مقالة منهجية

جيل من Oligodendrocytes وOligodendrocyte- متوسطة مكيفة للتجارب الثقافة المشتركة

DOI:

10.3791/60912

⸱

فبراير 9, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نعرض طريقة فعالة لتنقية oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة التي يمكن استخدامها لتجارب الثقافة المشتركة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الجهاز العصبي المركزي ، تشتهر oligodendrocytes بدورها في الميالات المحورية ، التي تسرع من انتشار إمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي. وعلاوة على ذلك، يشير عدد متزايد من التقارير إلى أن oligodendrocytes تتفاعل مع الخلايا العصبية وراء الميالين، لا سيما من خلال إفراز العوامل القابلة للذوبان. هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا يسمح بتنقية خلايا النسب oligodendroglial من ثقافات الخلايا الدبقية التي تحتوي أيضًا على الخلايا الفلكية والخلايا المجهرية. تعتمد الطريقة على الاهتزاز بين عشية وضحاها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ، مما يسمح بانفصال انتقائي للخلايا الأولية المنفّذة والخلايا المجهرية ، والقضاء على microglia عن طريق الالتصاق التفاضلي. ثم نصف ثقافة oligodendrocytes وإنتاج وسيط oligodendrocyte مكيفة (OCM). ونحن نقدم أيضا حركية العلاج OCM أو oligodendrocytes بالإضافة إلى الخلايا العصبية قرنية النهر المنقى في تجارب الثقافة المشتركة, دراسة التفاعلات oligodendrocyte الخلايا العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oligodendrocytes (OLs) هي الخلايا الدبقية للجهاز العصبي المركزي (CNS) التي تولد التفاف المالين حول محاور عصبية. تنشأ OLs من الخلايا السلائف oligodendrocyte (OPCs) التي تتكاثر داخل المناطق البطينية من الجهاز العصبي المركزي الجنيني ثم تهاجر وتفرق إلى OLs ناضجة تماما (أي، الخلايا تشكيل المالين)1. OPCs وفيرة خلال التنمية المبكرة، ولكن أيضا تستمر في الدماغ الكبار حيث أنها تمثل عدد الخلايا التكاثرية الرئيسية2. واحد OL ensheathes محاور متعددة في أقسام غير منفعل (أي، internodes)، وحافة كل حلقة المالين تعلق على محور عصبي تشكيل المجال البارانودال الذي أمر بالغ الأهمية للخصائص العازلة من المائلين1،3. بين paranodes هي فجوات صغيرة unmyelinated تسمى العقد من رانفييه. هذه العقد غنية بقنوات الصوديوم ذات بوابات الجهد (Nav) ، مما يسمح بتجديد والانتشار السريع لإمكانات العمل من خلال التوصيل الملحي4. هذا التفاعل ضيق يتيح أيضا دعم الطاقة المحورية من خلال التمازى العصبية من اللاكتات من OLs5،6.

يتم تنظيم نضوج خلايا النسب oligodendroglial وعملية الميالين بإحكام من خلال تفاعلاتها مع الخلايا العصبية7. في الواقع، OLs وOPCs، واسمه أيضا خلايا NG2، والتعبير عن مجموعة من المستقبلات للناقلات العصبية، ويمكن أن تتلقى مدخلات من الخلايا العصبية مثير ومثبطة، مما يسمح لهم باستشعار النشاط العصبي الذي يمكن أن يؤدي انتشارها و / أو التمايز في الخلايا المائلة2. بدوره، OPCs / OLs تفرز microvesicles والبروتينات في الفضاء خارج الخلية التي وحدها أو التوسط بشكل تآزري وظائف التشكيل العصبي واعصاب8،9،10،11،12. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية التي تتحكم في طرق متعددة من التفاعلات بين خلايا النسب oligodendroglial والخلايا العصبية لم يتم فك شفرتها بالكامل.

