيا الكهربائية، وتشكيل أنبوب عرضي3. وبالتالي ، فإن خصائص البيئة الدقيقة هي جزء لا يتجزأ من تنظيم الوظائف الخلوية.

تقنيات micropatterning السابقة تعتمد اعتمادا كبيرا على الطباعة الضوئية(الشكل 1A). في هذه التقنية ، يتم نسج طبقة من البوليمر الحساس للضوء ، أو مقاومة للضوء ، على ركيزة مسطحة من الحل لتشكيل فيلم رقيق يبلغ سمكه حوالي 1 ميكرومتر. بعد ذلك ، يتم تطبيق الأشعة فوق البنفسجية (UV) على مقاومة الصور من خلال قناع يحتوي على النمط المطلوب. التعرض للأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) ضوء يغير كيميائيا مقاومة للضوء عن طريق تعديل ذوبانها في حل المطور الخاص بها، ونقل النمط المطلوب من القناع على الركيزة. تتضمن العديد من أساليب الأنماط الدقيقة الطباعة الضوئية ، لأنها تمنح النانومتر للتحكم على مستوى الميكرومتر في تصميم أنماط الخلية. ومع ذلك ، فإن الغزل من مقاومة الصور حساسة للغاية للشوائب ، لأن أصغر جزيئات الغبار سوف تعطل انتشار الحل في فيلم رقيقة. ولذلك يجب إجراء التصوير الضوئي في مرافق غير ملوثة، وهي مرافق مكلفة للصيانة وتتطلب خبرة خاصة للاستفادة منها. وبالإضافة إلى ذلك، فإن المواد الكيميائية المستخدمة في التصوير الضوئي غالبا ما تكون سامة للخلايا ويمكن أن تشوه الجزيئات الحيوية الهامة. وبالتالي، فإن الطباعة الضوئية تشكل عقبات كبيرة أمام تصنيع الأنماط الدقيقة للتطبيقات البيولوجية المريحة.

في عام 1994، تغلب وايتسايدس وزملاؤهاما 4 على بعض التحديات المرتبطة بالطباعة الضوئية من خلال ريادة مجموعة من التقنيات تسمى الطباعة الحجرية الناعمة. في الطباعة الحجرية الناعمة ، يتم استخدام سطح صغير الحجم مصنوع من البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) ، وهو مادة شفافة تشبه المطاط ، لتوليد نمط من بروتينات ECM4. وتشمل التقنيات الطباعة الحجرية الناعمة الشائعة طباعة الاتصال الدقيق والنقش الميكرووتوني. في الطباعة microcontact، حاليا الطريقة الحجرية الناعمة الأكثر شعبية، ختم PDMS المغلفة مع بروتينات ECM ينقل المواد على سطح في المناطق التي اتصل بها الطابع(الشكل 1B). في الأنماط الدقيقة، تم تصميم الهياكل الدقيقة على سطح PDMS بحيث عندما يتم الضغط على الطابع إلى الركيزة، يتم إنشاء شبكة من القنوات الدقيقة، التي يمكن من خلالها تسليم السوائل إلى المناطق المطلوبة،(الشكل 1C)5. يوفر الطباعة الحجرية الناعمة العديد من الفوائد على الطباعة الضوئية. بمجرد أن يتم تصنيع رقاقة رئيسية ، يمكن بسهولة تكرار طوابع PDMS دون مزيد من التوظيف لمرافق الغرف النظيفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود مذيبات عضوية في عملية الطباعة الحجرية الناعمة يسمح باستخدام المواد البوليمرية مثل البوليسترين ، التي تستخدم عادة في زراعة الخلايا. وأخيراً، لا يقتصر النقش المجهري باستخدام أساليب الطباعة الحجرية الناعمة على الأسطح المسطحة. وبالتالي ، يزيد الطباعة الحجرية الناعمة من إمكانية الوصول إلى تصنيع النماذج الدقيقة ووظائفها على الطباعة الضوئية6. ومع ذلك، الطباعة الحجرية الناعمة لها عيوب كبيرة. على سبيل المثال، لا تزال هناك حاجة إلى خطوة النقش الأولية، باستخدام الطباعة الضوئية، لتلفيق الطابع. بالإضافة إلى ذلك ، يخضع النقش المجهري باستخدام طابع PDMS لاختلافات في جودة نقل البروتين إلى الركيزة6. تجنب هذه التناقضات يتطلب التحسين والاتساق في الضغط المطبق على ختم PDMS أثناء نقل البروتين ، وإلا يمكن أن يحدث تشوه وتشويه أحجام الميزات لقوالب PDMS6. هناك أيضا قلق كبير من استخدام PDMS بشكل متكرر بسبب امتصاص جزيء صغير7.

