مقالة منهجية

تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية متعددة المكونات باستخدام اختبار حركية Kinesin المنزلق

DOI:

10.3791/60899

⸱

يوليو 26, 2021

 , 
1Center for Integrated Nanotechnologies, Sandia National Laboratories

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول عملية لتصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية باستخدام حركية كينيسين الانزلاقية بالتزامن مع الحويصلات الدهنية أحادية الصفيحة العملاقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل شبكات الأنابيب النانوية الدهنية (LNT) نظاما نموذجيا في المختبر لدراسة النقل الجزيئي والفيزياء الحيوية للدهون ذات الصلة بأنابيب الدهون الموجودة في كل مكان الموجودة في الخلايا حقيقية النواة. ومع ذلك ، في الجسم الحي LNTs هي هياكل غير متوازنة للغاية تتطلب طاقة كيميائية ومحركات جزيئية ليتم تجميعها وصيانتها وإعادة تنظيمها. علاوة على ذلك ، فإن تكوين LNTs في الجسم الحي معقد ، ويتألف من أنواع مختلفة من الدهون. الطرق النموذجية لبثق LNTs تتطلب وقتا طويلا وعمالة كثيفة ، وتتطلب ملاقط بصرية ، وبيدات دقيقة ، وماصات دقيقة لسحب الأنابيب النانوية بالقوة من حويصلات الدهون العملاقة. يظهر هنا بروتوكول لفحص حركية الانزلاق (GMA) ، حيث يتم إنشاء شبكات LNT واسعة النطاق بسرعة من حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) باستخدام حركية الأنابيب الدقيقة التي تعمل بالطاقة الكينيسينية. باستخدام هذه الطريقة ، يتم تشكيل شبكات LNT من مجموعة واسعة من تركيبات الدهون التي تحاكي تعقيد LNTs البيولوجية ، مما يجعلها مفيدة بشكل متزايد للدراسات في المختبر للفيزياء الحيوية للدهون والنقل المرتبط بالغشاء. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الطريقة قادرة على إنتاج شبكات LNT بشكل موثوق به في وقت قصير (<30 دقيقة) باستخدام معدات المختبرات شائعة الاستخدام. خصائص شبكة LNT مثل الطول والعرض وتقسيم الدهون قابلة للضبط أيضا عن طريق تغيير تكوين الدهون من GUVs المستخدمة لتصنيع الشبكات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إن تصنيع شبكات الأنابيب النانوية الدهنية (LNT) ذو أهمية متزايدة للفحص المختبري للهياكل الدهنية غير المتوازنة1،2،3. تستخدم الخلايا أنابيب الدهون للنقل المنتشر للبروتينات4 والأحماض النووية5 وكذلك الاتصال من خلية إلى خلية 6,7. تعتبر الشبكة الإندوبلازمية وجهاز غولجي مثيرة للاهتمام بشكل خاص ، حيث أن هذه العضيات المرتبطة بالغشاء هي المواقع الرئيسية لتخليق الدهون والبروتين وكذلك نقل هذه الجزيئات الحيوية المتكاملة داخل سيتوبلازم الخلية 8,9. تتكون أغشية هذه العضيات من أنواع متعددة من الدهون بما في ذلك الدهون السفينغولية والكوليسترول والفوسفوليبيد10 التي تساعد في نهاية المطاف على تحديد وظائفها. وبالتالي ، لتكرار هذه العضيات ودراستها عن كثب ، يجب تصنيع LNTs في المختبر من الحويصلات ذات تركيبات الدهون المعقدة بشكل متزايد11.

تستخدم حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs) على نطاق واسع لدراسة سلوك الغشاء الدهني لأنه يمكن تصنيعها بشكل موثوق مع تركيبات معقدة تشمل الكوليسترول والفوسفاتيديل كولين (PC) والفوسفاتيديل إيثانولامين (PE) والفوسفاتيديل سيرين (PS) والفوسفاتيديلينوسيتول (PI) 12,13. الموصوفة هنا هي طريقة لتصنيع LNTs من GUVs مع تركيبات دهنية مختلفة باستخدام مقايسة الحركة الانزلاقية (GMA) ، حيث يتم بثق LNTs بناء على العمل الذي تقوم به محركات kinesin وخيوط microtubule التي تعمل على GUVs. في هذا النظام ، تدفع البروتينات الحركية كينيسين الممتصة إلى سطح الأنابيب الدقيقة البيوتينيل ، وتحول الطاقة الكيميائية من التحلل المائي ل ATP إلى عمل مفيد (على وجه التحديد ، بثق LNTs من الحويصلات البيوتينيلية)11. توفر شبكة LNT الناتجة منصة نموذجية لدراسة آثار الاختلافات في مراحل الدهون على التغيرات في مورفولوجيا LNT.