وعلاوة على ذلك، في العديد من الحالات المرضية CNS، تتأثر OLs في المقام الأول، وبالتالي تعكير تفاعلها مع الخلايا العصبية. على سبيل المثال ، في التصلب المتعدد (MS) ، يحدث الخلل العصبي عن طريق إزالة الميالة البؤرية في الجهاز العصبي المركزي ، وهو ثانوي لفقدان OLs الذي يمكن أن يؤدي إلى تلف عصبي وتراكم الإعاقة ذات الصلة. يمكن أن يحدث Remyelination ، وإن كان غير كاف في معظم الحالات13. وقد أدى التقدم المحرز في العقد الماضي، بسبب تطور العلاجات المناعية، إلى خفض معدل الانتكاس، ولكن تعزيز إعادة التمالع لا يزال حتى الآن حاجة غير ملباة. على هذا النحو ، فإن فهم أفضل لدور OLs ووظائفه وتأثيراته له أهمية خاصة لتطوير علاجات جديدة لمجموعة واسعة من ظروف الجهاز العصبي المركزي.

هنا ، ونحن نصف أساليب تنقية OLs والثقافة. وهذا يتيح إجراء دراسة دقيقة للآليات الجوهرية التي تنظم تطورها وبيولوجيتها. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الثقافات OLs عالية التخصيب بإنتاج وسيط أوليغودندروسيتي مكيف (OCM)، والتي يمكن إضافتها إلى ثقافات الخلايا العصبية النقية للحصول على نظرة ثاقبة لتأثير العوامل التي تفرزها OLs على فسيولوجيا الخلايا العصبية والاتصال. وعلاوة على ذلك، فإننا نصف كيفية تنفيذ نظام الثقافة المشتركة في المختبر حيث يتم الجمع بين oligodendrocytes تنقية والخلايا العصبية معا، مما يسمح لمعالجة الآليات التي تنظم (إعادة) myelination.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتتوافق رعاية الفئران واستخدامها في هذه التجربة مع السياسات والمبادئ التوجيهية المؤسسية (UPMC وINSERM وتوجيهات مجلس الجماعة الأوروبية 86/609/EEC). تم إنشاء البروتوكول التالي لالقمامة القياسية من 12 الجراء.

1. إعداد القوارير (~ 5 دقيقة)

ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في اليوم السابق تشريح في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.

  1. معطف 150 سم2 قوارير (T150) مع غطاء مرشح (1 قارورة ل2 الجراء) باستخدام 5 مل من polyethylenimine (جزيرة الأمير إدوارد, 100 ملغ / لتر, انظر البروتوكول في الملف التكميلي 1).
  2. تخزين القوارير في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. شطف القوارير المغلفة 3 مرات مع الماء المقطر المعقم في يوم تشريح.

2. إعداد وسائل الإعلام (~ 10 دقيقة)

ملاحظة: تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.

  1. إعداد 500 مل من وسط الثقافة، والتي تتكون من متوسط النسر المعدلة Dulbecco (DMEM) تستكمل مع 10٪ من مصل ربلة الساق الجنين (FCS) والبنسلين-ستريبتومسين (100 وحدة دولية / مل).
  2. إعداد 20.6 مل من وسط هضم الإنزيم في أنبوب 50 مل، يتكون من 20 مل من DMEM، 200 ميكرولتر من DNase (50 ميكروغرام/مل)، 200 ميكرولتر من الباباين (30 U/mL) و 200 ميكرولتر من L-السيستين (0.24 ملغم/مل).
  3. تصفية تعقيم وسائل الإعلام باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  4. الحفاظ على وسائل الإعلام في غطاء محرك السيارة تدفق لامينار في درجة حرارة الغرفة (RT) حتى تشريح.

3. التحضير للتشريح (~ 10 دقيقة)

ملاحظة: تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.

  1. إعداد 100 مل من الفوسفات العازلة المالحة دون الكالسيوم والمغنيسيوم (PBS; 1x). تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  2. إعداد 50 مل من الجليد البارد ة 1x محلول PBS تستكمل مع 750 ميكرولتر من الجلوكوز 45٪. تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
  3. ملء طبق بيتري 100 ملم مع 1x PBS لتنظيف الأدوات وثلاثة أطباق بيتري 60 ملم مع الجليد الباردة PBS-الجلوكوز لحصاد الأنسجة. وضع أطباق بتري على الجليد حتى تشريح.