لتجنب استخدام الطباعة الضوئية الناعمة وطوابع PDMS ، نصف طريقة micropatterning خلية واحدة قائمة على الاستنسل ، خالية من الطباعة الحجرية التي تتغلب على العديد من العقبات المرتبطة بالطباعة الضوئية والطباعة الحجرية اللينة. في هذه الطريقة، يتم استخدام هيدروجيل البولياكريلاميد كركيزة لدمج بروتين ECM القائم على الاستنسل، مما يسمح بالطلاء الانتقائي لـ hiPSC-CMs واحد. هذه التقنية متوافقة للغاية مع المواد البوليمرية المستخدمة في ظروف ثقافة الخلايا الكلاسيكية. وعلاوة على ذلك، مع التنظيف السليم والصيانة، والاستنسل قابلة لإعادة استخدام ومقاومة للتدهور وامتصاص البروتين أثناء عملية التصنيع المجهري. وأخيراً، فإن عملية الأنماط قوية تقنياً وغير مكلفة وقابلة للتخصيص ومتاحة لأولئك الذين ليس لديهم مهارات متخصصة في الهندسة الحيوية. وقد استخدمت هذه التقنية المجهرية الاستنسل القائم على نطاق واسع في منشوراتنا الأخيرة نمذجة أمراض القلب المتنوعة8،9،10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تلفيق من الأنماط السلبية البولي الاستنسل القائم

  1. إنشاء نمط(الشكل 2A)في تنسيق .dxf باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (على سبيل المثال، أوتوكاد، SolidWorks، Onshape، أدوبي المصور).
    1. إنشاء دائرة (قطر = 22 ملم) لترسيم حدود الاستنسل.
    2. رسم شكل مملوء بصلابة أو النمط المطلوب.
    3. تضمين حرف chiral (على سبيل المثال، R) لوضع علامة على الجانب الأمامي من الاستنسل.
      ملاحظة: على سبيل المثال، يتم إنشاء صفيف من المربعات والمستطيلات لنمط iPSC-CMs على مستويات خلية واحدة وزوج الخلية. تتوفر ملفات التصميم (انظر الملفات التكميلية). الحد الأقصى لقرار التصنيع المجهري هو ~ 10 ميكرومتر.
  2. تقديم التصميم إلى شركة microfabrication إلى ليزر قطع polyimide فيلم وتلفيق الإستنسل(الشكل 2B،C).

2- إعداد المستحضرات المنفوحة السلفو-سانباه

ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من فيشر وآخرون11.

  1. استخدام صندوق تخزين عينة من الورق المقوى المقاوم للرطوبة (على سبيل المثال، 100 بئر، 10 × 10 مساحات لأنابيب الطرد المركزي، الأبعاد: 13.4 سم × 13.4 سم × 5.1 سم). وسمها "الاسم/التاريخ/السلفو-سانباه 40 ميكرولتر/أعيد تشكيلها بـ 200 1 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني".
  2. تسمية 50 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (البولي بروبلين، 1.5 مل) مع 'S' على الغطاء.
  3. تأخذ 4 مل من اللامائية، إضافية الجافة ثنائي ميثيل السلفوك (DMSO) وفلتر معقم الحل باستخدام وحدة تصفية غشاء (حجم المسام = 0.22 ميكرومتر) في أنبوب مخروطي معقم 15 مل.
  4. إعداد حمام النيتروجين السائل وتغطية مع الغطاء للحد من تبخر النيتروجين السائل.
  5. حل 50 ملغ من السلفو-SANPAH في 2 مل من DMSO المصفاة.
  6. دوامة جيدا لإذابة تماما sulfo-SANPAH في DMSO.
  7. توزيع 40 μL aliquots من محلول السلفو-SANPAH في أنابيب معقمة 1.5 مل.
  8. نقل الأنابيب إلى مربع.
  9. فلاش تجميد الأنابيب في النيتروجين السائل لمدة 5 دقيقة.
  10. تخزين aliquots في -80 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام العليوات لمدة تصل إلى 6 أشهر دون انخفاض الكفاءة. تركيز السولفو-سانباه هو 25 ملغ/مل أو 50.77 مللي متر.