باختصار ، يتم إدخال بروتينات محرك كينيسين في غرفة تدفق في محلول يحتوي على الكازين ، مما يتيح امتزاز المحركات على السطح الزجاجي للغرفة. بعد ذلك ، تتدفق الأنابيب الدقيقة البيوتينيل في محلول يحتوي على ATP عبر الغرفة ويسمح لها بالارتباط بمحركات kinesin وتبدأ الحركة. ثم يتم إدخال محلول ستربتافيدين في الغرفة ويسمح له بالارتباط بشكل غير تساهمي بالأنابيب الدقيقة. وأخيرا ، يتم إدخال GUVs التي تحتوي على دهون البيوتينيل إلى الغرفة وترتبط بالأنابيب الدقيقة المغلفة بالستربتافيدين ، ثم تقذف LNTs لتشكيل شبكات واسعة النطاق على مدار 15-30 دقيقة. تنتج هذه الطريقة شبكات LNT كبيرة ومتفرعة باستخدام معدات المختبرات القياسية والكواشف بتكلفة منخفضة11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد حلول الأنابيب الدقيقة للمخزون

تنبيه: يجب دائما ارتداء نظارات السلامة والقفازات ومعطف المختبر طوال البروتوكول.

  1. تحضير 5x BRB80 العازل: إضافة 24.19 غرام من الأنابيب (بيبيرازين-N، N′-مكرر [2-حمض الإيثان سلفونيك]) و 0.38 غرام من EGTA (الإيثيلين جلايكول-بيس [β-أمينو إيثيل الأثير]-N,N,N′,N′-حمض رباعي الأسيتيك) إلى زجاجة زجاجية سعة 1 لتر. أضف 1 مل من 1 M MgCl2 واضبط الرقم الهيدروجيني على 6.9 مع KOH. أضف الماء منزوع الأيونات للوصول بالمحلول إلى حجم نهائي يبلغ 500 مل.
  2. تحضير مخزون 100 mM من محلول GTP: يزن 52 ملغ من GTP ويعلق في 1 مل من الماء المقطر. قسم محلول 100 mM إلى 20 ميكرولتر من الأليكوتات وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول GPEM: امزج 200 ميكرولتر من 5x BRB80 ، و 10 ميكرولتر من محلول GTP 100 mM ، و 100 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ ، و 600 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. قسم حل GPEM في 100 ميكرولتر aliquots وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  4. قم بإعداد محلول الأنابيب الدقيقة عن طريق إعادة تشكيل قوارير من التوبولين المجفف بالتجميد المتاح تجاريا (قارورة واحدة لكل من البيوتينيل ، الموسوم بالفلورسنت ، وغير الموسوم) في محلول GPEM البارد (4 درجات مئوية) إلى تركيز مخزون يبلغ 5 ملغ / مل.
  5. قم بإجراء بلمرة الأنابيب الدقيقة عن طريق خلط 4 ميكرولتر من التوبولين الحيوي ، و 4 ميكرولتر من التوبولين المسمى بالفلورسنت ، و 24 ميكرولتر من التوبولين غير المسمى (كل ذلك بتركيزات 5 ملغ / مل) لإنشاء نسبة 1: 1: 6 عند حجم نهائي قدره 32 مل. احتفظ به على الجليد. يقسم خليط التوبولين إلى 2 ميكرولتر أليكوت ويخزن في -80 درجة مئوية حتى الحاجة.
    ملاحظة: تتطلب البلمرة الفعالة أن يكون تركيز التوبولين مساويا للتركيز الحرج أو أعلى منه (5 ملغم/مل)14. هنا ، يتم تحسين اختيار نسبة التوبولين للحصول على تركيز كاف من التوبولين البيوتينيل لربط الستربتافيدين و GUVs بكفاءة ، بالإضافة إلى تركيز كاف من التوبولين الفلورسنت للتوصيف المجهري.