4- تشريح الأجزاء

ملاحظة: يتم إجراء تشريح من الذكور والإناث الجراء الفئران Wistar في يوم ما بعد الولادة (P) 2.

  1. من أجل توفير بيئة معقمة، تأكد من تنظيف مقاعد البدلاء مع الإيثانول 100٪. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 100٪.
  2. رش بلطف رقبة الجرو مع الإيثانول 70٪.
  3. استخدام مقص جراحي كبير لقطع رأس الحيوان ووضع الرأس في طبق بيتري 100 ملم تحتوي على الجليد الباردة PBS-الجلوكوز.
  4. استخدام ملقط منحني للحفاظ على رأس الحيوان على مستوى العين. استخدام مقص جراحي صغير لإجراء شق صغير في قاعدة الجمجمة وقطع الجمجمة بعد خط وسط الدماغ.
  5. استخدام ملقط لتقشير بلطف قبالة جزأين من الجمجمة من خط الوسط.
  6. استخدم ملعقة جراحية صغيرة لإزالة الدماغ من تجويف الرأس. وضع الدماغ في طبق بيتري 60 ملم تحتوي على الجليد الباردة PBS-الجلوكوز على الجليد.
  7. عرض تحت steromicroscope، واستخدام ملقط غرامة لإزالة المخيخ، وجذع الدماغ والمصابيح الشمية من نصفي الكرة الأرضية الدماغي.
  8. استخدام ملقط غرامة لفصل نصفي الكرة الأرضية الدماغي اثنين. استخدام ملقط غرامة لتقشير قبالة meninges. ضع القشريات الدماغية في طبق 60 مم بتري على الثلج.
    ملاحظة: الجليد الباردة PBS أمر بالغ الأهمية لإزالة السحات الصحيح.

5. تفكك الأنسجة

ملاحظة: تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.

  1. استخدام مشرط حاد لتقطيع القشريات الدماغية ناعما. نقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب 50 مل تحتوي على إنزيم الهضم المتوسطة.
  2. احتضان لمدة 30 دقيقة في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  3. استخدام p1000 ميكروبيبت لإزالة بلطف المتوسطة هضم الانزيم مع التأكد من أن الأنسجة القشرية لا يزال في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل.
  4. استخدام p1000 micropipette لإضافة 1 مل من DMEM-10٪ FCS والمثلثات بلطف الأنسجة.
  5. استخدم فلتر 70 ميكرومتر ومكبس من حقنة 1 مل لتصفية الأنسجة القشرية في أنبوب 50 مل.
    ملاحظة: يمكن للمرء شطف الأنسجة المتبقية على جدار الأنبوب الداخلي عدة مرات مع DMEM-10٪ FCS.
  6. ملء أنبوب 50 مل مع DMEM-10٪ FCS. الطرد المركزي في 423 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. بعناية إزالة supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية مع 2 مل من DMEM-10٪ FCS.
  7. بلطف خلية خلية بيليه مع p1000 micropipette ثم مع ميكروبيبت p200. تمييع تعليق الخلية مع الحجم المناسب من DMEM-10٪ FCS.
    ملاحظة: عقلان = T150 = 5 مل من DMEM-10٪FCS.
  8. لوحة 5 مل من تعليق الخلية على T150 بكثافة 1 × 105 خلايا / سم2. أضف 20 مل من DMEM-10٪ FCS الدافئة لكل T150. احتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  9. تجديد نصف الوسط الثقافة بعد 6 أيام في المختبر (DIV) مع DMEM-10٪ FCS الدافئة.

6. تهتز التحضير

  1. أداء تهتز التحضير في اليوم قبل أن تهتز في غطاء تدفق اللامي تحت ظروف معقمة.
  2. تجديد نصف متوسط الثقافة عن طريق إضافة الثقافة الدافئة الطازجة المتوسطة في قارورة واحتضان في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.