3- تعقيم الأدوات

  1. أوتوكلاف ملقطين، 24 غطاء زجاجي (22 × 22 ملم، رقم 1 أو رقم 1.5)، شفرة حلاقة واحدة، وثلاثة مناديل ماصة خالية من الوبر.
    ملاحظة: لجعل 12 الهيدروجيل بنيات، هناك حاجة إلى 24 coverslips الزجاج. يجب أن يكون هناك اثنين من coverslips لكل بناء. من المستحسن إعداد بعض قسائم التغطية الاحتياطية.
  2. ضع قطعتين من فيلم البارافين (4 × 4 بوصة) في صندوق بلاستيكي مقاوم للإيثانول (على سبيل المثال، صندوق تلميح ماصة 1000 ميكرولتر) وتعقيمهما في الإيثانول الطازج بنسبة 70٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل.

4. إعداد محلول السلائف الهيدروجيل البولياكريلاميد

ملاحظة: يتم تعديل البروتوكول من Lee وآخرون12.

  1. حل 125 ملغ من أمينوثيل ميثاكريلات (AEM) في 36.25 مل من الماء المنزوع الأيونات في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 50 مل عن طريق الدوامة.
  2. لإعداد 50 مل من محلول سلائف البولي اكريلاميد 10 كيلو باسكال (8-0.15-15 mM)، اخلط يُمُمل 10 مل من محلول الأكريلاميد بنسبة 40%، و3.75 مل من محلول bis-acrylamide، و36.25 مل من محلول AEM الذي تم إعداده في الخطوة 4.1 في أنبوب طرد مركزي جديد بـ 50 مل بولي بروبلين.
    ملاحظة: التركيز النهائي لحل السلائف هو 8٪ الأكريلاميد، 0.15٪ مكررا-الأكريلاميد، و 15 mM AEM، والتي تم قياسها لديها ~ 10 كيلو باسكال تصلب عن طريق المجهر القوة الذرية. وفقا لتطبيقات الأنسجة ذات الاهتمام، يمكن تغيير صلابة الهيدروجيل عن طريق تغيير نسبة الأكريلاميد 40٪ إلى محلول 2٪ مكرر الأكريلاميد. على سبيل المثال، 8% الأكريلاميد–0.08% محلول bis-acrylamide ينتج 3 كيلو باسكال هيدروجيلات; 8% الأكريلاميد–0.48% محلول بيس-أكريلاميد ينتج 38 كيلو باسكال هيدروجيل؛ 8% الأكريلاميد–0.48% محلول بيس-أكريلاميد ينتج 60 كيلو باسكال هيدروجيل. فمن المستحسن لتأكيد صلابة الهيدروجيل المصنوعة من حلول السلائف مع معدلات متغيرة.

5. إعداد حل البادئ الضوئي

  1. ل1 مل من 5٪ حل البادئ الضوئي، أولا حل 50 ملغ من 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكسي)-2-مسحوق ميثيل بروبيوفينونون في 700 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 1.5 مل مع غطاء.
    ملاحظة: 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكي)-2-ميثيل بروبيوفينونون غير قابل للذوبان في الماء. تأكد من حل المسحوق بالكامل في الإيثانول عن طريق الدوامة.
  2. بعد حل كامل 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكي)-2-ميثيلبروبيوفينون في الإيثانول عن طريق الدوامة، إضافة 300 ميكرولتر من المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS) لحجم النهائي من 1 مل.
    ملاحظة: التركيز النهائي من 2-هيدروكسي-4'-(2-هيدروكسيتوكسي)-2-ميثيلبروبيوفينون حل هو 5٪. احباط 5٪ حل photoinitiator جيدة لمدة 4 أسابيع في 4 درجة مئوية.