2. إعداد حويصلات أحادية الصفيحة العملاقة (GUVs)

  1. إعداد فيلم أغاروز
    ملاحظة: هذا البروتوكول مقتبس من Greene et al.15.
    1. تحضير محلول 1٪ ث / v عن طريق خلط 1 غرام من الأغاروز في 100 مل من الماء منزوع الأيونات في 250 مل من قارورة Erlenmeyer. استخدم ميكروويف قياسي لتسخين محلول الأغاروز لمدة 1-2 دقيقة.
      ملاحظة: سيصبح المحلول شفافا بمجرد إذابة الأغاروز تماما. اترك المحلول يبرد إلى 65-75 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. استخدم طرف ماصة مقطوع 1000 ميكرولتر لماصة 300-400 ميكرولتر من محلول الأغاروز على غطاء زجاجي مقاس 25 مم × 25 مم. أثناء الإمساك بحافة الغطاء بأصابع القفاز ، استخدم طرف ماصة آخر سعة 1000 ميكرولتر لنشر الأغاروز المذاب بالتساوي عبر الغطاء .
      ملاحظة: إن الحفاظ على الأغاروز عند 65-75 درجة مئوية سيسمح بالانتشار الفعال على سطح الغطاء.
    3. جفف الأغطية المطلية بالأغاروز في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل ، وعند هذه النقطة ستصبح الأغاروز شفافة. قم بتخزين الأغطية عن طريق وضع السطح المطلي بالأغاروز متجها لأعلى على سطح نظيف مثل الورق الخالي من الوبر أو الفيلم القائم على الشمع في درجة حرارة الغرفة (RT).
  2. تركيبة الدهون
    1. استرجع الدهون الذائبة في الكلوروفورم من الفريزر -20 درجة مئوية وضعها في غطاء دخان كيميائي حتى تصل إلى RT.
    2. احسب حجم مخزون الدهون لكل مكون من الدهون اللازمة للتركيبة باستخدام الصيغة التالية:
      figure-protocol-1
      حيث: V الدهون هي حجم الدهون المراد استخدامها ، و mol ٪ هي النسبة المئوية المولية لمكون الدهون ، n هي إجمالي عدد مولات الدهون المستخدمة في التركيبة ، و M هي تركيز الدهون في الوحدات المولية.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم استخدام تركيبة تحتوي على 45٪ مول٪ 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) بتركيز محلول مخزون يبلغ 12.72 ملليمتر، وميكرومول واحد من إجمالي الدهون في التركيبة، فإن حجم مخزون DOPC المستخدم في التركيبة سيكون:
      figure-protocol-2
    3. امزج الدهون معا بنسبة محسوبة في قارورة زجاجية في غطاء الدخان الكيميائي.
    4. ماصة 30 ميكرولتر من محلول الدهون على الغطاء المطلي بالأغاروز على صفيحة ساخنة مسخنة مسبقا يتم تعيينها فوق نقطة انصهار مكون الدهون المشبعة في التركيبة (على سبيل المثال ، صفيحة ساخنة 50 درجة مئوية للدهون مع Tm من 40 درجة مئوية).
    5. انشر المحلول عبر فيلم الأغاروز في حركة دائرية باستخدام الحافة الطويلة لإبرة 18 جم حتى يتبخر الكلوروفورم وتتشكل طبقة موحدة من الدهون. أمسك حافة الغطاء بأصابع القفاز أثناء تنفيذ هذه الخطوة.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم إتلاف طبقة الأغاروز بالإبرة.
    6. ضع الغطاء مع طبقة الأغاروز وفيلم الدهون في طبق بتري مغطى بورق الألمنيوم ، ووجه جانب الفيلم لأعلى ، وضع طبق بتري في مجفف فراغ لمدة 2 ساعة على الأقل لإزالة المذيبات المتبقية.
  3. في غضون ذلك ، قم بإعداد محلول السكروز 560 mM عن طريق خلط 1.92 غرام من السكروز مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات.
    ملاحظة: يعتمد تركيز محلول السكروز على الأسمولية للمركبات متعددة الاستخدامات العازلة التي يتم تخفيفها. عادة ، يجب ألا تزيد أوزمولية محلول السكروز عن 10٪ أكبر من المخزن المؤقت الذي سيتم تخفيف GUVs فيه ، وتحديدا المخزن المؤقت للحركة (انظر الخطوة 3.11).
  4. تشكيل GUV
    1. قم بلصق غرفة لاصقة بالغطاء المطلي بغشاء الدهون عن طريق الضغط برفق على الغرفة اللاصقة على الغطاء المطلي بالدهون مع توجيه فيلم الدهون لأعلى ، مما يضمن تشكيل ختم محكم.
    2. أضف 400 ميكرولتر من محلول السكروز 560 mM (المحضر في الخطوة 2.3) إلى الغرفة.
    3. ضع الغطاء في غرفة الرطوبة وأغلق الغطاء.
    4. ضع غرفة الرطوبة على صفيحة ساخنة مسخنة مسبقا فوق نقطة انصهار مكون الدهون المشبعة في التركيبة.
    5. اسمح للحويصلات بالتشكل لمدة ≥1 ساعة قبل الشفاء.
      ملاحظة: يمكن فحص تكوين الحويصلة باستخدام الفحص المجهري الفلوري باستخدام عدسة الهدف الجوي 40x.