7. تهتز

  1. معطف ثلاثة أطباق بيتري 100 ملم مع جزيرة الأمير إدوارد. تخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. تغطية غطاء القوارير مع فيلم البارافين ووضع القوارير في كيس من البلاستيك. القوارير يهز تحتوي على الخلايا الدبقية بين عشية وضحاها في 250 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم تنفيذ الهز الأول في 8 DIV ويمكن للمرء أن يؤدي ما يصل إلى ثلاثة اهتزازات مختلفة (انظر الشكل 1 للتوقيت).

8. OL الخلايا النسب الحصاد والثقافة

ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.

  1. في اليوم التالي للاهتزاز، إعداد Bottenstein-Sato (BS) المتوسطة وفقا للجدول 1.
  2. شطف أطباق بيتري المغلفة 3 مرات مع الماء المقطر المعقم.
  3. حصاد قوارير 'supernatant تحتوي أساسا على خلايا النسب OL ولكن أيضا بعض الخلايا microglial ولوحة على أطباق بيتري غير المغلفة 100 ملم.
    ملاحظة: تسمح هذه الخطوة بإزالة الخلايا المجهرية من خلال التصاق سريع تفاضلي على سطح الطبق.
  4. احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  5. املأ كل قارورة T150 بـ 25 مل من وسط الثقافة الدافئة الطازجة واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5% من ثاني أكسيد الكربونحتى الهزة الثانية.
  6. نقل supernatant من أطباق بيتري إلى أطباق جديدة غير مغلفة 100 ملم بيتري للسماح التصاق الخلايا الدقيقة المتبقية.
  7. احتضان أطباق بيتري لمدة 15 دقيقة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  8. قم بإزالة الـ supernatant ، الذي يحتوي على خلايا نسب OL غير ملتصقة ، ونقلها إلى أنابيب 50 مل (supernatant من 2 أطباق بيتري لأنبوب 50 مل). تجاهل أطباق بيتري مطلية بالميكروجليا.
  9. الطرد المركزي supernatant لمدة 5 دقيقة في 423 × ز. إزالة بعناية supernatant وresuspend بيليه الخلية مع 1 مل من وسط BS. تجمع جميع الكريات في أنبوب مشترك 50 مل وضبط مستوى الصوت إلى 10 مل مع متوسط BS.
  10. تحديد كثافة الخلايا عد الخلايا تحت المجهر.
    ملاحظة: يجب الحصول على كثافة خلية بين 3 × 105/ مل و 5 × 105/ مل.
  11. أضف 20 مل من BS إذا كانت كثافة الخلايا أعلى من أو تساوي 4 × 105/mL للحصول على حجم نهائي قدره 30 مل، أو إضافة 10 مل فقط من BS إذا كانت كثافة الخلية أقل من 4 × 105/mL للحصول على حجم نهائي قدره 20 مل.
  12. لوحة اثنين أو ثلاثة أطباق بيتري مغلفة مسبقا 100 ملم مع 10 مل من تعليق الخلية. احتضان في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  13. إزالة الحطام من أطباق بيتري عن طريق منعش كل من BS المتوسطة 2 ساعة في وقت لاحق.
    ملاحظة: فحص الثقافة تحت المجهر قبل وبعد التطهير للتحقق من كثافة الخلايا وكفاءة إزالة الحطام.
  14. احتضان لمدة 2 أيام في وسط BS في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
    ملاحظة: فحص الثقافة تحت المجهر. يجب أن يكون التقاء 70٪ إلى 80٪.

9. OCM الإنتاج

ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوات في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة.

  1. إعداد NB-B27low المتوسطة وفقا للجدول 2.
  2. تجديد الثقافة المتوسطة مع 10 مل من المتوسط NB-B27low الدافئة. احتضان لمدة 2 أيام في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  3. حصاد OCM، أي، supernatant التي تحتوي على OL تفرز العوامل. تصفية تعقيم OCM باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
    ملاحظة: تخزين OCM في 4 °C لمدة أقصاها 2 أشهر.