6. إعداد غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة

ملاحظة: مصفوفة غشاء الطابق السفلي(جدول المواد)هي مادة حساسة لدرجة الحرارة. تأكد من العمل على الجليد مع نصائح الأنابيب المبردة وأنابيب فضلا عن حلول الجليد الباردة. وينبغي إذابة مخزون جديد من مصفوفة غشاء الطابق السفلي ببطء على الجليد في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.

  1. إعداد 200 ميكرولتر من محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي لكل بناء هيدروجيل. ل12 يبني، وهناك حاجة إلى 2.4 مل من غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة. إعداد حل إضافي بنسبة 10٪ (على سبيل المثال، 2.6 مل).
  2. لكل دفعة جديدة / الكثير من محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي ، قم بتحسين نسبة التخفيف. لأول مرة، اختبار نسب تخفيف من 1:10، 1:20، 1:40 للعثور على نسبة التخفيف التي تسفر عن أفضل الصفات لنقش الخلية.
    ملاحظة: إذا كان محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي لزجًا جدًا ، فسيشكل هلامًا أعلى الاستنسل ، ومن المرجح أن يقشر عند إزالة الاستنسل. إذا كان محلول البروتين سائلًا جدًا ، فسوف يخترق ثقوب النمط في الاستنسل ، مما سيؤدي إلى أنماط ذات جودة رديئة.
  3. تمييع غشاء السرداب غشاء مصفوفة بروتين محلول المخزون على الجليد مع الجليد الباردة Dulbecco في جلف تعديل المتوسطة / المغذيات خليط F-12 (DMEM/F12) وسائل الإعلام أو 1x PBS إلى نسبة التخفيف الأمثل أعلاه. على سبيل المثال، تمييع 120 ميكرولتر من محلول المخزون في 2.4 مل من وسائط DMEM/F12 (1:20) والحفاظ على الجليد للاستخدام في وقت لاحق.

7- تصنيع هيدروجيل

  1. ضع مصباح ًا على مقاعد البدلاء للأشعة فوق البنفسجية (365 نانومترًا ، 4 mW / cm2)في غطاء أمان بيولوجي.
  2. ضع أفلام البارافين المعقمة من الخطوة 3.2 وتجف تمامًا في ظل ظروف معقمة. إذا لم تكن أفلام البارافين جافة تمامًا ، فاستخدم نظام ًا للشفط للفراغ لإزالة أي سائل متبقي. ضع ستة قسائم تغطية أوتوكلاف من الخطوة 3.1 على كل فيلم من أفلام البارافين باستخدام ملقط الأوتوكلاف.