3. إعداد مخزون مقايسة الحركة والكواشف

  1. إعداد مخزون الكازين
    1. أضف 3 غرام من الكازين الجاف إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل ، ثم أضف 30 مل من 1x BRB80 وقم بالتدوير حتى يصبح المحلول لزجا. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة.
    2. انقل السوبرنات إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي آخر سعة 50 مل وتخلص من الكرية. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح حقنة 1 ميكرومتر ، وجمع المحلول في قارورة مخروطية سعة 50 مل. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر ، وجمع المحلول في قارورة مخروطية سعة 50 مل.
    3. حدد تركيز البروتين عن طريق قياس الامتصاص عند 280 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي UV-Vis وكوفيت الكوارتز.
    4. احسب تركيز الكازين في ملغم/مل باستخدام الصيغة التالية:
      figure-protocol-3
    5. قم بتخفيف المحلول إلى 20 مجم / مل في 1x BRB80 ، وقسمه إلى 100 ميكرولتر أليكوتس ، وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  2. تحضير محلول أوكسيديز الجلوكوز (2 مجم / مل) عن طريق خلط 2 ملغ من أوكسيديز الجلوكوز مع 1 مل من 1x BRB80. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  3. تحضير محلول الكاتالاز (0.8 ملغ / مل) عن طريق خلط 0.8 ملغ من الكاتالاز مع 1 مل من 1x BRB80. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  4. تحضير محلول الجلوكوز 2 M عن طريق تعليق 0.3 غرام من الجلوكوز D في 1 مل من الماء منزوع الأيونات. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  5. قم بتحضير مخزون DTT سعة 100 مللي متر عن طريق تعليق 0.015 جم من DTT في 1 مل من الماء منزوع الأيونات. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  6. تحضير مخزون 100 mM Mg-ATP عن طريق تعليق 0.055 g من ATP ثنائي الصوديوم في محلول 1 مل من 100 mM MgCl2. تقسم إلى 100 ميكرولتر أليكوت وتخزن عند -20 درجة مئوية.
  7. قم بتحضير محلول 100 mM Mg-AMP-PNP عن طريق تعليق 0.055 جم من AMP-PNP في محلول 1 مل من 100 mM MgCl2 ، ثم قسمه إلى 100 ميكرولتر من الأليكوت وخزنه عند -20 درجة مئوية.
  8. تحضير محلول Trolox 100 mM عن طريق إضافة 25.03 ملغ من Trolox إلى 1 مل من الميثانول وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  9. تحضير محلول ستربتافيدين 10 ملغم / مل عن طريق إضافة 1 ملغ من الستربتافيدين إلى 100 ميكرولتر من BRB80 ، ثم قسمها إلى 2 ميكرولتر أليكوت وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
  10. تحضير BRB90CAT عن طريق خلط 200 ميكرولتر من 5x BRB80 ، 20 ميكرولتر من محلول الكازين ، 10 ميكرولتر من محلول MgATP ، 10 ميكرولتر من Trolox ، 5 ميكرولتر من محلول باكليتاكسيل ، و 765 ميكرولتر من ماء DI. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  11. تحضير محلول الحركة عن طريق خلط 192 ميكرولتر من BRB80CAT ، و 2 ميكرولتر من محلول الجلوكوز D ، و 2 ميكرولتر من محلول أوكسيديز الجلوكوز ، و 2 ميكرولتر من محلول DTT ، و 2 ميكرولتر من محلول الكاتالاز. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  12. قم بإعداد محلول كينيسين 1 ميكرومتر عن طريق تخفيف محلول كينيسين المخزون في BRB80CAT (على سبيل المثال ، 2 ميكرولتر من محلول كينيسين 50 mM في 98 ميكرولتر من BRB80CAT) وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
  13. قم بإعداد محلول 10 ميكروغرام / مل من الأنابيب الدقيقة عن طريق تخفيف 10 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة المستقرة في 90 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة BRB80CAT. يخزن في RT.
  14. تحضير محلول ستربتافيدين 10 ميكروغرام/مل عن طريق إضافة 0.1 ميكرولتر من محلول ستربتافيدين 10 ملغم/مل في 99.9 ميكرولتر من محلول الحركة. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  15. قم بإعداد محلول GUV 12x عن طريق تخفيف 5 ميكرولتر من مخزون GUV إلى 55 ميكرولتر من محلول الحركة. يخزن على درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  16. بلمرة التوبولين إلى أنابيب دقيقة
    1. اجمع أليكوت 2 ميكرولتر معد مسبقا من التوبولين من الفريزر -80 درجة مئوية (المحضر في الخطوة 1.5) وضعه في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. تحضير محلول باكليتاكسيل 2 مللي متر عن طريق إضافة 1.71 ملغ من باكليتاكسيل في 1 مل من DMSO اللامائي ، وتقسيمها إلى 10 ميكرولتر أليكوتس ، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    3. تحضير BRB80T طازجا عن طريق خلط 99.5 ميكرولتر من 1x BRB80 مع 0.5 ميكرولتر من 2 mM paclitaxel.  تدفئة 100 ميكرولتر من BRB80T إلى 37 درجة مئوية في الحمام المائي.
    4. بعد 30 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من BRB80T إلى أليكوت توبولين لتحقيق الاستقرار في الأنابيب الدقيقة. يخزن في RT.

