مقالة منهجية

توصيف التمايز في المختبر من خلايا الكيراتينوسيات الأولية البشرية بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي-SEQ

DOI:

10.3791/60905

⸱

مايو 16, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Developmental Biology, Faculty of Science, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University, Nijmegen, The Netherlands, 2Department of Dermatology, Radboud University Medical Center, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, The Netherlands, 3Department of Human Genetics, Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا هو إجراء متدرج لتمايز في المختبر من keratinocytes الإنسان الأولية عن طريق تثبيط الاتصال تليها توصيف على المستوى الجزيئي من قبل تحليل الحمض النووي الريبي- seq.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وغالبا ما تستخدم keratinocytes الإنسان الأولية ونماذج في المختبر للدراسات على التمايز البشرة والأمراض ذات الصلة. وقد تم الإبلاغ عن أساليب لتمايز في المختبر من keratinocytes المستزرعة في ثنائية الأبعاد (2D) آداب مغمورة باستخدام ظروف الحث المختلفة. هو موضح هنا هو إجراء ل2D في طريقة تمايز keratinocyte في المختبر عن طريق تثبيط الاتصال والتوصيف الجزيئي اللاحقة من قبل RNA-seq. باختصار, تزرع keratinocytes في تعريف keratinocyte المتوسطة تكملها عوامل النمو حتى تكون التقاء تماما. ويُستحث التمايز عن طريق الاتصالات الوثيقة بين الخلايا الكيراتينية ويُحفَّز كذلك باستبعاد عوامل النمو في الوسط. باستخدام التحليلات RNA-seq، يظهر أن كلا 1) keratinocytes متباينة المعرض التوقيعات الجزيئية متميزة أثناء التمايز و 2) نمط التعبير الجيني الديناميكي يشبه إلى حد كبير الخلايا خلال الطبقات البشرة. بالمقارنة مع التمايز keratinocyte العادي، keratinocytes تحمل طفرات من عامل النسخ p63 معرض تغيير مورفولوجيا والتوقيعات الجزيئية، بما يتفق مع عيوب التمايز الخاصة بهم. في الختام، هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات ل2D في المختبر keratinocyte التمايز وتوصيف الجزيئية، مع التركيز على تحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات RNA-seq. لأن RNA استخراج و RNA- إجراءات ني- ا موثقة جيدا، فإنه ليس محور هذا البروتوكول. الإجراء التجريبي للتمايز في الكيراتينوسيات في المختبر الحيوي وخط أنابيب تحليل المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لدراسة الأحداث الجزيئية خلال التمايز الجلدي في خلايا الكيراتينوسيات صحية والمُرَضَّة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالباً ما تستخدم keratinocytes الإنسان المشتقة من الجلد البشري كنموذج الخلوية لدراسة بيولوجيا البشرة1,2,3,4. يمكن أن تكون على غرار الطبقات من البشرة من قبل التمايز keratinocyte، إما في 2D مغمورة monolayer أزياء أو 3D الهواء رفع organotypic نموذج2،3،5،6،7. على الرغم من أن النماذج ثلاثية الأبعاد أصبحت ذات أهمية متزايدة لتقييم بنية الجلد ووظيفته ، فإن نماذج التمايز 2D لا تزال تستخدم ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم أخذ خزعات الجلد من جذع المتطوعين الأصحاء أو المرضى الذين يعانون من طفرات p63 ، لإعداد ثقافة الكيراتينوسيت الأولية. وقد وافقت اللجنة الأخلاقية التابعة لمركز نيجمين الطبي التابع لجامعة رادبود على جميع الإجراءات المتعلقة بإنشاء الخلايا الكيراتينية الأولية البشرية (Commissie Mensgebonden Onderzoek Arnhem-Nijmegen). وتم الحصول على الموافقة المستنيرة.

1. الإنسان keratinocyte التمايز عن طريق تثبيط الاتصال

  1. إعداد keratinocyte متوسطة النمو (KGM) من Keratinocyte بازل المتوسطة (جدول المواد) عند الضرورة.
  2. جعل 500 مل لانتشار المتوسطة باستخدام الأرصدة المعدة مسبقا (KGM-pro؛ انظر الجدول 1).
  3. ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التمايز العادي في الكيراتينوسيت وتحليل الحمض النووي الريبي -seq
في هذه التجربة، استخدمت خطوط الكيراتينوسيت المستمدة من خمسة أفراد للتمايز وتحليلات الحمض النووي الريبي- الصد. ويلخص الشكل 1 الإجراء التجريبي للتمايز ونتائج تحليل الحمض النووي الريبي -seq. ويتضح في الشكل 1Aنظرة عامة على إجراءات التمايز في المختبر من keratinocytes العادية والتغيرات في مورفولوجيا الخلية أثناء التمايز. وأظهر تحليل المكونات الأساسية (PCA) أن الكيراتينوسيات التي تمر با.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل طريقة لحفز تمايز الكيراتينوسيت البشري والتوصيف اللاحق باستخدام تحليلات الحمض النووي الريبي الريبي. في الأدب الحالي، العديد من الدراسات على تمايز الكيراتينوسيت البشري استخدام طريقتين آخرين، مع تركيز الكالسيوم عالية أو مع المصل كأساليب للحث على التمايز2,3,23. قارن تقرير سابق بعناية هذه الطرق الثلاثة المختلفة3 وأظهر أن هذه الطرق يمكن أن تمثل بيولوجيا متميزة من تمايز الكيراتينوسيت. في هذا التقري.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا البحث من قبل المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010، H.Z.) (NWO/ALW/Open Competition/ALWOP 376, H.Z., J.G.A.S.); زمالة جامعة رادبود (H.Z.); ومنحة مجلس المنح الدراسية الصينية 201406330059 (J.Q.).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلل حيوي 2100AgilentG2929BA
مستخلص الغدة النخامية البقري (BPE)Lonzaجزء من bulletKit
CFX96 نظامالوقت الحقيقي Bio-RadqPCR
آلة المحلول الملحي الممخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS)Sigma-AldrichD8537
عامل نمو البشرة (EGF)Lonzaجزء من bulletKit
Ethanolamine > = 98٪Sigma-AldrichE9508
رقائق الحمض النووي عالية الحساسيةAgilent5067-4626
HydrocortisonLonzaجزء من الرصاصKit
الأنسولينLonzaجزء من الرصاصKit
iQ SYBR Green KitBioRad170-8886
iScript (cDNABio rad1708890
KAPA Library Quant KitRoche07960255001قياس التركيز المنخفض
KAPA RNA HyperPrep Kit مع RiboEraseRocheKK8540RNAseq
KGM Gold Keratinocyte Growth Medium BulletKitLonza192060
NanodropdeNovixDS-11 FX (نموذج)Nanodrop و Qbit لقياسات الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي
NEXTflex الرموز الشريطية للحمض النووي -24IllumniaNOVA-5141036 نقاط أساس بادئات طويلة
البنسلين الستربتومايسينجيبكو15140122
RNA Pico ChipAgilent5067-1513
) مجموعة مجموعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hardman, J. A. Skin equivalents for studying the secrets of skin: from development to disease. British Journal of Dermatology. 173 (2), 320-321 (2015).
  2. Borowiec, A. S., Delcourt, P., Dewailly, E., Bidaux, G. Optimal differentiation o....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Human Primary KeratinocytesIn Vitro DifferentiationRNA Seq AnalysisContact InhibitionEpidermal DifferentiationGene Expression ProfilingPrincipal Component AnalysisK Means ClusteringGene Ontology AnalysisP63 Mutations

مقالات ذات صلة