  3. إعداد الأشعة فوق البنفسجية crosslinkable محلول سلائف البولياكريلاميد عن طريق تخفيف 5٪ حل البادئ الضوئي (الخطوة 5.2) مع محلول سلائف البولياكريلاميد (الخطوة 4.2) في أنبوب الطرد المركزي البولي بروبلين 50 مل. ل5 مل من الأشعة فوق البنفسجية عبر لينكحل محلول السلائف البولياكريلاميد، إضافة 50 ميكرولتر من 5٪ حل البادئ الضوئي إلى 5 مل من محلول السلائف البولياكريلاميد.
  4. تصفية محلول السلائف من الخطوة 7.3 باستخدام وحدة تصفية 50 مل مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر للتعقيم.
    ملاحظة: دائما إعداد حل السلائف الطازجة.
  5. الاستغناء عن 200 ميكرولتر من محلول سلائف البولياكريلاميد من الخطوة 7.4 على كل 22 × 22 مم زلة غطاء زجاجي في طبق البارافين تصويربيتري وتغطية بعناية مع آخر 22 × 22 ملم غطاء زجاجي على رأس شطيرة الحل في ما بين(الشكل 3A).
    ملاحظة: يتم استخدام فيلم البارافين لتجنب الانسكاب وحصر محلول السلائف بين قسائم التغطية.
  6. ضع طبق بيتري المحتوي على الغطاء من الخطوة 7.5 تحت مصباح مقاعد البدلاء للأشعة فوق البنفسجية وفوتوبوليمر الهيدروجيلات البولية للأشعة البولية للأشعة البولية للأشعة فوق البنفسجية لمدة 5 دقيقة(الشكل 3B).
    ملاحظة: إذا كان السطح غير أبيض، فإن امتصاص الأشعة فوق البنفسجية للسطح يقلل من كفاءة الربط الضوئي. تغطية ورقة بيضاء على سطح غير أبيض مهم للحد من فقدان كثافة الأشعة فوق البنفسجية. للحماية من الأشعة فوق البنفسجية، قم بتغطية المصباح برقائق الألومنيوم وارتداء نظارات واقية من الأشعة فوق البنفسجية.
  7. فصل بعناية غطاء واحد زلة قبالة من الآخر باستخدام شفرة حلاقة عن طريق الاستفادة من العمل(الشكل 3C).
    ملاحظة: الهيدروجيل عادة ما تتمسك الغطاء العلوي. إيلاء اهتمام إضافي عند فصل coverslip من الهيدروجيل لينة، لأنه من المرجح أن كسر.
  8. ملء خزان البولي بروبلين المتاح مع برنامج تلفزيوني. نقل مركبات الهيدروجيل الغطاء في خزان يحتوي على PBS لشطف الهيدروجيل في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة. بعد الرصانة، ضع الهيدروجيل بناء مرة أخرى على فيلم البارافين في طبق بيتري.