4. فحص الحركة المنزلقة (GMA)

  1. قم بإعداد غرفة تدفق عن طريق لصق شريطين من الشريط على الوجهين مفصولين بمقدار 5 مم على شريحة زجاجية. كرر هذه العملية حتى تشكل ثلاث طبقات من الشريط كل شريط.
  2. ضع غطاء أعلى الشريط، ثم اضغط برفق على واجهة الغطاء/الشريط باستخدام ملاقط أو قلم لضمان الالتصاق الكافي.
    ملاحظة: يجب أن يكون عرض القناة 5 مم وطولها 25 مم وارتفاعها 300 مم.
  3. ماصة 30 ميكرولتر من محلول كينيسين 1 مم (أعدت في الخطوة 3.12) في خلية التدفق واتركها تحضن لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يشكل الكازين طبقة ثنائية الطبقة على سطح شريحة الغطاء / الزجاج ويسهل ربط ذيل كينيسين بالسطح.
  4. ماصة 30 ميكرولتر من محلول الأنابيب الدقيقة 10 ميكروغرام / مل (المحضر في الخطوة 3.13) في خلية التدفق ، باستخدام مسح مختبري مضغوط برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. احتضان لمدة 5 دقائق.
  5. اغسل خلية التدفق 1x-3x بمحلول الحركة 1x في RT (تم إعداده في الخطوة 3.11).
    ملاحظة: يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري باستخدام هدف هوائي 40x في هذه المرحلة لتأكيد ارتباط الأنابيب الدقيقة وحركيتها. تظهر الأنابيب الدقيقة على شكل خيوط فلورسنت (طولها عشرات الميكرونات) تتحرك (تنزلق عبر السطح عند ~ 0.5 ميكرومتر / ثانية (الشكل 1).
  6. ماصة 30 ميكرولتر من محلول ستربتافيدين 10 ميكروغرام / مل (محضر في الخطوة 3.14) في خلية التدفق باستخدام مسح مختبري مضغوط برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. احتضان لمدة 10 دقائق.
  7. تدفق 30 ميكرولتر من محلول GUV 12x (المعد في الخطوة 3.15) في التدفق باستخدام مسح مختبري مضغوط برفق على الطرف الآخر من قناة التدفق لتسهيل تبادل المحلول. تحضن لمدة 30 دقيقة.
  8. أضف 2 ميكرولتر من محلول 100 mM AMP-PNP (المعد في الخطوة 3.7) لوقف الحركة ، ثم أغلق الغرفة بمادة مانعة للتسرب.