10. OCM إضافة

ملاحظة: ينبغي أن يتم تنفيذ الخطوات في غطاء تدفق التصفيق في ظل ظروف معقمة. OCM يمكن أن تضاف إلى الثقافات العصبية فرس النهر المنقى أعدت وفقا للبروتوكول التالي14,وحصلت عليها عن طريق إضافة, 24 ساعة بعد العزلة, وكلاء مضادة للmitotic uridine و 5- فلوروديوكسيوريدين (5 ميكرومتر) لمدة 36 ساعة.

  1. في 3 DIV, إزالة جميع الخلايا العصبية الثقافة المتوسطة التي تحتوي على العوامل المضادة للmitotic وإضافة 500 ميكرولتر من OCM دافئة جديدة.
  2. تجديد نصف المتوسطة كل 3 أيام مع الطازجة المصنوعة من قبل NB-B27.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على هذه الثقافات حتى 21 DIV.

11. إضافة OL إلى ثقافة الخلايا العصبية فرس النهر المنقى

ملاحظة: تنفيذ الخطوات التالية في غطاء تدفق لامينار تحت ظروف معقمة. يمكن إضافة OLs إلى ثقافات فرس النهر المنقى التي تم الحصول عليها بنفس الطريقة الموضحة أعلاه.

  1. إعداد وسيط الثقافة المشتركة وفقا للجدول 3.
  2. استرداد ثقافة OL في 70٪ إلى 80٪ التقاء. شطف مع 2 مل من 1x مقسم تلفزيوني دافئ.
  3. لفصل الخلايا، إضافة 2 مل من 0.25٪ التربسين إلى طبق بيتري 100 ملم.
  4. احتضان لمدة 5 دقيقة في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
  5. إضافة 2 مل من DMEM-10٪ FCS لمنع رد الفعل الأنزيمي. حصاد supernatant التي تحتوي على خلايا النسب OL.
  6. الطرد المركزي في 423 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. إزالة بعناية supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في الثقافة المشتركة الدافئة المتوسطة للحصول على تركيز 1.25 × 105 خلايا / مل.
  7. إضافة OL إلى الخلايا العصبية منقى فرس النهر الثقافة عن طريق إزالة 200 ميكرولتر من الخلايا العصبية ثقافة المتوسطة وإضافة 200 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر (2.5 × 104 خلايا / جيدا) من لوحة 24 جيدا.
  8. تحديث نصف المتوسطة الثقافة المشتركة كل 2-3 أيام.
    ملاحظة: يمكن الحفاظ على الثقافات المشتركة حتى 24 DIV.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول ، يتم تنقية خلايا النسب OL من الثقافات الدبقية عن طريق التخلص من الخلايا الفلكية وmicroglia. يمكن تقييم النقاء والفحص الفينوتيبيك لثقافات OL عن طريق تلطيخ المناعة مع علامات الدبقية15. وأشار تحليل التعبير عن علامات مختلفة إلى أن ثقافات OL كانت في الغالب قبل OLs مع 90٪ ± 4٪ من O4+ الخلايا، 85٪ ± 7٪ NG2+ الخلايا، و 4.7٪ ± 2.1٪ من PLP+ الخلايا، في حين أن 7.2٪ ± 2.5٪ من الخلايا كانت GFAP+ الخلايا الفلكية (متو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولًا مفصلًا للحصول على ثقافات خلية النسب oligodendroglial عالية التخصيب من الثقافات الدبقية المختلطة ، المقتبسة من طريقة نشرت سابقًا16، والإنتاج اللاحق للوسط المكيف OL. هذه التقنية اهتزاز ليست مكلفة، ويمكن أن تتكرر ثلاث مرات، وهو الأمثل للحصول على كمية عالية من OLs المنقى، والخلايا المستزرعة في بوتينشتاين-Sato (BS) المتوسطة التي تحتوي على PDGFα تتكاثر. يتم إعداد الخلايا الدبقية باستخدام القشريات الدماغية للفئران Wistar في P2 ، وهي نقطة زمنية تكون فيها الغالبية العظمى من خلايا النس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ولا يملك أي من أصحاب البلاغ مصالح متنافسة أو مصالح متضاربة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويود المؤلفون أن يشكروا ريمي رونزانو على نصيحته الحكيمة في تحرير المخطوطات. تم تمويل هذا العمل من قبل ICM ، INSERM ، منحة مؤسسة ARSEP إلى NSF ، وسعر Bouvet-Labruyère.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
5-فلوروديوكسيوريدينسيجماF0503
B27 مكملغذائي ThermoFisher17504044
D- (+) - محلول الجلوكوزSigmaG8769
DNase (Deoxyribonuclease I)ورثينجتونLS002139
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
الإيثانول 100٪ سيجما32221-M
الإيثانول 70٪VWR للكيماويات83801.360
مصل ربلة الساق الجنينيةThermoFisher10082147
L-cysteineSigmaC7352
NeurobasalThermoFisher21103049
PapainWorthingtonLS003126