8- اقتران البروتين

  1. إعداد دلو الثلج وPBS بارد مسبقا.
    ملاحظة: بالنسبة لستة هيدروجيلات، هناك حاجة إلى 1200 ميكرولتر من PBS الباردة.
  2. إخراج العلية السلفو-SANPAH (1 قارورة = 6 المواد الهلامية).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن تقليل كمية السلفو-SANPAH المستخدمة بعد التحسين.
  3. إضافة 1200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة في قارورة من العلية السلفو-SANPAH وتخلط عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
  4. الاستغناء عن 200 ميكرولتر من السلفو-SANPAH على فيلم البارافين في طبق بيتري وتغطية مع مركب هلام الغطاء مع هيدروجيل الاتصال sulfo-SANPAH(الشكل 3D).
    ملاحظة: سولفو-سانباه هو عرضة جدا للمياه بسبب التحلل المائي. ذوبان الطازجة من -80 درجة مئوية الحق قبل الاستخدام. لا تقم بإعادة استخدام أو إعادة تجميد أي بقايا.
  5. فضح الهيدروجيل لمصباح الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر، 4 mW/cm2 لمدة 5 دقيقة لتنشيط sulfo-SANPAH.
    ملاحظة: بعد التعرض، سوف تتغير السلفو-SANPAH من البرتقالي إلى البني(الشكل 3E). إذا تحول الهيدروجيل إلى اللون البني ، فإنه يشير إلى التنشيط الناجح لمجموعة الأزيد الفينيل من sulfo-SANPAH ودمج sulfo-SANPAH على الهيدروجيل. المضي مباشرة في الخطوات 8.6-8.9 في حدود 10 دقيقة كحد أقصى، لأن نشاط السلفو-سانباه سينخفض.
  6. تجديد خزان البولي بروبلين القابل للتصرف مع برنامج تلفزيوني جديد. بعد تنشيط sulfo-SANPAH، قم بنقل الهيدروجيلات المنشطة وشطف الهيدروجيلبسرعة في خزان PBS لإزالة sulfo-SANPAH غير المنضمة.
    ملاحظة: يمكن أن يؤدي الغسيل الطويل إلى انخفاض كفاءة الاقتران بالبروتين.
  7. بعد شطف سريع، ضع قسائم التغطيات المرفقة بالهيدروجيل على فيلم البارافين في أطباق بيتري ومارس بعناية الهيدروجيل مع مناديل خالية من الوبر المعقم.
    ملاحظة: سوف PBS المتبقية على رأس هيدروجيل يؤدي إلى تسرب من غشاء الطابق السفلي حل البروتين مصفوفة من خلال الاستنسل، والتجفيف على نطاق واسع جدا سيؤدي إلى تمزق الهيدروجيل عند إزالة الاستنسل بسبب الالتزام عالية جدا إلى الاستنسل.
  8. وضع الاستنسل على رأس hydrogels والداب مع مناديل خالية من الوبر الأوتوكلاف لضمان ختم ضيق بين الاستنسل والهيدروجيل(الشكل 3F).
  9. الاستغناء بعناية 200 ميكرولتر من محلول البروتين مصفوفة غشاء القبو المخفف أعدت من الخطوة 6.3(الشكل 3G)على القمة. ترك بين عشية وضحاها في الحاضنة (37 درجة مئوية).
    ملاحظة: عندما يكون الاتصال الاستنسل هيدروجيل ضيقًا وتركيز محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي هو الأمثل ، سيتم عزل محلول بروتين مصفوفة غشاء الطابق السفلي والبقاء على رأس الاستنسل(الشكل 3H). يمكن تقليل وقت الحضانة عند التحسين. نظريا، يمكن تخفيضها إلى 30 دقيقة-2 ساعة.
  10. في اليوم التالي، نقل hydrogels إلى لوحة جيدة 6 وتزج تماما لهم في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: فمن المستحسن لتقشير قبالة الاستنسل مع الغمر PBS على coverslip لمنع تمزق والالتصاق من الهيدروجيل إلى الاستنسل.
  11. إزالة الاستنسل بعناية باستخدام ملاقط الأوتوكلاف دون تمزيق الهيدروجيل. إعادة تعليق جيدا مع DMEM، والعودة هيدروجيلات منقوشة إلى الحاضنة، وتركها بين عشية وضحاها لاختبار أي تلوث.
  12. إذا ظلت وسائل الإعلام واضحة، فإن الهيدروجيل جاهزة للاستخدام في طلاء الخلايا. تحسين كثافة طلاء الخلايا ووقت الحضانة للسماح التصاق الخلايا للتطبيقات المعنية.
    ملاحظة: لنقش خلية واحدة من hiPSC-CMs، البذور واحتضان بين عشية وضحاها. يوصى بأرقام الخلايا التالية للبذر: 30,000 و60,000 و90,000 خلية/بئر. البذر الكثير من الخلايا يؤدي إلى أكثر من خلية واحدة لكل نمط. يوصى بمصفاة الخلية لإجهاد الخلايا غير المفردة قبل بذر الخلايا.
  13. في اليوم التالي، لاحظ مرفق الخلايا وانتشارها، وتغيير وسائل الإعلام للتخلص من الخلايا المنفصلة.