5. توصيف شبكة LNT

  1. انقل غرفة التدفق إلى مجهر مقلوب للتصوير.
  2. اختر مجموعة المرشحات المناسبة بناء على الأطوال الموجية للدهون الفلورية أو التوبولين المستخدمة. على سبيل المثال ، عند استخدام الدهون ذات العلامات الحمراء في تكساس ، استخدم مرشح إثارة 560 نانومتر / 25 نانومتر ومرشح انبعاث 607 نانومتر / 36 نانومتر.
  3. استخدم هدف زيت 100x للتركيز على سطح الغطاء.
  4. صورة لشبكات LNT باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
    ملاحظة: LNTs هي هياكل خطية تقذف من الحويصلات الأكبر. LNTs أصغر بكثير من GUVs ولها إشارات فلورية أضعف. وبالتالي ، يجب ضبط التعريض الضوئي والتباين وفقا ل LNTs للصورة. وتؤدي هذه التعديلات أيضا إلى التعرض المفرط للمركبات متعددة الرسومات، ومن ثم، يوصى بوصف الصفائح والفصل الطوري في المركبات متعددة الاستخدامات بشكل مستقل.
  5. ركز المجهر على شبكة ذات أهمية والتقط صورة قياسية أو مبلطة.
  6. اضبط وقت التعريض الضوئي ومرشحات الكثافة المحايدة لتصوير LNTs وتقليل التعرض المشبع للمركبات متعددة الرسومات. احصل على صور في كل من القنوات الحمراء والخضراء.
    ملاحظة: هنا ، تسمح القناة الحمراء بتصور الدهون الحمراء في تكساس ، بينما تسمح القناة الخضراء بتصور الأنابيب الدقيقة (على سبيل المثال ، دهون أوريغون الخضراء وأصباغ HiLyte488).
  7. قم بإنشاء صورة مركبة عن طريق تراكب القنوات الحمراء والخضراء (الشكل 1).
  8. توصيف شبكات LNT عن طريق قياس طول LNT
    1. افتح الصور التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج تحليل الصور مثل ImageJ.
    2. قم بمعايرة مقياس المجهر باستخدام ميزة المقياس المعين، واملأ وحدات البكسل إلى عامل تحويل مم، وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: يعتمد عامل التحويل على المجهر والعدسة الموضوعية والكاميرا، ويمكن الحصول عليه باستخدام شريحة معايرة المجهر. يتم التعبير عنه بشكل عام بالبكسل / مم.
    3. استخدم أداة الخط متعدد النقاط لقياس طول الأنابيب النانوية بدءا من GUV الأصلي. اضغط باستمرار على Ctrl + M لقياس الطول.
    4. استمر في قياس أطوال الأنابيب الفردية باتباع الخطوات المذكورة أعلاه. ستقوم أداة معالجة الصور بحفظ كل قياس جديد في نافذة النتائج.
    5. اضغط باستمرار على Ctrl + D بعد رسم كل خط لتتبع الأنابيب التي تم قياسها.
  9. قياس سمك LNT (الشكل 2)
    1. افتح الصورة في ImageJ وحدد ميزة العتبة ضمن علامة التبويب صورة .
    2. انقر على تطبيق لتطبيق الحد الأدنى.
    3. ارسم مستطيلا بطول معروف فوق الأنبوب المطلوب (البيكسلات السوداء لها قيمة 0، والبيكسلات الحمراء لها قيمة 255).
    4. قياس الكثافة المتكاملة للمنطقة.
    5. اقسم الكثافة على طول LNT (بالبكسل) للحصول على السماكة (بالبكسل).
      ملاحظة: لا يمكن مقارنة قياسات السماكة عبر الصور إلا عند تعيين إعدادات التصوير والعتبة بشكل متطابق.
  10. تحديد تقسيم الدهون في عقد LNTs (الشكل 3)
    1. افتح الصورة في ImageJ.
    2. استخدم أداة الخط لرسم خط فوق العقدة المطلوبة.
    3. قياس شدة العقدة في كل من قناتي أوريغون غرين وتكساس الحمراء.
    4. انقل الخط إلى LNT وقم بقياس كثافة LNT في كل من قناتي أوريغون غرين وتكساس ريد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصنيع شبكات LNT (الشكل 4) باستخدام البروتوكول الموصوف ، والذي يستخدم العمل الذي يؤديه نقل الكينيسين للأنابيب الدقيقة لبثق LNTs من GUVs. باختصار ، تم تحضير GUVs باستخدام إماهة هلام الأغاروز باستخدام محلول السكروز ، وتم بلمرة الأنابيب الدقيقة في محلول GPEM واستقرت في BRB80T. بعد ذلك ، تم إدخال محركات كينيسين في خلية تدفق تشكل طبقة نشطة من المحركات على سطح الغطاء. ثم أدخلت الأنابيب الدقيقة وأضيفت محلول ستربتافيدين ، مما سهل الارتباط بين الدهون البيوتينيل و GUVs (التي تم إدخالها لاحقا).