البنسلين الستربتومايسينThermoFisher15140122
فوسفات محلول ملحي مخزن بدون كالسيوم ومغنيسيومThermoFisherA1285601
بولي إيثيلينيمين (PEI)سيجماP3143
رباعي ديكاهيدراتسيجماB9876
التربسينسيجماسيجما
أوريدينسيجماU3750
<قوي> بوتنشتاين ساتو (بكالوريوس) وسائل الإعلام< / strong>
apo-Transferrin البشريSigmaT1147
BSA (ألبومين مصل الأبقار)SigmaA4161
Dulbecco's Modified EagleMedium ThermoFisher31966021
الأنسولينSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
البنسلين الستربتومايسينThermoFisher15140122
البروجسترونسيجماP8783
بوتريسين ثنائي هيدروكلوريدسيجماP5780
سيلينيت الصوديومسيجماS5261
T3 (3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم)SigmaT6397
T4 ( L-Thyroxine)SigmaT1775
<قوي > وسائط الزراعة المشتركة< / قوي >
apo-Transferrin HumanSigmaT1147
B27مكمل ThermoFisher17504044
البيوتينسيجماB4639
BSA (ألبومين مصل الأبقار)سيجماA4161
سيرولوبلازماسيجما239799
Dulbecco's Modified EagleMedium ThermoFisher31966021
HydrocortisoneSigmaH4001
الأنسولينSigmaI5500
N-Acetyl-L-cysteineSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
البنسلين الستربتومايسينThermoFisher15140122
البروجسترونسيجماP8783
بوتريسينسيجماP5780
المؤتلف البشري CNTFSigma450-13
سيلينيت الصوديومSigmaS5261
T3 (3،3 '، 5-Triiodo-L-thyronine ملح الصوديوم)SigmaT6397
فيتامين ب 12سيجماV6629
<قوي > أدوات < / قوي >
0.22 & مرشح mSartorius514-7010
1 مل حقنةTerumo1611127
100 مم طبق بتريDutscher193100
أنبوب 15 ملCorning Life Science734-1867
50 مل أنبوبCorning Life Science734-1869
60 مم طبق بتريDutscher067003
70 & الصغيره; مرشح mMiltenyi Biotec130-095-823
مجهرأوليمبوسSZX7
ملقط منحنيأدوات العلوم الدقيقة11152-10
ملقط دقيقأدوات العلوم الدقيقة91150-20
مقص جراحي كبيرأدوات العلوم الدقيقة14008-14
مشرطسوان مورتون233-5528
شاكرإنفورز HT
مقص جراحي صغيرأدوات العلوم الدقيقة91460-11
ملعقة جراحية صغيرةبار ناور المحدودةBN2706
T150 سم 2< / sup> قارورة مع غطاء مرشحDutscher190151
Animal< / strong>
P2 Wistar الجرذJanvierRjHAn: WI
مجهر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
  2. Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
  3. Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
  4. Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
  5. Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
  6. Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
  7. Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  8. Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
  9. Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).
  10. Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
  11. Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).
  12. Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222(2015).
  13. Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
  14. Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
  15. Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
  16. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  17. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
  18. Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).
  19. Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
  20. Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
  21. Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
  22. Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
  23. Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573(2019).
  24. Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
  25. Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
  26. Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
  27. Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Bottenstein Sato O4 NG2

مقالات ذات صلة