9. تنظيف الاستنسل المستخدمة

  1. لإزالة بروتينات المصفوفة المتبقية على الاستنسل المستخدم ، قم بغمر الاستنسل في محلول الإنزيم(جدول المواد)لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب اختيار الإنزيم اعتمادًا على بروتينات المصفوفة المستخدمة. لبروتين مصفوفة الكولاجين الغنية حل، استخدام الكولاجين. ويوصى أيضا بالموجات فوق الصوتية 10-15 دقيقة في حل الإنزيم.
  2. يُستنشق الحل ويُجدد مع التبييض بنسبة 10%. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. شطف 3x مع برنامج تلفزيوني.
  4. تخزينها في الإيثانول 70٪ في 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ثبت تلفيق الاستنسل التي تحتوي على مجموعة من المربعات أو المستطيلات(الشكل 4A). بعد هذا البروتوكول، حصلنا على جزر بروتين مصفوفة منقوشة(الشكل 4B والشكل 5A)والخلايا(الشكل 4C). أدى تركيز محلول بروتين المصفوفة دون المستوى الأمثل إلى الأنماط دون المثلى(الشكل 5B). من الأهمية بمكان استخدام الجانب الأمامي من الاستنسل. إذا تم استخدام الجانب الخلفي من الاستنسل ، فإن حجم جزر بروتين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف طريقة النقش المجهري المستندة إلى الاستنسل الخالية من الطباعة الحجرية التي تمكن من الأنماط الفعالة للخلايا الملتصقة. في هذا البروتوكول، ونحن نظهر النقش من hiPSC-CMs في نسب مختلفة طول إلى العرض عن طريق micropatterning الطابق السفلي غشاء مصفوفة جزر البروتين على هيدروجيلات البولياكريلاميد مع تصلب الأنسجة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية أو المرضية أو ركائز الإيلاستير القائم على السيليكون. هذه الطريقة بسيطة نسبيا ومتاحة للغاية لأي باحث ، بما في ذلك أولئك الذين لديهم خلفية ضئيلة في تقنيات التصوير الضوئي والتصنيع المجهر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد ستانفورد لأبحاث صحة الطفل (CHRI) والمعهد الوطني للصحة (1F32HL142205-01) إلى S.L، جائزة رائد مكتب المعاهد القومية للصحة (LM012179-03)، وجمعية القلب الأمريكية جائزة المحقق (17EIA33410923)، ومعهد ستانفورد لأمراض القلب والأوعية الدموية، ومؤسسة هوفمان وشروبفر، وقسم ستانفورد لطب القلب والأوعية الدموية، قسم الطب إلى S.M.W ، جوائز من المعهد الوطني للصحة (UG3 TR002588، P01 HL141084، R01 HL126527، R01 HL113006، R01 HL123968) وبرنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ (TRDRP 27IR-0012) إلى J.C.W، وجمعية القلب الأمريكية (AHA) جائزة زمالة ما بعد الدكتوراه (18POST34030106) إلى H.Y، وزمالة هنغستبرجر إلى T.S. نشكر الدكتور أندرو أولسن من خدمة الفحص المجهري لعلم الأعصاب في ستانفورد على دعم التصوير البؤري لـ hiPSC-CM المنقوشة بالميكروها. نشكر H.Y. لتصميم الاستنسل الأول، والتصنيع، وmicropatterning خلية واحدة من iPSC-CM على polyacrylamide هيدروجيل المغلفة coverslip، والتصوير الأولي confocal من بنية ساركومير من خلية واحدة micropatterned iPSC-CMs.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2-أمينوإيثيل ميثاكريليت هيدروكلوريد (مسحوق)سيجما ألدريتش516155
محلول أكريلاميد 40٪ (محلول)سيجما ألدريتشA-4058-100 مل
مصباح مقعد للأشعة فوق البنفسجية 365 نانومترUVPUVP 95-0042-07 ، لوحة ثقافة XX-15L
BioFlexFLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION ، برلنغتون ، نورث كارولاينالوحة 6 آبار مع ركيزة مطاط أساط السيليكون
محلول ثنائي أكريلاميد 2٪ (محلول)Sigma-AldrichM1533-25mL
غطاء Corning مربع ، رقم 2 ، W & Times ؛ L 22 مم & مرات ؛ 22 ممSigmaCLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4 & prime ؛ - (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenone) (مسحوق)Sigma-Aldrich410896
MatrigelCorning356231محلول بروتين مصفوفة غشاء القاعدي
ميثيل سلفوكسيد ، 99.7 +٪ ، جاف للغاية ، AcroSeal ، ACROS OrganicsAcros Organics326881000
Millex (13 مم) فلتر وحدة مع غشاء DuraporeMilliporeSLGV013SL
Millipore 50 مل Steriflip (0.22 & micro; م)فيشر العلميSCGP00525
الإستنسلبوتوماكتصميم
Sulfo-SANPAHThermoFisher Scientific22589
TrypLE Select 10xThermoFisher ScientificA1217702Enzyme المستخدمة لتنظيف الاستنسل
زجاج مخصص

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
  3. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  4. Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
  5. Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
  6. Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
  7. Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
  8. Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  9. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  10. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  11. Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
  12. Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
  13. Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
  14. Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sulfo SANPAH hiPSC

مقالات ذات صلة