<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد شبكات LNT أداة مفيدة للدراسات المخبرية لخصائص الغشاء ونقل الجزيئات الحيوية مثل البروتينات عبر الغشاء. علاوة على ذلك ، فإن استخدام تركيبات الدهون المعقدة لتصنيع شبكات LNT يتيح إجراء المزيد من الدراسات ذات الصلة بيولوجيا. استخدمت دراسات تصنيع أخرى إما 1) تركيبات دهنية بسيطة وحويصلات متعددة الصفائح أو 2) تقنيات حركية أكثر تعقيدا لتصنيع شبكات من GUVs تتكون من تركيبات دهنية معقدة. تتيح الطريقة الموضحة هنا التصنيع الفعال لشبكات LNT واسعة النطاق من تركيبات الدهون المعقدة و GUVs واستخدام كواشف ومعدات غير مكلفة. على هذا النحو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مختبرات سانديا الوطنية هي مختبر متعدد المهام تديره وتشغله شركة الحلول الوطنية للتكنولوجيا والهندسة التابعة لشركة سانديا ، ذ.م.م ، وهي شركة تابعة مملوكة بالكامل لشركة هانيويل إنترناشيونال ، إنك ، للإدارة الوطنية للأمن النووي التابعة لوزارة الطاقة الأمريكية بموجب العقد DE-NA-0003525. تصف هذه الورقة النتائج الفنية الموضوعية والتحليل. أي وجهات نظر أو آراء ذاتية قد يتم التعبير عنها في الورقة لا تمثل بالضرورة وجهات نظر وزارة الطاقة الأمريكية أو حكومة الولايات المتحدة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الطاقة الأمريكية ، ومكتب علوم الطاقة الأساسية ، وقسم علوم وهندسة المواد (BES-MSE). تم إجراء تركيب Kinesin والفحص المجهري الفلوري من خلال مشروع مستخدم (ZIM) في مركز تقنيات النانو المتكاملة ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة الأمريكية (DOE).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
100x / 1.4 الفتحة العددية غمر الزيت الهدفأوليمبوس1-U2B836أوليمبوس UPlanSApo 100x / 1.40 موضوعي الزيت اللانهائي المصحح ، RMS الموضوع
مسافة العمل 0.12 مم
3.0 مرشح NDفلتر أوليمبوسمرشح الكثافة المحايدة
AMP-PNPسيجما-ألدريتشA2647(بيتا ؛ جاما ؛ إيميدوأدينوزين 5 & بريمي ؛ ثلاثي الفوسفات)
ATPSigma-AldrichA7699Adenosine 5'-ثلاثي الفوسفات ملح ثنائي الصوديوم هيدرات BioXtra
Brightline Pinkel DA / FI / TR / Cy5 / Cy7-5X-A000 مجموعةمرشحات SemrockLED-DA / FI / TR / Cy5 / Cy7-5X-A-000
مجموعة مرشحات BrightLine Pinkel ، محسنة ل DAPI و FITC و TRITC و Cy5 و ; Cy7 وغيرها من الفلوروفورات المماثلة ، مضاءة بمصادر الضوء
الكازينSigma-Aldrich22090تحلل الكازين لعلم الأحياء الدقيقة
كاتالازسيجما ألدريتشC9322كاتالاز من كبد البقر
كلوروفورمسيجما ألدريتش288306يحتوي الكلوروفورم اللامائي على 0.5-1.0٪ إيثانول كمثبت
كوليسترولأفانتي700000Pالكوليسترول (صوف الأغنام ، >98٪) (مسحوق)
D-GlucoseSigma-AldrichG7021D- (+) - مسحوق الجلوكوز ، الكاشف الحيوي ، مناسب لزراعة الخلايا ، مناسب لزراعة خلايا الحشرات ، مناسب لزراعة الخلايا النباتية ، & ge ؛ 99.5٪
DOPCAvanti850375C1،2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (في الكلوروفورم)
DOPE-BiotinAvanti870282C1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- (البيوتينيل) (ملح الصوديوم)
DPPCAvanti850355P1،2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (مسحوق)
DPPE-BiotinAvanti870285P1،2-ديبالميتويل-SN-glycero-3-فوسفو إيثانولامين-N- (بيوتينيل) (ملح الصوديوم)
DTTSigma-Aldrich43816محلول DL-Dithiothreitol 1 M
EGTASigma-AldrichE4378EGTA ، حمض Egtazic ، الإيثيلين مكرر (أوكسي إيثيلين لينينيتريلو) حمض التتراأسيتيك ، جلايكول إيثر ديامين حمض تتراأسيتيك
الجلوكوز أوكسيديزسيجما ألدريتشG6125الجلوكوز أوكسيديز من الرشاشيات النيجر
النوع الثاني ، > 10,000 وحدة / غرام صلب (بدون أكسجين مضاف)
الجلسرينفيشرG33الجلسرين (ACS معتمد) ، فيشر كيميكال
GTPسيجما ألدريتشG8877جوانوزين 5 بريم ؛ -ثلاثي فوسفات ملح الصوديوم هيدرات
IX-81 أوليمبوسN / AIX81 مجهر مقلوب من أوليمبوس
KOHسيجما ألدريتش1050121000البوتاسيوم هيدروكسيد
كلوريد المغنيسيومسيجما-ألدريتشM10281.00 م محلول كلوريد المغنيسيوم
Orca Flash 4.0 الكاميرا الرقميةHamamatsuC13440-20CUORCA-Flash 4.0 V3 كاميرا CMOS الرقمية
أوريغون أخضر-DHPEInvitrogenO12650أوريغون جرين 488 1،2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
PaclitaxelThermoFisherP3456باكليتاكسيل (مكافئ تاكسول) - للاستخدام في البحث فقط
PIPESSigma-AldrichP67571،4-Piperazinediethanesfonic ، Piperazine-1،4-bis (2-ethanesulfonic acid) ، Piperazine-N ، N & prime ؛ -bis (2-ethanesulfonic acid)
Texas Red-DHPEInvitrogenT1395MPTexas Red 1،2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine ،
ملح ثلاثي إيثيل أمونيوم
Troloxسيجما ألدريتش238813(±)-6-هيدروكسي -2،5،7،8-رباعي ميثيل كرومان-2-حمض الكربوكسيل
توبولين ، البيوتين، الهيكل الخلوي، T333Pبروتين التوبولين (البيوتين) ، الدماغ الخنازير
Tubulin ، Hy-Lite 488الهيكل الخلويTL488Mبروتين Tubulin (الفلورسنت HiLyte 488) ، الدماغ الخنازير
Tubulin ،الهيكل الخلويT240بروتين Tubulin ، الدماغ الخنازير
القائمة على LED مجهر أوليمبوس غير المسمى

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments. Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).
  2. Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments. Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).
  3. Leduc, C., et al. Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).
  4. Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).
  5. Belting, M., Wittrup, A. Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).
  6. Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
  7. Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells. Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).
  8. Sciaky, N., et al. Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).
  9. Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. How proteins move lipids and lipids move proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).
  10. Keenan, T. W., Morre, D. J. Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions. Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).
  11. Imam, Z. I., Bachand, G. D. Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).
  12. Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems. Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).
  13. Momin, N., et al. Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains. Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).
  14. Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. Phase diagram of microtubules. Physical Review E. 50, 1579(1994).
  15. Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  16. Bachand, M., et al. Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays. Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ImageJ

مقالات ذات صلة